CN101822729B - 用于治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征的药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征的药物及其制备方法。该用于治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征的药物，它的药效组分是由按以下重量配比的原料制成的：红参1-90g、炙附子1-90g、炙甘草1-90g、桂枝1-90g、田三七1-90g、茯苓1-90g。本发明药物在改善临床症状上明显优于阿托品，能够改善患者心功能，提高患者生活质量；在提高心率和Holter、心电图等疗效指标、改善心脏超声心功能指标中EF、CO值和心电图ST段等方面优于阿托品；研究过程中治疗组未出现明显不良影响，临床上安全有效。因此，本发明药物在治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征领域中具有巨大的推广应用价值。

Description

用于治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征的药物

技术领域

本发明涉及用于治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征的药物及其制备方法。

背景技术

病态窦房结综合征(简称病窦综合征，Sick Sinus Sydrome，SSS)属缓慢性心律失常范畴，是中老年常见病、难治性疾病，其发病率无性别差异，发病年龄20-90岁均有，平均65-70岁，随着年龄的增加呈上升趋势，超过50岁后发病率在0.17％左右。1年存活率85％-92％，5年存活率62％-65％，栓塞发生率为15％，严重威胁人民健康。常见病因为冠心病、高血压病、心肌炎、心肌病等，不明原因者占37％。1984年中国卫生统计提要报道，我国心血管疾病死亡占总死亡的百分比由1957年的12.1％上升到43.8％，急诊救护队报道，院外心脏猝死患者中15％-25％为缓慢性心律失常引起。

目前，西医对缓慢性心律失常病态窦房结综合征的治疗方面尚无特效药物，主要治疗方法是安装永久心脏起搏器，但起搏器价格昂贵、使用寿命短、仅7～10年，且此方法属有创治疗，存在着感染、导丝断裂、心肌穿孔、心律失常、起搏器综合征、对自主神经的调节缺乏反应及电池能量耗竭导致更换起搏器等缺陷，还存在引起心理障碍等问题，对于儿童和青壮年患者尤为明显；此外尚有部分病人不适用于起搏器的安装，如严重糖尿病、消瘦、血管畸形以及无经济能力等，因此起搏器治疗目前尚难以普及。

中医根据缓慢性心律失常脉症表现，将其归于“心悸”、“怔忡”、“迟脉”、“胸痹”等病证范畴。认为其病因病机多因脏腑虚衰，复感六淫外邪，或加之七情所伤、饮食劳倦等，日久发展而成，本病病位以心、肾为主，兼涉脾、肝二脏，病性属本虚标实之证，标实指寒凝、瘀血、痰饮或兼夹为患，本虚初期多气虚或气阴两虚，后期则逐渐转至阳虚寒凝，或痰浊阻脉，或血脉瘀阻，血行不畅而致迟脉证。此外不少学者发现肝失条达与本病的发生发展有一定关系。中医治疗缓慢性心律失常大多本着辨证求因、审因论治的原则决定治法和方药的应用，临床上麻黄附子细辛汤、参附汤、生脉散、阳和汤、炙甘草汤等较为常用，但目前多数医家在治疗上以温阳益气补益为主，在认识该病病机特点时，未能足够重视久病体虚、易受邪气侵犯而使邪实阻滞、壅塞不通，导致阳气郁内不通的特点。同时，由于中药复方制剂研究难度大，该方面系统研究的报道甚微，至今还没有治疗该病的有效复方中成药。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征的药物。

本发明所提供的用于治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征的药物，它的药效组分是由以下质量份数比的原料制成的：红参∶炙附子∶炙甘草∶桂枝∶田三七∶茯苓＝1-90∶1-90∶1-90∶1-90∶1-90∶1-90。

其中，所述红参、所述炙附子、所述炙甘草、所述桂枝、所述田三七和所述茯苓的质量份数比可为4-12∶2-10∶5-13∶2-10∶2-10∶6-14，具体可以为8∶6∶9∶6∶6∶10。在该具体配比的基础上，其中各种组分的具体用量可以根据患者的实际情况，在所给出的最低和最高剂量范围内进行合理调整。

所述药物是按照包括如下步骤的方法制备得到的：用提取剂提取红参，收集红参提取液和红参残渣；用水煎煮所述炙附子，然后向其中加入所述红参残渣、所述炙甘草、所述桂枝和所述茯苓继续煎煮，得到煎液；将煎液与所述红参提取液合并，再加入所述田三七的粉末，混匀。

其中，所述提取红参的方法为回流提取；提取2-3次，温度为70-90℃；所述提取剂优选为乙醇溶液。

上述药物具体为颗粒剂型的。

本发明的另一个目的是提供一种制备用于治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征的药物的方法。

本发明所提供的制备用于治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征的药物的方法，可以包括如下步骤：用提取剂提取红参，收集红参提取液和红参残渣；用水煎煮所述炙附子，然后向其中加入所述红参残渣、所述炙甘草、所述桂枝和所述茯苓继续煎煮，得到煎液；将煎液与所述红参提取液合并，再加入所述田三七的粉末，混匀。

所述方法中，在加入所述田三七的粉末的同时或之后，还可包括加入糊精的步骤。

其中，所述红参、所述炙附子、所述炙甘草、所述桂枝、所述田三七和所述茯苓的质量配比可为1-90∶1-90∶1-90∶1-90∶1-90∶1-90，具体可为4-12∶2-10∶5-13∶2-10∶2-10∶6-14，最佳的为8∶6∶9∶6∶6∶10。

本发明的最后一个目的是提供一种散剂型的用于治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征的药物。

本发明所提供的用于治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征的药物，它的药效组分由红参、炙附子、炙甘草、桂枝、田三七和茯苓组成，其质量配比为1-90∶1-90∶1-90∶1-90∶1-90∶1-90。

所述红参、所述炙附子、所述炙甘草、所述桂枝、所述田三七和所述茯苓的质量配比可为4-12∶2-10∶5-13∶2-10∶2-10∶6-14，最佳为8∶6∶9∶6∶6∶10。在该具体配比的基础上，其中各种组分的具体用量可以根据患者的实际情况，在所给出的最低和最高剂量范围内进行合理调整。

本发明药物以颗粒剂、膏剂、乳剂、散剂、滴丸、口服液、胶囊等药物剂型为保护形式，其中，颗粒剂目前为优选的剂型。颗粒剂药物的一个疗程为4周，每天二次，早晚各一次，每次服用9克(儿童减半)。本发明药物对患者无年龄要求，但孕妇禁忌服用。

本发明药物红参、附子为君药。红参性温，大补元气，益血，养心安神。《神农本草经》“补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸”。附子辛热，其性走而不守，能通行十二经，温经散寒，助阳通脉，适用于心肾阳虚，心悸气短等阳虚诸症。参、附两药合用，有益气温阳复脉之功，故为君药。

炙甘草味甘、性平，具有益气温阳，复脉止悸作用，与附子、红参、桂枝相伍，辛甘化阳，增加补益心阳之功，主治心气虚弱、心阳不振所致的心动悸，脉结代。炙甘草与红参相伍，益心气，以资气血生化之源；炙甘草与附子相配，益气温中，解附子之毒，缓附子辛热之性，以防伤阴。桂枝，辛、甘、温，入心助阳，逐寒痹，通阳复脉，用于阳气不通之心悸等症，故为臣药。

田三七、茯苓为佐使药。田三七为五加科人参属植物，味甘微苦，性温，专走血分，善行瘀血，具有利气养血活血作用。茯苓甘淡、性平，归心、脾、肾经，益心脾而宁心安神。田三七茯苓相配，养血宁心安神之效更佳。茯苓桂枝相伍，一利一温，共奏通阳复脉之功。

本方诸药合用，共奏通阳复脉，益气活血之功，使阳气充而血脉通，气血充足，心脉得以濡养，悸定脉复，通阳复脉，益气活血，适用于阳虚血瘀为主要特征的缓慢性心律失常病态窦房结综合征等。

红参能调节神经、心血管及内分泌系统，促进机体物质代谢及蛋白质和RNA、DNA的合成，能益心复脉，低浓度时能提高心脏收缩力，具有与强心甙极其相似的强心作用，心率加速，有缓解小动脉痉挛，扩张冠状动脉，改善心肌供血的作用；附子强心，兴奋肾上腺素受体，并缩短A-H间期改善房室传导，提高心律，消除异位搏动，扩张冠状动脉，抗心肌缺血缺氧；甘草中类黄酮与异甘草素对乌头碱致动物心律失常作用有明显拮抗效果，甘草中的甘草次酸能与附子中的生物碱形成复盐，在体内逐渐分解而起作用，避免机体因短时间内吸收过量生物碱而引起的强烈反应，增加附子的临床用药安全范围；田三七有明显扩张冠状动脉，增加冠脉血流量，降低全血粘度，降低心肌耗氧量，抗心律失常等多种药理作用；茯苓含有茯苓聚糖、茯苓酸等，具有镇静作用；桂枝能扩张血管，增强血液循环等活血化瘀作用。

基础实验研究的各检测指标统计结果表明：本发明药物能缩短AA间期、提高心率，增强窦房结自律性，改善窦房结传导功能，减少兔右冠状动脉缺血再灌注损伤所致的心律失常发生，其作用机制与抑制窦房结细胞凋亡，调节凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Fas-L蛋白表达，降低模拟缺血再灌注诱导的窦房结细胞内钙超载有关。

药理学实验结果也表明，本发明药物具有提高小鼠耐常压缺氧的能力；能改善低切变率下的全血粘度、红细胞聚集指数及纤维蛋白原含量等血液流变学指标；能提高异搏定致缓慢性心律失常动物模型的心率；能改善甲醛致家兔窦房结急性损伤模型的窦房结功能和心电图缺血性ST段改变。

临床研究的各方面疗效统计指标表明，本发明药物在改善临床症状上明显优于阿托品，能够改善患者心功能，提高患者生活质量；在提高心率和Holter、心电图等疗效指标、改善心脏超声心功能指标中EF、CO值和心电图ST段等方面优于阿托品；研究过程中治疗组未出现明显不良影响，临床上安全有效。另外，本发明方法为每个病人每年至少减少医疗费用1万元以上，而且还没有西医疗法的诸多缺陷，因此，本发明药物在治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征领域中具有巨大的推广应用价值。

附图说明

图1为动物体内实验中原位末端转移酶标记法检测细胞凋亡情况。

图2为Fas-L蛋白表达情况(免疫组化二步法，×400)。

图3为Bax蛋白表达情况(免疫组化二步法，×400)。

图4为Bcl-2蛋白表达情况(免疫组化二步法，×400)。

图5为体外培养的窦房结细胞的形态(苏木精-伊红染色，10×20)。

图6为体外细胞实验中原位末端转移酶标记法检测细胞凋亡情况(TUNEL×100)。

图7为流式细胞术检测窦房结细胞凋亡情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

红参、炙附子、炙甘草、桂枝、田三七、茯苓均购自北京本草方圆药业有限公司。

实施例1、用于治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征药物(强心复脉颗粒)的制备

一、本实施例制备了颗粒剂和散剂两种剂型的药物，每种剂型中各原料的质量配比分别如下：

1、药物I：红参4g、炙附子2g、炙甘草5g、桂枝2g、田三七2g、茯苓6g。

2、药物II：红参8g、炙附子6g、炙甘草9g、桂枝6g、田三七6g、茯苓10g。

3、药物III：红参12g、炙附子10g、炙甘草13g、桂枝10g、田三七10g、茯苓14g。

二、药物的制备方法

(一)颗粒剂的制备方法

取红参352g、炙附子264g、炙甘草396g、桂枝264g、田三七264g、茯苓440g。

将田三七粉碎成细粉，⁶⁰Co辐射灭菌备用；

取红参352g，将其以1∶5(红参：75％乙醇)的重量份数比与75％乙醇(乙醇∶水＝3∶1，体积比)混合，在80℃条件下回流提取2h，抽滤，收集第一次回流提取液1和滤渣1；将得到的所有滤渣1与75％乙醇混合，75％乙醇的量与第一次相同，在80℃条件下回流提取2h，收集第二次回流提取液2和滤渣2，并将提取液2与提取液1合并；将得到的所有滤渣2与75％乙醇混合，75％乙醇的量与第一次相同，80℃回流提取2h，抽滤，收集第三次回流提取液3；将提取液1、提取液2和提取液3合并，获得红参提取液，红参残渣备用。

炙附子加8倍量水，煎煮2小时，再向其中加入红参残渣及炙甘草、桂枝、茯苓，煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，过滤，滤液与上述红参提取液合并，浓缩至相对密度为1.30(55-60℃)的稠膏，干燥粉碎，加入干膏粉2倍量糊精、田三七细粉，混匀，制粒、干燥，共制成颗粒1000g，分装即得。

(二)散剂的制备方法

将各原料按相应的质量份数比混合，得散剂。

三、药物的使用方法

颗粒剂：用温水冲服，每次服用9克(儿童减半)。

散剂：取一副药，包好后，加水浸泡50-60分钟，用武火(大火)煎开锅后用文火(小火)煎30分钟左右滤出药液，取药液服用，温服。

实施例2、通过基础研究检测本发明药物的效果

本实施例中是分别对颗粒剂型的药物I、药物II、药物III均进行了以下各实验。

数据结果均采用SPSS软件统计处理，两样本均数比较用t检验，多样本资料采用完全随机方差分析，多组间均数比较用LSD组间多重比较，计数资料采用x2检验。

一、体内动物实验：

成年大耳白家兔，一级，雌雄不拘，12周龄，体重2.2-3.0kg(购自北京富豪实验动物养殖中心，许可证编号：SCXK(京)2005-2009)，随机分成5组，每组8只，具体如下：

正常对照组：生理盐水10ml/kg，不造模，丝线仅穿过右冠状动脉根部下方旷置而不结扎；

模型对照组：生理盐水10ml/kg，造模不给药；

阿托品给药组：按0.36mg/kg剂量给药(相当于临床剂量的12倍)；

强心复脉高剂量组：按6.66g/kg剂量给药(相当于临床剂量的12倍)；

强心复脉低剂量组：按3.33g/kg剂量给药(相当于临床剂量的6倍)。

以上各组均采用造模前每日灌胃一次，10ml/次，连续灌胃3天，实验当日于造模稳定10min后由十二指肠给药一次5ml。

动物模型参照王庆志等兔缺血-再灌注病窦模型制作方法(王庆志等.窦房结和房室结缺血再灌注动物模型的建立和确认[J].中国临床解剖学杂志，2004，22(5)；552-554.)。具体如下：取健康成年大耳白家兔，用1.5％戊巴比妥钠(2mL/kg)静脉注射麻醉后固定于兔台上，胸前剪毛，消毒。分离气管，放置气管插管，接动物呼吸机。腹部皮肤切开，找出十二指肠并在其表面打一荷包结备给药用。胸骨正中止血钳断第2～3肋骨，并用拉钩牵拉，保持双侧胸膜完整。暴露心脏，纵向剪开心包后行心包吊床术，暴露右冠状动脉。紧贴右冠状动脉第一分支前起始部下方套一丝线，丝线穿过一细塑料管，抽紧后以纹氏钳夹闭右冠状动脉根部以造成窦房结动脉的急性闭塞。以出现明显窦缓(AA间期即两心房间期延长40ms以上)及(或)结性逸搏心律为窦房结动脉急性闭塞致窦房结损伤为标准。缺血60min后松钳再灌注60min。保持适宜室温，兔均予肝素抗凝。用注射针头刺入兔四肢皮下记录动物体表标II导心电图，以上信号输入BL-420E生物机能实验系统并显示于计算机显示器，行全程心电监护。

用多道生理记录仪记录强心复脉对窦房结组织电生理功能的影响(包括自律性指标AA间期、心率、SNRT和传导性指标SACT)，倒置显微镜观察组织细胞病理变化，TUNEL法和免疫组化的方法测定细胞凋亡和凋亡相关基因Fas-L，Bax，Bcl-2蛋白表达。

部分指标的检测结果如下：

(1)两心房间期(AA间期)、心率变化比较：

结果如表1和表2所示。与模型对照组比较，强心复脉高、低剂量组以及阿托品组在缺血再灌注各时相点均可明显缩短AA间期(P＜0.01或P＜0.05)，明显提高心率(P＜0.01或P＜0.05)，且强心复脉高剂量组较阿托品组效果显著。说明强心复脉能缩短AA间期、提高心率，且效果优于阿托品。

表1、缺血再灌注期不同时段AA间期的变化(ms，n＝8，x±s)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01.

表2、缺血再灌注期不同时段心率的变化(ms，n＝8，x±s)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01.

(2)窦房结传导时间(SACT)变化比较：

结果如表3所示。与模型对照组比较，强心复脉高、低剂量组以及阿托品组各时间点SACT值均有不同程度缩短(P＜0.01或P＜0.05)，且强心复脉高、低剂量组均较阿托品组效果显著。说明通阳活血中药强心复脉能增强窦房结传导功能，且效果优于阿托品。

表3各组动物缺血再灌注不同时间点SACT变化(ms，n＝8，x±s)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与阿托品组比较，▲P＜0.05.

(3)窦房结恢复时间(SNRT)比较：

结果如表4-6所示。与模型对照组比较，强心复脉高、低剂量组以及阿托品组各时间点SNRT、CSNRT和ISNRT值均有不同程度下降(P＜0.01或P＜0.05)。强心复脉高剂量组SNRT的下降较阿托品组效果显著。说明强心复脉能改善窦房结自律性，且效果优于阿托品。

表4各组动物缺血再灌注不同时间点SNRT变化(ms，n＝8，x±s)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01.

表5各组动物缺血再灌注不同时间点CSNRT变化(ms，n＝8，x±s)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01.

表6各组动物缺血再灌注不同时间点ISNRT变化(ms，n＝8，x±s)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01.

(4)心律失常评分变化比较：

结果如表7所示。相同缺血时段心律失常评分，强心复脉高、低剂量组均低于模型组(P＜0.01或P＜0.05)，两组疗效无明显剂量相关性，两组各有1例由交界性逸搏心律转为窦性心律，其余窦性心律不齐于缺血10min后恢复正常，无1例死亡。两组于再灌注期60min后心律失常评分基本恢复，只有1例出现I度AVB，约1min后恢复正常。强心复脉高剂量组于再灌注15-30min和30-60min时段较阿托品组效果显著(P＜0.05)。说明强心复脉能有效减少兔右冠状动脉缺血再灌注损伤所致的心律失常，且较阿托品组效果显著。

表7缺血再灌注期不同时段心律失常的评分变化(x±s，n＝8)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，与阿托品组比较，▲P＜0.05.

(5)光镜观察窦房结组织形态学比较：

造模后模型组的起搏细胞(P细胞)边界不清，胞核染色加深，胞浆嗜酸性增强，伊红染色松散，部分细胞肿胀明显，部分胞质可见空泡及散在的细胞核固缩；阿托品组P细胞未见明显肿胀，胞质见极少空泡及散在的细胞核固缩；强心复脉高、低剂量组的P细胞亦未见明显肿胀，胞质见极少空泡及散在的细胞核固缩，未见粒细胞浸润，其余结构正常。说明强心复脉和阿托品均能保护兔右冠状动脉缺血再灌注诱导的窦房结细胞受损。

(6)原位末端转移酶标记(TUNEL法)检测细胞凋亡率比较：

结果如表8和图1所示(A为模型对照组(TUNEL，×400)，B为强心复脉高剂组(TUNEL，×400))。

在体兔右冠状动脉根部结扎/放松造成兔窦房结缺血再灌注损伤，可明显引起窦房结细胞凋亡，此现象与光镜下观察结果一致。强心复脉高、低剂量组及阿托品组兔窦房结细胞凋亡发生率明显减少，与模型组比较，差异有显著性(P＜0.01)。与阿托品组比较，强心复脉治疗组凋亡率降低差异无统计学意义。说明强心复脉、阿托品均能阻断或抑制凋亡，强心复脉可能有类似阿托品样作用。

表8各组兔窦房结细胞凋亡情况(n＝10，x±s)，

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01。

(7)免疫组化法测定凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Fas-L蛋白表达比较：结果如表9(表中，AOD值表示细胞凋亡发生率)、10和图2(A为模型对照组Fas-L蛋白表达，B为强心复脉高剂组Fas-L蛋白表达)、图3(A为模型对照组Bax蛋白表达，B为强心复脉高剂组Bax蛋白表达)、图4(A模型对照组Bcl-2蛋白表达，B为强心复脉高剂组Bcl-2蛋白表达)所示。

兔右冠状动脉根部结扎/放松所致兔窦房结缺血再灌注损伤，可显著引发Fas-L基因蛋白表达增强。强心复脉治疗组及阿托品组Fas-L蛋白表达均下降，且强心复脉高、低剂量组下降较阿托品组明显。兔窦房结缺血再灌注损伤，在显著引发Fas-L基因蛋白表达增强的同时，亦引发Bax、Bcl-2基因蛋白表达增强，但Bcl-2基因蛋白表达即免疫反应增强的程度轻于Bax基因。通过计算Bcl-2/Bax比值，发现模型对照组Bcl-2/Bax比值下降，与正常组比较，差异有显著性(P＜0.01)。强心复脉治疗组能够显著下调Bax基因的蛋白表达，上调Bcl-2基因的蛋白表达，从而显著上调Bcl-2/Bax比值，其中尤以强心复脉高剂量组更为显著，与模型组比较，差异有显著性(P＜0.01)。阿托品组也有同强心复脉组相似的趋势，但仅Bax表达值与模型组比较差异有显著性(P＜0.05)，Bcl-2表达值以及Bcl-2/Bax比值与模型组比较，差异无显著性。说明强心复脉调节Fas-L、Bax、Bcl-2、Bcl-2/Bax比值的效果优于阿托品组。表明通过调节缺血再灌注窦房结Bax、Bcl-2、Fas-L基因的蛋白表达从而抑制和阻断细胞凋亡发生，可能是中药复方强心复脉防治病窦综合征缺血再灌注损伤的分子作用机制之一。

表9兔窦房结Fas-L基因蛋白表达情况比较(n＝10，x±s)

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01，△△P＜0.01。

表10兔窦房结Bax、Bcl-2基因蛋白表达情况比较(n＝10，x±s)

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，与阿托品组比较，▲P＜0.05。

药物I、药物II、药物III得到了相同的实验效果。

二、窦房结细胞体外实验

体外细胞实验中，通过体外培养窦房结细胞，倒置显微镜观察模拟缺血-再灌注引起窦房结细胞形态结构损伤，TUNEL法和流式细胞术AV-PI染色分别定性和定量检测窦房结细胞凋亡，Fluo-4荧光探针检测窦房结细胞钙离子浓度变化。

1、分离得到窦房结细胞的方法：

参照Marvin等乳鼠窦房结细胞的原代培养与鉴定(Marvin WJ，Jane K.Theisolated sinoatrial node cell in primary culture from the newbornrat[J].Circ Res，1984，55(2)；253-260.)。取出生24hWistar乳鼠20只，将乳鼠呈仰卧位固定，消毒胸腹部皮肤，沿胸骨右缘剪开并去除胸前壁，暴露心脏，置于解剖显微镜下分离心包膜，将心脏向右下方轻轻牵拉，轻拨移右心耳，于界嵴中部静脉窦侧、前腔静脉根部取0.7mm×0.7mm×0.7mm的组织块。

剪碎组织块成0.5～1mm³碎块，在组织块中加入0.08％胰酶，37℃水浴5分钟，吹打1分钟，自然沉淀，弃上清液；加入0.025％胶原酶，置于37水浴中振荡15分钟。再吹打1～2min，自然沉淀，吸取上清液，用400目金属滤网过滤后移入50mL离心管，离心管中加等体积DMEM培养液(含15％胎牛血清)，重复消化5次至组织块基本消化成单细胞为止。

细胞悬液离心，弃上清液，再用DMEM培养液洗细胞一次，离心，弃上清液。

加入DMEM培养液(含15％胎牛血清)，打散细胞团为单细胞悬液。调整细胞数为1×10⁵个/毫升，将单细胞悬液接种于培养板中，台盼蓝检测活细胞率达95％以上。

将培养容器置于37℃、5％CO₂孵箱中培养90分钟后，采用差速贴壁分离技术，得到纯化的窦房结细胞。通过窦房结细胞的形态和搏动频率来鉴定细胞，窦房结细胞有3种形态，即梭形、三角形与不规则形，其中梭形细胞最多，且以梭形细胞搏动频率最快(168±8/min)。

每天换液一次，并用倒置显微镜观察，连续5天。

细胞存活率计算方法：计算计数板4个大格内未蓝染活细胞及细胞总数，则细胞存活率(％)＝活细胞数/细胞总数×100％。细胞计数法：取1滴台盼蓝液与9滴细胞悬液混匀后，再取适量混合液滴于细胞计数板上，计数4个大格的细胞数，再用下述公式求出细胞数：细胞数(个/ml)＝(4个大格数/4)×10⁴×2。

2、获得含药物血清的方法

成年雄性Wistar大鼠40只，分成4组，正常对照组，阿托品组，强心复脉高剂组，强心复脉低剂组，每组10只，连续灌胃7天，日2次，所用药物分别以人临床用量×动物等效剂量比值为参考浓度(强心复脉2.22g、8.88g生药/10ml/kg、阿托品0.006mg/10ml/kg)，用蒸馏水配制成混悬液，正常对照组给予等量正常饮用水。末次给药前禁食不禁水12h，末次给药后2小时，断头取血，2000转/分离心10分钟，自然分离血清，56℃灭活30min，0.22um微孔滤膜过滤除菌，所得血清分别为空白血清、强心复脉高、低剂量药物血清和阿托品药物血清，-80℃冷藏备用。

4、模拟缺血-再灌注的方法

参考钟理、Koyama等原代培养乳鼠窦房结细胞模拟缺血-再灌注模型制备的方法并加以改进，以缺氧缺糖模拟缺血，以恢复氧和糖供应模拟再灌注。具体步骤如下：

a.窦房结细胞消化分离后接种到预先置有消毒盖玻片的24孔板上，进行窦房结细胞培养。5d后倒置显微镜下随机计数100个细胞，选取梭形细胞占所有细胞60％以上的培养细胞进行实验。

b.用预先N₂饱和的模拟缺血液置换旧培养基，置密闭盒中持续通以30倍体积约10L的95％N₂+5％CO₂混合气，充分排尽盒中残余的氧气，以缺氧缺糖模拟缺血，放入CO₂培养箱中培养60min。N₂饱和的模拟缺血液的组成为(mmol/L)：NaCl 98.5、KCl 10、NaH₂PO₄ 0.9、NaHCO₃ 6.0、CaCl₂ 1.8、MgSO₄ 1.2、乳酸钠40、HEPES 20，PH 6.8。

c.模拟再灌注：从密闭盒中取出换成模拟再灌注液，以恢复氧和糖供应模拟再灌注放回5％CO2孵箱中培养3h。模拟再灌注液的组成为(mmol/L)：NaCl 129.5、KCl 5.0、NaH₂PO₄ 0.9、NaHCO₃ 20、CaCl₂ 1.8、MgSO₄ 1.2、葡萄糖55、HEPES 20，PH 7.4。

分组：①正常对照组；②模型组；③阿托品药物血清组；④强心复脉药物血清高剂组；⑤强心复脉药物血清低剂组。强心复脉药物血清高、低剂量组及阿托品药物血清组：用含15％药物血清的DMEM培养基在有氧环境中预先培养30min后，再进行模拟缺血再灌注。模型组和正常对照组均同样预先用含15％空白血清的DMEM培养基培养30min。缺血时间为60分钟，再灌注时间为3小时，进行模拟缺血-再灌注实验。模拟再灌注结束后，取窦房结细胞进行指标检测。

5、各指标的检测：

(1)细胞形态学变化比较：

结果如图5(A为正常对照组，B为模型对照组，C为强心复脉药物血清高剂组，D为强心复脉药物血清低剂组，E为阿托品药物血清组)所示。用倒置显微镜观察培养的窦房结细胞，见有3种形态，即梭形、三角形与不规则形，其中梭形细胞最多，且以梭形细胞搏动频率最快(168±8/min)。模拟缺血再灌注后的各组窦房结细胞中，模型对照组大部分细胞虽仍坚持贴壁，但已出现肿胀变形，少部分细胞出现伪足回缩，甚至细胞脱落；阿托品药物血清组细胞与模型对照组相似；而强心复脉药物血清高、低剂量组，细胞贴壁生长良好，未见明显细胞肿胀和脱落，基本与正常培养细胞相似。细胞用苏木精-伊红染色(HE染色)后光镜观察发现，模型对照组的细胞和细胞核肿胀，胞质内出现数量较多的微小空泡，胞核核膜有皱褶，胞膜可有局部破损，细胞核、胞质染色变浅淡；阿托品药物血清组细胞与模型对照组相似；而强心复脉药物血清高、低剂量组的细胞膜、核膜基本平滑完整，细胞大小形态正常。说明强心复脉药物血清与模拟缺血再灌注窦房结细胞共同孵育，可减少细胞损伤，结果优于阿托品组。

(2)原位末端转移酶标记(TUNEL法)检测细胞凋亡比较：

结果如图6(A为正常对照组，B为模型对照组，C为阿托品药物血清组，D为强心复脉药物血清高剂量组，E为强心复脉药物血清低剂量组)所示。正常对照组细胞未见胞核阳性着色，为阴性；模型对照组可见胞核呈棕色的窦房结细胞，为(++)级中度阳性着色；阿托品药物血清组与模型对照组相似，胞核亦呈棕色(++)级着色；而强心复脉药物血清高剂量组细胞未见胞核阳性着色，低剂量组可见胞核呈淡棕色，为(±)级弱阳性着色。说明抑制或阻断细胞凋亡可能是强心复脉药物血清保护细胞受损的机制之一。

(3)流式细胞术检测窦房结细胞凋亡率比较：

结果如表11和图7(A为正常对照组，B为模型对照组，C为阿托品药物血清组，D为强心复脉药物血清高剂量组，E为强心复脉药物血清低剂量组)所示。与正常对照组相比，模型对照组可见细胞凋亡率显著增加(P＜0.01)；与模型对照组比较，阿托品药物血清组凋亡率未见明显降低(P＞0.05)，强心复脉药物血清高剂量组凋亡率明显降低(P＜0.05)，低剂量组凋亡率降低差异无统计学意义(P＞0.05)。说明强心复脉高剂量组抑制凋亡从定量角度优于阿托品组。

表11 FCM检测各组窦房结细胞凋亡率(n＝3，x±s)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

(4)窦房结细胞胞质[Ca²⁺]i变化比较：

结果如表12所示。正常对照组的窦房结细胞内游离钙浓度为(437±12)nmol/L；模拟缺血60min，模拟再灌注3h后的模型对照组窦房结细胞胞质游离Ca²⁺浓度增加，约为正常组的2倍，表现出明显的钙超载现象，其差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型对照组比较，在缺血前给予强心复脉药物血清高、低剂量预处理的窦房结细胞[Ca²⁺]i明显降低(P＜0.01)。而阿托品药物血清组的窦房结细胞[Ca²⁺]i未见降低(P＞0.05)。抑制钙超载可能为强心复脉药物血清保护细胞受损的机制之一。

表12各组窦房结细胞的[Ca²⁺]i荧光强度平均值(x±s，n＝4)

与正常对照组比较，*P＜0.01：与模拟缺血再灌注组比较，△P＜0.01；与阿托品药物血清组比较，▲P＜0.01。

上述表1-12中，n表示每组中用于实验的动物例数。

药物I、药物II、药物III得到了相同的实验效果。

以上基础实验研究的各检测指标统计结果表明：强心复脉干预组能缩短AA间期、提高心率，增强窦房结自律性，改善窦房结传导功能，减少兔右冠状动脉缺血再灌注损伤所致的心律失常发生，其作用机制与抑制窦房结细胞凋亡，调节凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Fas-L蛋白表达，降低模拟缺血再灌注诱导的窦房结细胞内钙超载，从而保护细胞受损有关。

实施例3、通过临床研究检测本发明药物的效果

本实施例中是分别对散剂型的药物I、药物II、药物III均进行了以下各实验。

为评价强心复脉合剂治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征(阳虚血瘀证)的有效性及安全性，采用随机对照、多中心临床研究方法。

药物经如下煎煮后，服用：取一副药，包好后，加适量水浸泡50-60分钟，用武火(大火)煎开锅后用文火(小火)煎30分钟左右滤出药液，取药液服用，温服。

共对171例被诊断患有病态窦房结综合征(中医辨证为阳虚血瘀证)的病例进行跟踪随访，均经患者同意。其中，90例为口服强心复脉合剂治疗组(每次100ml，2次/日，疗程4周)，81例为口服阿托品片对照组(0.3mg/次，3次/日，疗程4周)。

观察病态窦房结综合征患者中医证侯、Holter(总心率、平均心率、最快心率、最慢心率等)、心功能(EF、CO、SV)、心电图(T波、ST段)及血尿便常规、肝肾功能等变化。对171例观察病例进行疗前、疗后中医症状，舌、脉象评分记录。治疗后由第三方采用SPSS软件统计处理，计量资料采用t检验，计数资料采用x²检验。

强心复脉治疗组与阿托品对照组治疗前在性别、年龄、民族情况、结婚情况、家族史、过敏史、病程、既往是否服用治疗本病药物、疗前症状评分、体重、血压、总心率、平均心率、最快心率、最慢心率、病情、舌苔、舌质、脉象等方面均进行了比较，无显著性差异(P＞0.05)，证明了两组临床观察病例有可比性。

方法及结果如下：

1、症候积分比较

疗效指数(n)＝(疗前积分-疗后积分)/疗前积分×100％。

痊愈：疗效指数≥95％；

显效：疗效指数为60％～95％；

有效：疗效指数为30％～60％；

无效：疗效指数≤30％。

疗前、疗后积分统计方法如中华人民共和国卫生部.中药新药临床研究指导原则.第二辑.1994：5

经过4周的疗程后，统计两组的有效率，结果如表13所示。治疗组主要症状痊愈率为22％，显效率68％，总有效率99％；对照组总有效率42％，两组治疗后症候疗效比较差异显著(P＜0.01)。强心复脉治疗组与阿托品对照组治疗后症状组间比较除舌苔外均有差异(P＜0.05)。说明强心复脉治疗组在改善临床症状、提高心功能和生活质量方面优于阿托品对照组。

表13两组治疗前后症状疗效比较

Z＝-4.260，P＝0.000

2、24小时动态心电图(Holter)比较

经过4周的疗程后，对每位患者进行24小时动态心电图检查，统计两组的有效率。结果如表14所示。治疗组与对照组治疗后心率均有显著提高(P＜0.01)，治疗组平均心率增加9次/分，对照组平均心率增加4次/分。治疗后两组组间比较，治疗组在总心率、平均心率、最快心率、最慢心率等方面改善较对照组明显(P＜0.05)。

表14、两组治疗前后Holter结果比较(x±s)

注：与治疗前比较，**P＜0.01；治疗后两组组间比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

3、心功能比较

经过4周的疗程后，检测患者的心功能左室收缩期射血分数(EF)、心输出量(CO)、每搏输出量，并与疗前比较。

结果如表15所示。治疗组治疗前后显效率：EF为73％，CO为37％、SV为42.5％；对照组显效率：EF为18％，CO为19％、SV为19％，两组治疗后心脏超声心功能左室收缩期射血分数(EF)值、心输出量(CO)值疗效比较差异显著(P＜0.05)，说明强心复脉改善心功能(EF)及心输出量(CO)的作用优于阿托品对照组。

判断显效标准：SV、CO、EF恢复正常。

判断有效标准：SV、CO、EF未恢复正常，但较治疗前提高≥30％。

判断无效标准：SV、CO、EF较治疗前提高但＜30％。

判断加重标准：SV、CO、EF低于正常水平，且较治疗前降低≥30％。

表15、两组患者心功能疗效比较

注：EF(％)：射血分数；CO(L/分)：心输出量；SV(ml/次)：每搏输出量。

＊治疗前心功能异常病例数，与对照组比较：*P＜0.05

4、心电图比较

经过4周的疗程后，检测患者的缺血性心电图ST段治疗前后的改变情况。

两组治疗后缺血性心电图ST段疗效比较有显著性差异(P＜0.01)；说明强心复脉能改善心脏供血，且作用优于阿托品。

5、安全性比较

临床试验中对治疗组及对照组患者，治疗前后分别进行了血常规、尿常规、便常规、肝功能、肾功能等检查，治疗后每周末进行血压检测。结果表明强心复脉对肝、肾功能及血压无不良影响。治疗组有1例睡前服药后轻度失眠，将药物改为晚餐前服用后失眠消失；对照组1例服药过程中一直存在口干眼干等症状，均未做特殊处理。

临床研究的各方面疗效统计指标显示，强心复脉合剂在改善临床症状上明显优于阿托品，能够改善患者心功能，提高患者生活质量；在提高心率和Holter、心电图等疗效指标、改善心脏超声心功能指标中EF、CO值和心电图ST段等方面优于阿托品；研究过程中治疗组未出现明显不良影响，临床上安全有效，具有巨大的推广应用价值。

药物I、药物II、药物III得到了相同的实验效果。

实施例4、通过药理学研究检测本发明药物的效果

本实施例中是分别对药物I、药物II、药物III均进行了以下各实验。

针对强心复脉方的功能主治，从耐缺氧、血液流变性、异搏定致缓慢型心律失常、甲醛致窦房结急性损伤诱发的缓慢型心律失常等4个方面对其进行较系统的药效学研究。

1、对小鼠耐缺氧能力的影响

以Wistar大鼠为实验动物。

强心复脉以2.78g生药/kg；5.55g生药/kg及11.10g生药/kg(相当于人用剂量的5倍；10倍和20倍)三个剂量灌胃，阳性对照组用复方丹参片0.5g/kg(相当于人用量的10倍)；观察各组小鼠在密闭容器中的存活时间。

实验结果如表16所示。表明，三个剂量组均能明显延长小鼠在常压缺氧条件下的存活时间。低、中、高三个剂量组小鼠在存活时间上较比对照组分别延长了15.51％、17.30％和19.36％，均差异显著P＜0.01。说明该药具有提高机体耐常压缺氧的能力，大剂量组的作用与阳性参比药复方丹参作用近似。

表16、强心复脉药对小鼠耐常压缺氧的影响

注：与对照组比较*P＜0.01

2、强心复脉对“血瘀”大鼠血液流变学的影响

强心复脉以2.22g生药/kg、4.44g生药/kg及8.88g生药/kg组(相当于人用剂量的4倍；8倍和16倍)三个剂量，阳性对照组用复方丹参片0.5/kg(相当于人用剂量的10倍)。对大鼠皮下注射肾上腺素外加冷刺激造成寒凝血瘀型动物模型，观察各组对血液流变学指标发生异常改变的改善作用。

实验结果如表17所示。强心复脉能降低低切变率下的全血粘度(P＜0.05)；能减小红细胞变形指数和红细胞聚集指数(P＜0.05)，从而起到维护红细胞正常的变形性及抗红细胞聚集的作用；能使血液中纤维蛋白原的含量明显降低(P＜0.05)，从而显示出较好抗纤维蛋白原凝集的作用。各组又以中剂量组作用最为明显。复方丹参片亦有一定的减小红细胞变形指数和降低纤维蛋白原的作用。本法造模对全血粘度高切应力200s和红细胞压积影响不大。

表17、强心复脉对“血瘀”大鼠血液流变学的影响

注：与正常对照组比较：▲P＜0.05，△P＜0.01；

与模型对照组比较：*P＜0.05

3.强心复脉对异搏定致小鼠缓慢性心律失常模型的影响

强心复脉在2.78g生药/kg、5.55g生药/kg及11.10g生药/kg(相当于人用剂量的5倍；10倍和20倍)三个剂量作用下，观察各组对异搏定诱发心动过缓模型心率的影响。

实验结果如表18所示。异搏定可致小鼠心律失常，心率缓慢下降。造模1min后，各组小鼠心率较造模前有所下降，组间比较未有明显差异(P＞0.05)。造模后5min，强心复脉对心率有提高作用，大剂量组作用明显，作用持续至20min观察期，与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。20min时，对照组小鼠的心率平均减慢了(27.8±8.9)％，强心复脉小、中、大三个剂量组分别为(18.8±8.5)％、(23.8±7.4)％和(18.8±6.7)％。而阳性参比药阿托品组为(28.9±9.4)％，未显示出提高心率的作用。实验结果表明，强心复脉具有拮抗异搏定致心率下降的作用，阿托品对异搏定致心率下降没有拮抗作用。

表18、对异搏定所致小鼠心律失常时心率的影响(次/分x±s)

注：与对照组比较*P＜0.05

4、强心复脉对家兔窦房结急性损伤模型的影响

强心复脉在1.67g生药/kg、3.33g生药/kg、6.66g生药/kg(分别相当于人用剂量的3倍、6倍、和12倍)三个剂量作用下，观察各组对甲醛致家兔窦房结急性损伤诱发的缓慢型心律失常模型心率及心电图ST段的影响。

实验结果如表19-21所示。强心复脉颗粒大、中、小剂量组在十二指肠给药30min即发挥药效作用(P＜0.05)，心率分别提高了25.3％、36.5％和29.3％，给药60min后，平均心率又进一步加快并持续至120min观察期；阳性参比药阿托品亦显示出良好的提高心率作用；而对照组家兔心率则没有明显提高。提示强心复脉对甲醛致家兔窦房结损伤的有明显促修复作用，用药后心率有明显的增加。且所有家兔经甲醛造模后，心电图ST段均出现下移样缺血性改变(P＜0.05)。强心复脉组给药30min后心电图ST段即开始逐渐恢复(P＜0.05)，以中、大剂量组最为明显；阿托品组给药后心电图ST段未见明显改变。

实验过程中还发现，接受小剂量强心复脉的治疗组在给药60min时，心电图正常恢复率(ST段恢复到造模前水平)为60％；90min时心电图完全恢复正常。中剂量组于给药60min时，心电图正常恢复率为90％，并持续至120min实验期。大剂量组于给药30min时，心电图完全恢复正常，作用较中、小剂量组好。而阿托品对心电图缺血性ST改变作用不明显，至给药90分钟后心电图才有所改善，120分钟时心电图恢复正常者仅2例(40％)(P＞0.05)。模型对照组心电图正常恢复率在60min时为20％，至120min时心电图正常恢复率仅为30％。

表19、强心复脉对家兔窦房结损伤模型心率的影响(次/分x±s)

注：与模型对照组比较：*P＜0.05：**P＜0.01

表20、强心复脉对家兔窦房结损伤模型心率净增作用的比较(次/分x±s)

注：与模型对照组比较：*P＜0.05；**P＜0.01

表21、强心复脉颗粒对家兔窦房结损伤模型心电图ST段的影响(mmx±s)

与正常比较：△P＜0.05；

与造模后比较：*P＜0.05，**P＜0.01

药物I、药物II、药物III得到了相同的实验效果。

药理学实验结果表明，强心复脉颗粒具有提高小鼠耐常压缺氧的能力；能改善低切变率下的全血粘度、红细胞聚集指数及纤维蛋白原含量等血液流变学指标；能提高异搏定致缓慢性心律失常动物模型的心率；能改善甲醛致家兔窦房结急性损伤模型的窦房结功能和心电图缺血性ST段改变。

Claims (5)

1.一种用于治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征的药物，它的药效组分由红参、炙附子、炙甘草、桂枝、田三七和茯苓制成；所述红参、所述炙附子、所述炙甘草、所述桂枝、所述田三七和所述茯苓的质量份数比为4-12∶2-10∶5-13∶2-10∶2-10∶6-14。

2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于：所述红参、所述炙附子、所述炙甘草、所述桂枝、所述田三七和所述茯苓的质量份数比为8∶6∶9∶6∶6∶10。

3.根据权利要求1或2所述的药物，其特征在于：所述药物是按照包括如下步骤的方法制备得到的：用提取剂提取所述红参，收集红参提取液和红参残渣；用水煎煮所述炙附子，然后向其中加入所述红参残渣、所述炙甘草、所述桂枝和所述茯苓继续煎煮，得到煎液；将煎液与所述红参提取液合并，再加入所述田三七的粉末，混匀。

4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于：提取红参的方法为回流提取；提取2-3次，温度为70-90℃；所述提取剂为乙醇溶液。

5.一种制备权利要求1或2所述用于治疗缓慢性心律失常病态窦房结综合征的药物的方法，包括如下步骤：用提取剂提取所述红参，收集红参提取液和红参残渣；用水煎煮所述炙附子，然后向其中加入所述红参残渣、所述炙甘草、所述桂枝和所述茯苓继续煎煮，得到煎液；将煎液与所述红参提取液合并，再加入所述田三七的粉末，混匀。

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