CN115779013B - 一种心肾同治法治疗病态窦房结综合征的中药组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种心肾同治法治疗病态窦房结综合征的中药组合物及其应用。该中药组合物包括以下原料药：生黄芪、红参、制附子、生地黄、三七和补骨脂。本发明还公开了上述中药组合物的制备方法及在制备治疗病态窦房结综合征药物中的应用。本发明中药组合物可以有效改善病态窦房结综合征患者的临床症状，提高患者生活质量，无明显不良影响，临床上安全有效。

Description

一种心肾同治法治疗病态窦房结综合征的中药组合物及其 应用

技术领域

本发明涉及中医药技术领域。更具体地，涉及一种心肾同治法治疗病态窦房结综合征的中药组合物及其应用。

背景技术

病态窦房结综合征(简称病窦，SSS)是临床难治性重大心血管病。流行病学调查表明：病窦发病年龄在20-90岁，发病率在0.17％左右，随年龄增长而增加，5年存活率62％-65％，栓塞发生率为15％；美国预计每年新患病窦人数将从2012年的78000人增长至2060年的172000人。据统计，每600个65岁以上的心脏病患者中就有1个病窦患者，全球每年50％以上的外科起搏器植入术是因为病窦。病窦由于发病率高、致残及致死率高、治疗费用高已引起人们的普遍关注。

西医目前缺乏理想药物治疗，一般应用麻黄素、阿托品或异丙肾上腺素可以缓解症状和预防心脑缺血等症的发生，但长期应用或严重的病例疗效不够理想。植入心脏起搏器是当前治疗病窦的主要方法，但存在植入部位囊袋出血、感染、导丝断裂脱落、心肌穿孔、心律失常、心力衰竭、起搏器综合征、电池寿命有限等问题，且糖尿病、消瘦、血管畸形等属禁忌症，而安装起搏器并不能降低死亡率。

病态窦房结综合征中医属“迟脉证”范畴，多数医家治疗以益气、养阴、温阳、散寒等为主要治则进行辨证论治。方药多在麻黄附子细辛汤、麻黄附子甘草汤、四逆汤、保元汤、姜附归桂参甘汤、右归饮等基础上加减。这些方药虽然在治疗过程中具有一定的治疗效果，但多数以益气温阳为主，未重视肾虚在此病发生和发展过程中的重要作用。而且，对迟脉证患者心率提高方面以及对窦房结电生理、形态结构和窦房结细胞电生理、线粒体能量代谢相关指标的影响方面没有研究。开发改善上述问题和指标的中药对有效治疗病态窦房结综合征具有重要意义。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的一个目的在于提供一种新的中药组合物，该中药组合物能有效治疗病态窦房结综合征。

本发明的另一个目的在于提供上述中药组合物在制备治疗病态窦房结综合征药物中的应用。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

第一方面，本发明提供一种心肾同治法治疗病态窦房结综合征的中药组合物，该中药组合物包括以下原料药：生黄芪、红参、制附子、生地黄、三七和补骨脂。

优选的，该中药组合物包括以下重量份的原料药：生黄芪10-50份、红参5-30份、制附子3-15份、生地黄10-50份、三七1-20份和补骨脂1-15份。

发明人团队在治疗病态窦房结综合征方面具有丰富的经验，认为病窦以心肾阳虚为病理基础、血瘀阳郁为病机关键，属虚实夹杂之证，在温阳补虚的同时，还兼顾血瘀阳郁的病机关键，提出“阳无取乎补，宣而通之”及阳气“以通为用”、“以通为补”的观点，只有保证阳气“运行不息、贯通无阻”，才能充分发挥其功能，临证之时常“温通并举、心肾同治”，故通过多年不断地调整优化处方，并经过临床试验的验证最终确定了上述中药组方。

在本发明处方中，黄芪、红参为君药，生黄芪益气补肾养心，红参大补元气、益气摄血，两者合用补肾益气以温阳，补而不燥。生地黄、制附子为臣药，生地黄大补肾阴、益精填髓以峻补阴血，为滋补之要药，取“阴中求阳”之意，并助生黄芪补肾益气之功；附子辛温扶阳，通行十二经脉，“可升可降、无所不至”，补心肾一身之阳，温通兼顾，与红参合用，具有上助心阳以通脉，下运肾阳以益火，中助脾土以健运之功，附子亦可助地黄以阴中化阳，起到阴中求阳之功。三七、补骨脂为佐药，三七活血养活，与红参、附子合用，使补而不雍塞，以通阳活血；补骨脂味辛、微苦，归肾、脾经，补肾健脾，加强生黄芪、附子补肾之功。全方配伍精炼巧妙，诸药相合，虚实兼顾、阴阳并补、温通并举、气血同益，温阳而无辛燥之虞，活血而无出血之弊，于阴中求阳、阳中求阴，使五脏得养，心脉充盈。从“心肾同治”入手，共奏补肾通阳、活血复脉之功，用于治疗心肾阳虚、血瘀阳郁型病窦患者，临床疗效可靠，安全性好。

示例性的，所述治疗病态窦房结综合征的中药组合物，包括以下重量份的原料药：生黄芪10-30份、红参5-20份、制附子3-10份、生地黄10-30份、三七1-10份和补骨脂1-12份。

示例性的，所述治疗病态窦房结综合征的中药组合物，包括以下重量份的原料药：生黄芪30份、红参9份、制附子6份、生地黄15份、三七3份和补骨脂10份。

示例性的，所述治疗病态窦房结综合征的中药组合物，包括以下重量份的原料药：生黄芪20份、红参6份、制附子3份、生地黄20份、三七1.5份和补骨脂9份。

示例性的，所述治疗病态窦房结综合征的中药组合物，包括以下重量份的原料药：生黄芪15份、红参6份、制附子6份、生地黄30份、三七3份和补骨脂6份。

本发明上述中药组合物的各原料药组成基本方，在具体的实施方式中，根据临床症状在上述中药组合物的基础上可以进行调整，以达到治疗病态窦房结综合征及改善某些特殊临床症状的目的，进一步增强本发明组合物的适应性，提高治疗效果。基于本发明的基本方所做的这些调整方也在本申请的保护范围内。

示例性的，气虚明显者，加党参加强益气之功；阳虚明显者，加桂枝、细辛温阳；肾虚明显者，加黄精、桑葚增强补肾之功；血瘀明显者，加当归以活血养血。

第二方面，本发明提供了一种上述治疗病态窦房结综合征的中药组合物的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

按配方量取生黄芪、红参、制附子、生地黄、三七和补骨脂，加水煎煮两次，滤过，合并滤液，即得；

为了便于储存，优选的，所述制备方法还可以包括将滤液浓缩为清膏，及干燥的步骤。

进一步的，在上述制备方法中，每次加水量为原料药总质量的10-15倍；所述煎煮的时间为第一次保持微沸1-2小时，第二次保持微沸0.5-1小时；所述清膏为60℃测定的相对密度为1.30-1.35的清膏。干燥可以采用现有技术中常用的干燥方法，例如，可以采用喷雾干燥，喷雾干燥的工艺参数为：进风温度165-195℃，出风温度：80-105℃。

第三方面，本发明提供了一种心肾同治法治疗病态窦房结综合征的药物，该药物以上述中药组合物作为活性成分。

根据实际需要，所述药物还可以包括药学上可接受的辅料。按照常规制剂工艺，制成各种制剂，如煎剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、口服液等剂型。

示例性的，将上述方法制备的干膏粉(过80目筛)采用干法制粒，制成12-40目颗粒。

本发明还提供了上述中药组合物在制备治疗病态窦房结综合征的药物中的应用。

另外，如无特殊说明，本发明中药组合物各原料药均可通过市售商购获得，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围的中药组合物均可以达到治疗病态窦房结综合征的目的。

本发明的有益效果如下：

本发明中药组合物在改善病态窦房结综合征临床症状上明显优于西药阿托品及茶碱缓释片，能够显著提高病窦患者24h总心率及平均心率、减少窦停次数，降低晕厥次数和频率，在一定程度缩短最长停搏时间；能够显著降低阳虚血瘀型病窦患者中医证候积分，改善患者症状；降低焦虑、抑郁自评量表(SAS、SDS)积分，提高患者生活质量。研究过程中本发明中药组合物未出现明显不良影响，临床上安全有效。

进一步基础研究证明该方改善窦房结自律性和传导功能，从而提高心率，是通过保护细胞形态结构，提高窦房结超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道蛋白(HCN₄)表达；增强受损窦房结细胞(SNC)起搏电流(I_f)、超速激活延迟整流钾电流(I_kur)及瞬时外向钾电流(I_to)；抑制窦房结纤维化相关蛋白的表达水平，改善老龄相关的窦房结纤维化，并且通过β-tubulin骨架蛋白调节线粒体氧化应激和线粒体能量代谢水平，维持线粒体形态和结构的稳定性，提高窦房结细胞活性等作用机制实现的。因此，本发明中药组合物在治疗病态窦房结综合征领域中具有巨大的推广应用价值。

附图说明

图1光镜下各组兔窦房结组织形态学特征(HE×200)；

图2电镜下各组兔窦房结组织形态学特征(TEM×10k)；

图3含药血清对乳鼠受损SNC动作电位的影响；

图4含药血清对乳鼠受损SNC起搏电流的影响；

图5含药血清对乳鼠受损SNC I_to的影响；

图6含药血清对乳鼠受损SNC I_Kur的影响；

图7本发明中药组合物通过调节TGF-β/Smad3和半胱天冬酶-9介导的线粒体凋亡途径改善窦房结纤维化图；其中A.通过masson染色检测到纤维化；B.天狼星红染色用于检测胶原沉积；C.纤维化区域通过Masson染色检测；D-E.通过WGA染色检测心肌细胞肥大；H-I.转化生长因子β(TGF-β)和Smad3的免疫组化检测；J-K.半胱天冬酶-9的免疫荧光检测；*P<0.05，**P<0.01；

图8本发明中药组合物通过调节“炎症-氧化应激”串扰机制来改善窦房结组织中的线粒体稳态图；其中，A-B.活性氧(ROS)的免疫荧光表达；C-E.丙二醛(MDA)/超氧化物歧化酶(SOD)/谷胱甘肽(GSH)的活性；F-J.NLRP3和Caspase-3的免疫荧光表达；P62和Smad3的免疫荧光表达；K.通过透射电子显微镜检测线粒体稳态；*p<0.05，p<0.01；

图9本发明中药组合物通过调节β-微管蛋白抑制活性氧(ROS)介导的线粒体氧化应激损伤图；其中，A-B.TUNEL用于检测细胞凋亡的水平；C.检测窦房结细胞(SNC)活性；D-E.ROS的免疫荧光表达；*p<0.05，**p<0.01；

图10本发明中药组合物通过调节β-微管蛋白来维持线粒体膜电位水平和线粒体数量图；其中，A.通过透射电子显微镜检测窦房结细胞中线粒体的形态和结构；B.JC-1聚集体的荧光表达；C.JC-1单体的荧光表达；D.红绿荧光比；E.SNCs的线粒体膜电位(MMP)；

图11本发明中药组合物通过β-微管蛋白调节Drp1介导的线粒体融合/裂变失调，从而改善线粒体质量；其中A.窦房结细胞(SNC)的线粒体结构；B.线粒体长度；C.线粒体碎片化水平；D.Drp1的荧光表达水平；E.Drp1向线粒体的迁移水平；F.Fis1的转录水平；G.Mfn1的转录水平；*p<0.05，**p<0.01；

图12本发明中药组合物通过β-微管蛋白调节parkin介导的线粒体自噬功能障碍，改善线粒体呼吸功能和ATP产生；其中，A-B.线粒体TOM20的荧光表达水平；C.ATG5的转录水平；D.线粒体最大呼吸；E.线粒体ATP生成水平；F.线粒体基础呼吸；G.Parkin的转录水平；H.线粒体储备呼吸；I.质子泄漏水平；*p<0.05，*p<0.01。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1一种心肾同治法治疗病态窦房结综合征的中药组合物

原料药配方：生黄芪20g、红参6g、制附子3g、生地黄20g、三七1.5g和补骨脂9g。

取以上6味原料药，一煎加10倍量的水煎煮，加热至沸，保持微沸1-2小时，抽滤(200目)；二煎加10倍量水煎煮，加热至沸，保持微沸0.5-1小时，抽滤(200目)，合并滤液，即得。

实施例2一种心肾同治法治疗病态窦房结综合征的中药组合物

原料药配方：生黄芪15g、红参6g、制附子6g、生地黄30g、三七3g和补骨脂6g。

取以上6味原料药，一煎加10倍量的水煎煮，加热至沸，保持微沸1-2小时，抽滤(200目)；二煎加10倍量水煎煮，加热至沸，保持微沸0.5-1小时，抽滤(200目)，合并滤液；滤液浓缩至适量(相对密度为1.30-1.35(60℃)的清膏)，喷雾干燥(进风温度165-195℃，出风温度80-105℃)，粉碎过筛，即得。

实施例3一种心肾同治法治疗病态窦房结综合征的药物(颗粒剂)

原料药配方：生黄芪30g、红参9g、制附子6g、生地黄15g、三七3g和补骨脂10g。

取以上6味原料药，一煎加10倍量的水煎煮，加热至沸，保持微沸1-2小时，抽滤(200目)；二煎加10倍量水煎煮，加热至沸，保持微沸0.5-1小时，抽滤(200目)，合并滤液；滤液浓缩至适量(相对密度为1.30-1.35(60℃)的清膏)，喷雾干燥(进风温度165-195℃，出风温度80-105℃)，粉碎过筛得干膏粉；然后，采用干法制粒，制成12-40目颗粒，即得。

实施例4本发明中药组合物治疗病态窦房结综合征的基础研究

1对病窦模型动物心率、窦房结电生理功能、形态结构及HCN4表达的影响

1.1实验方案

本实验所用的药物由中国中医科学院广安门医院药剂科提供，水煎剂。处方组成：生黄芪30g、红参9g、制附子6g、生地黄15g、三七3g、补骨脂10g。

60只大耳白兔随机分为六组：正常组，模型组，阿托品组(盐酸阿托品片)，本发明中药组合物高、中、低剂量组，每组10只，正常组不造模，余各组采用甲醛加压注射渗透法建立兔病窦模型(先以自制窦房结定位电极定位窦房结区域，然后于电极三通管另一端连接注射器，推注20％甲醛溶液0.01-0.02ml。当心率下降至原有心率的30％～50％，伴或不伴有出现窦性停搏、窦房传导阻滞、结性逸搏等心律失常时停止浸润甲醛，连续观察2h，待心律稳定后为成功建立病态窦房结综合征模型，建模后以青霉素钠生理盐水80万单位连续注射三天，使模型稳定)。

于第4天开始灌胃给药，连续7天，每日2次，正常组与模型组均灌胃以等体积的生理盐水。给药剂量按兔与人体表面积折合法换算：本发明中药组合物高剂量组：9.36g/d/kg，相当于成人临床用量的12倍；中剂量组：4.68g/d/kg，相当于成人临床用量的6倍；低剂量组：2.34g/d/kg，相当于成人临床用量的3倍；阿托品组：0.36mg/d/kg，相当于成人临床用量的12倍。于造模前、造模后2h、灌胃治疗7天后观察测定心率变化、AA间期、窦房结传导时间(SACT)、窦房结恢复时间(SNRT)并计算其校正值(CSNRT)；灌胃治疗7天后取窦房结组织，光学显微镜、透射电子显微镜下观察窦房结组织形态结构及细胞超微结构的改变；免疫组化方法检测各组动物实验后窦房结组织环核苷酸门控阳离子通道蛋白HCN4表达水平的变化。

1.2实验结果：

1.2.1模型动物心率及窦房结电生理功能：

与正常组相比，模型组、阿托品组与高、中、低剂量组造模后心率均显著降低，心电图均出现窦性停搏、窦性心动过缓、交界性逸搏心律等心律失常表现。与模型组相比，阿托品组与高、中、低剂量组给药后心率均有不同程度升高；且高剂量组较阿托品对照组效果更显著，如表1所示。窦房结功能方面，与模型组比较，给药组心率增加，AA间期、SACT、SNRT、CSNRT等指标均较模型组缩短；且高剂量组疗效优于中、低剂量组及阿托品组。如表2-表4所示。

表1各组兔不同时期心率变化比较(次/分，)

注：与正常组同期比较，^▲P＜0.01；与模型组同期比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与阿托品组同期比较，

表2各组不同时期AA间期变化(ms，)

注：与正常组同期比较，^▲P＜0.01；与模型组同期比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与阿托品组同期比较，

表3各组不同时期SACT、SNRT变化比较(ms，)

注：与正常组同期比较，^▲P＜0.01；与模型组同期比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与阿托品组同期比较，

表4各组不同时期CSNRT变化比较(ms，)

注：与正常组同期比较，^▲P＜0.01；与模型组同期比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与阿托品组同期比较，

1.2.2形态学观察

HE染色观察：正常组窦房结细胞排列有序，无肿胀及充血，结区主要由P细胞和T细胞组成，胞质淡染。P细胞核大，呈圆形或椭圆形，细胞界限不清，常成团分布。T细胞主要位于窦房结边缘，也可散在分布与结中心区，形态较P细胞小，呈长行或梭行。模型组与正常组相比，窦房结细胞间质疏松，排列紊乱，P细胞和T细胞难以区分，细胞肿胀明显，可见核固缩、裂解，多数窦房结组织伴有大量炎细胞浸润及脂肪变性。高剂量组细胞肿胀不明显，少量细胞坏死，局部小面积感染及充血灶，形态特征与正常组基本相似，中、低剂量组及阿托品组窦房结细胞肿胀，伴核固缩，少量炎细胞浸润及脂肪变性，病理形态改变介于高剂量组与模型组之间。如图1所示。

透射电镜观察：正常组，P细胞膜光滑，细胞器少，胞质清亮，核大呈椭圆形，约占细胞体积的1/2，线粒体结构完整，散乱分布，内质网及高尔基复合体不发达，T细胞有较多的肌丝束，排列有序，可见完整的肌节及Z线。模型组，核膜不规则，核仁裂解，染色质边集，线粒体肿胀，基质电子密度降低，嵴断裂、减少，部分呈空泡状，肌丝溶解消失。本发明中药组合物高剂量组，细胞膜完整规则，线粒体肿胀不明显，部分体积增大，嵴断裂溶解，偶见少数细胞核呈分叶状。阿托品组及中、低剂量组，线粒体肿胀，嵴断裂形成空泡变，部分细胞核形状不规则，可见核膜间隙增宽。如图2所示。

1.2.3分子测定

与正常组相比，造模各组家兔窦房结组织HCN4蛋白表达量显著降低，差异有统计学意义，与模型组相比，各药物组及阿托品组家兔窦房结组织HCN4表达量均显著升高，其中高剂量组明显优于中、低剂量组及阿托品组，差异有显著性意义，阿托品及中、低剂量组之间无显著性差异。如表5所示。

表5各组窦房结细胞HCN4蛋白表达的IOD值

注：与正常组比较，^▲▲P＜0.01；与模型组比较，^△△P＜0.01；与阿托品组比较，

2.对受损窦房结细胞离子通道学电生理机制的研究

2.1实验方案

本实验所用的药物由中国中医科学院广安门医院药剂科提供，清膏。处方组成：生黄芪30g、红参9g、制附子6g、生地黄15g、三七3g、补骨脂10g。

将采用“酶解+差速贴壁”法分离的乳鼠窦房结细胞(SNC)分为正常组、模型组、本发明中药组合物含药血清组及空白血清组，除正常组，其余各组细胞均模拟缺血-再灌注(I-R)法制备SNC损伤模型，并利用全细胞膜片钳技术观察本发明中药组合物含药血清对各组动作电位(AP)、超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道电流(起搏电流，I_f)、瞬时外向钾电流(I_to)和超速激活延迟整流钾电流(I_Kur)等的影响，探讨本发明中药组合物对受损窦房结细胞离子通道学电生理机制。本发明中药组合物含药血清制备：成年雄性Wistar大鼠20只，分成2组，空白血清组和本发明中药组合物组，每组10只。大鼠适应性喂养3天后灌胃，连续7天，日2次，本发明中药组合物给药剂量采用国际标准，按鼠(以200g大鼠体表面积为准)与人(以70kg成人体表面积为准)体表面积折合换算，得到等效剂量后，再扩大10倍，作为大鼠的每日用药量。成人每日需用本发明中药组合物为14.5g(相当于生药量84g)，折算为大鼠的等效剂量为1.3g清膏/kg(相当于8.801g生药/kg)，故大鼠每日用药量为13g清膏/kg(相当于88.01g生药/kg)，用蒸馏水配制成混悬液，空白血清组给予等量蒸馏水。末次给药前禁食不禁水12小时，末次给药后2小时，3％戊巴比妥腹腔麻醉(30mg/kg)后，腹主动脉取血，静置2小时，自然分离血清，2500R/min离心25分钟，56℃水浴灭活30min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到无菌的空白血清及含药血清，分装EP管后，置于-80℃冰箱冻存，备用。

2.2实验结果

对动作电位AP的影响：与正常组比较，模拟I-R造模后窦房结细胞的自发性搏动频率明显减慢。加入含药血清后，细胞搏动频率明显增快(P＜0.01)。如图3所示。

对起搏电流I_f的影响：与正常组窦房结细胞I_f峰值电流密度为(-40.38±2.18)pA/pF，模拟I/R后SNC I_f峰值电流密度明显降至(-15.78±3.15)pA/pF(P＜0.01)。加入含药血清后，I_f峰值电流密度明显增大(-125.14±1.22)pA/pF(P＜0.01)，空白血清组与模型组SNC比较，I_f峰值电流密度无统计学差异(P＞0.05)。如图4所示。

对钾电流的影响：正常组SNC的I_to和I_Kur峰值电流密度分别为(23.08±2.52)pA/pF和(21.7±2.5)pA/pF，模拟I-R造模后细胞I_to和I_Kur峰值电流密度分别降为(14.06±1.23)pA/pF和(14.4±0.9)pA/pF(P＜0.01)。于造模后细胞外液加入含药血清后，I_to峰值电流密度分别升高至(21.65±1.73)pA/pF(P＜0.01)，I_Kur峰值电流密度增大至(20.00±1.57)pA/pF(P＜0.01)。空白血清组与模型组SNC比较，I_to和I_Kur峰值电流密度无统计学差异(P＞0.05)。如图5和图6所示。

3.对老龄鼠窦房结病理组织学、纤维蛋白改变和纤维化相关蛋白表达的调节机制研究

3.1实验方案

本实验所用的药物由中国中医科学院广安门医院药剂科提供，水煎剂。处方组成：生黄芪30g、红参9g、制附子6g、生地黄15g、三七3g、补骨脂10g，中药原液浓度为lg/mL。

取SD大鼠(SPF级)一共60只，其中3月龄大鼠20只、14月龄大鼠20只、20月龄大鼠20只。而后将3月龄/14月龄/20月龄大鼠随机分为空白对照组(3月龄/14月龄/20月龄)和药物干预组(3月龄/14月龄/20月龄)，每组各10只。药物干预组大鼠(3月龄/14月龄/20月龄)每日定时灌胃给药2ml；空白对照组大鼠(3月龄/14月龄/20月龄)给予同等体积的生理盐水2ml，共30天。Masson/天狼星红染色观察窦房结病理组织学和纤维蛋白改变；免疫组织化学法检测纤维化相关蛋白表达情况。组织免疫荧光检测纤维化相关指标及炎症、自噬相关荧光表达情况。组织透射电镜检测窦房结组织线粒体形态和结构改变情况。氧化应激、炎症和自噬相关蛋白表达情况。

3.2实验结果

3月龄空白对照组和给药组无明显病理变化。14月龄和20月龄的增龄模型对照组大鼠窦房结组织纤维化程度较重。尤其是20月龄老龄鼠窦房结及周围心肌组织病理改变较为明显，纤维蛋白原凝集水平显著升高(P<0.01)。免疫组化显示TGF-β和smad3表达水平显著升高(P<0.01)。免疫荧光检测显示组织ROS生成显著升高Smad3和Caspase-9荧光表达水平显著升高，WGA染色显示心肌细胞肥大显著升高，氧化应激标志物显著升高，抗氧化酶显著降低(P<0.01)。14月龄和20月龄的通阳活血方干预组大鼠较模型组大鼠比较，窦房结组织纤维化程度显著减轻，纤维蛋白原凝集水平显著降低(P<0.01)，。免疫组化显示TGF-β和Smad3表达水平显著降低，免疫荧光检测显示组织ROS生成显著降低，Smad3和P62/Caspase-9荧光表达水平显著降低，WGA染色显示心肌细胞肥大显著降低，氧化应激标志物MDA显著降低，抗氧化酶SOD/GSH显著升高(P<0.01)。TGF-β/Smad3/α-SMA的表达水平显著降低。组织线粒体排列相对规则，自噬溶酶体形态结构相对稳定。如图7和图8所示。

4.对缺氧/复氧窦房结细胞线粒体稳态的调节机制研究

4.1实验方案

本实验所用的药物由中国中医科学院广安门医院药剂科提供，水煎剂。处方组成：生黄芪30g、红参9g、制附子6g、生地黄15g、三七3g、补骨脂10g，中药原液浓度为lg/mL。

选取新生24h内新西兰乳兔，分为正常对照组、模型组、本发明药物治疗组，本发明药物+β-tubulin敲低组、本发明药物+β-tubulin过表达组。采用“单酶解+差速贴壁”法，原代分离乳兔窦房结细胞。其中模型组和药物+β-tubulin敲低组/药物+β-tubulin过表达组都采用模拟缺血-再灌注法(缺氧/复氧)制备乳兔窦房结细胞损伤模型。利用β-tubulinsiRNA慢病毒载体转染乳兔窦房结细胞获得药物+β-tubulin siRNA组(β-tubulin敲低组)；利用β-tubulin RNA慢病毒载体转染乳兔窦房结细胞获得药物+β-tubulin over express组(β-tubulin过表达组)；采用CCK8、流式细胞术和TUNEL荧光技术等检测细胞活性、细胞凋亡水平、ROS生成水平和线粒体膜电位水平。采用免疫荧光技术检测细胞ROS生成水平和NCX1.1的表达水平。采用激光共聚焦技术检测β-tubulin蛋白的结构，JC-1线粒体膜电位表达水平、线粒体长度、线粒体碎片化水平。采用荧光共定位技术检测线粒体裂变驱动蛋白Drp1和线粒体自噬调节蛋白TOM20表达水平/迁移水平。采用细胞透射电镜检测窦房结细胞线粒体形态与结构以及线粒体自噬溶酶体形成状态。采用ELISA试剂盒检测氧化应激标志物MDA和抗氧化酶SOD/GSH/TrxR和线粒体呼吸链酶复合物I/III的表达水平。采用RT-PCR技术检测线粒体裂变与融合相关蛋白(Fis1/Mfn1)、线粒体生物合成相关蛋白(Tfam\PGC1α)和线粒体自噬相关蛋白(Parkin/ATG5)的mRNA表达水平。

4.2实验结果

经缺氧/复氧模拟缺血再灌注处理后原代窦房结细胞的活性显著降低，细胞凋亡和ROS生存水平显著升高。同时伴随着β-tubulin骨架蛋白表达的降低和钙超载，而且缺氧/复氧处理后窦房结细胞还出现了氧化应激失调和线粒体呼吸链功能障碍、线粒体膜电位丢失和线粒体碎片化水平上升。Drp1/Fis1/Mfn1介导的线粒体动力学失衡，线粒体裂变程度加重，Parkin/ATG5/TOM20介导的线粒体自噬失衡，同时伴随着线粒体质量控制失调和线粒体生物合成障碍。经通阳活血方干预治疗后，细胞活性显著提高，细胞ROS的生成和氧化应激损伤水平显著降低，线粒体碎片化水平降低。通阳活血方干预还能够恢复线粒体呼吸链功能和线粒体膜电位水平，维持线粒体质量/数量的正常和线粒体生物合成水平。然而，在用siRNA(si-β-tubulin)处理后，通阳活血方对线粒体稳态和氧化应激的调节作用被抑制，对窦房结细胞的保护作用也被抵消了。然而β-tubulin over-express可以提高通阳活血方对线粒体稳态和氧化应激的调节作用，同时增强通阳活血方对窦房结细胞的保护作用(P<0.05)。如图9-图12所示。

上述基础研究结果证明，本发明中药组合物能改善窦房结自律性和传导功能，从而提高心率，抑制窦房结细胞凋亡、保护细胞形态结构，提高窦房结超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道蛋白(HCN₄)表达；该方含药血清能增强受损窦房结细胞起搏电流(I_f)、超速激活延迟整流钾电流(I_kur)及瞬时外向钾电流(I_to)的电流密度及幅值，从而加快自发性搏动频率以提高心率。通过抑制纤维化相关蛋白的表达水平，改善窦房结纤维化的作用机制。并且通过β-tubulin骨架蛋白调节氧化应激和钙稳态水平，提高窦房结细胞活性，抑制细胞凋亡，保护窦房结细胞。还可以通过调节线粒体稳态机制提高窦房结细胞活性，维持线粒体稳态，进而保护窦房结细胞。

实施例5本发明中药组合物治疗病态窦房结综合征的临床研究

5.1实验方案

采用随机、对照的研究方法，临床观察160例阳虚血瘀型病态窦房结综合征患者，治疗组74例，西药组86例，治疗组予实施例3制备颗粒，2袋(12g)/次，2次/天，热水溶化服用。对照组予茶碱缓释片0.1g/次，2次/天，口服，疗程4周。观察本发明药物对患者Holter有效率、24小时动态心电图、临床症状、中医证候积分、晕厥次数、焦虑抑郁量表等变化，并与对照组茶碱缓释片进行比较，评价本发明药物治疗病态窦房结综合征的有效性及安全性。

5.2实验结果

Holter比较：经4周治疗，治疗组总有效率为82.61％，对照组总有效率为51.39％，治疗组总有效率显著高于对照组。平均心率有效率比较：经4周治疗，治疗组总有效率为81.16％，对照组总有效率为47.22％，治疗组总有效率显著高于对照组。总心率比较：治疗组治疗前为78019(8528.5)，治疗后为92546(16737.5)；对照组治疗前为77780.5(17536.25)，治疗后为88715(19273)。与治疗前相比，两组患者总心率均显著提高；组间比较，治疗后治疗组较对照组总心率提高更显著。平均心率比较：治疗组治疗前为53(5)，治疗后为64(11)；对照组治疗前为54(12)，治疗后为61(13)。与治疗前相比，两组患者平均心率均显著提高；组间比较，治疗后治疗组较对照组平均心率提高更显著。最慢心率比较：治疗组治疗前为37(7)，治疗后为42(7.5)；对照组治疗前为39(8.75)，治疗后为42(11)。与治疗前相比，两组患者最慢心率均显著提高，但组间比较差异无统计学意义。最快心率比较：治疗组治疗前为96(20)，治疗后为101(22)；对照组治疗前为99(29)，治疗后为103.5(27.5)。与治疗前相比，两组患者最快心率均显著提高，但组间比较差异无统计学意义。窦性停搏次数疗效评价：治疗组有效率为68.42％，对照组有效率为23.81％，治疗组显著优于对照组。如表6-表8所示。

中医证候积分比较：经4周治疗，治疗组总有效率为92.75％，对照组总有效率为65.28％，治疗组总有效率显著优于对照组(P＜0.01)。如表9所示。

中医证候总积分比较：治疗组治疗前为15.77±3.54，治疗后为5.88±3.50；对照组治疗前为16.42±3.72，治疗后为9.94±4.09。与治疗前相比，两组患者中医证候总积分均降低(P＜0.05)；组间比较，两组患者治疗前中医证候总积分差异无统计学意义(P＞0.05)，治疗后治疗组较对照组总中医证候总积分降低更显著。

中医证候单项积分比较：与治疗前比较，两组患者在心悸、胸闷、气短乏力、胸部刺痛、面色苍白、畏寒肢冷、头晕耳鸣、口唇紫绀方面均显著改善(P＜0.05)；组间比较，两组患者治疗前各症状差异无统计学意义(P＞0.05)，治疗后治疗组在改善患者心悸、胸闷、气短乏力、胸部刺痛、畏寒肢冷、口唇紫绀方面疗效优于对照组(P＜0.05)。

晕厥疗效比较：治疗组治疗前晕厥次数为7.24±4.32，治疗2周后为5.14±2.74，治疗4周后为3.52±2.44；对照组治疗前为7.47±3.86，治疗2周后为8.0±3.13，治疗4周后为6.32±3.59。与治疗前比较，两组患者治疗2周、4周后晕厥次数均降低；组间比较，治疗4周后治疗组晕厥次数减少优于对照组。如表10所示。

焦虑自评量表SAS得分比较：治疗组治疗前为47.52±10.09，治疗后为31.81±5.73；对照组治疗前为44.88±9.85，治疗后为39.57±6.28。与治疗前比较，两组患者SAS积分均显著降低；组间比较，治疗后治疗组SAS积分改善显著优于对照组。抑郁自评量表SDS得分比较：治疗组治疗前为43.25±9.69，治疗后为33.75±5.12；对照组治疗前为42.25±7.79，治疗后为37.39±4.64。与治疗前比较，两组患者SDS积分均显著降低；组间比较，治疗后治疗组SDS积分改善显著优于对照组。如表11所示。

表6 Holter总有效率比较(n，％)

组别	显效	有效	无效	总有效率(％)
					治疗组	24(34.78％)	33(47.83％)	12(17.39％)	82.61
对照组	12(16.67％)	25(34.72％)	35(48.61％)	51.39
					P				0.000

表7两组Holter最慢、最快、平均及总心率比较[M，(IQR)]

注：“*”：组内比较治疗前后差异有统计学意义(P＜0.05)。

表8停搏次数疗效比较(n，％)

组别	有效	无效	有效率
				治疗组	13(68.42％)	6(31.58％)	68.42％
对照组	5(23.81％)	16(76.19％)	23.81％
				P			0.005

表9中医证候积分总有效率比较(n，％)

组别	显效	有效	无效	总有效率
					治疗组	24(34.87％)	40(57.97％)	5(7.25％)	92.75％
对照组	12(16.67％)	35(48.61％)	25(34.72％)	65.28％
					P				0.000

表10晕厥疗效比较(次，)

组别	治疗组	对照组	P
				治疗前	7.24±4.32	7.47±3.86	0.851
治疗2周	5.14±2.74	8.0±3.13	0.008
				治疗4周	3.52±2.44*	6.32±3.59	0.012

注：“*”：治疗前和治疗4周后有差异，P＜0.05。

表11 SAS、SDS积分疗效评价

注：“*”：治疗前后有差异，P＜0.05。

上述结果证明，本发明药物可显著提高患者24h总心率及平均心率、减少窦停次数，降低晕厥次数，在一定程度缩短最长停搏时间；能够显著降低阳虚血瘀型病窦患者中医证候积分，改善患者症状；降低SAS、SDS积分；对血压、血常规、肝肾功能、血电解质及尿便常规等均无明显影响无明显毒副作用，安全性良好。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (11)

1.一种心肾同治法治疗病态窦房结综合征的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药制成：生黄芪10-50份、红参5-30份、制附子3-15份、生地黄10-50份、三七1-20份和补骨脂1-15份。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药制成：生黄芪10-30份、红参5-20份、制附子3-10份、生地黄10-30份、三七1-10份和补骨脂1-12份。

3.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药制成：生黄芪30份、红参9份、制附子6份、生地黄15份、三七3份和补骨脂10份。

4.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药制成：生黄芪20份、红参6份、制附子3份、生地黄20份、三七1.5份和补骨脂9份。

5.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药制成：生黄芪15份、红参6份、制附子6份、生地黄30份、三七3份和补骨脂6份。

6.权利要求1-5任一所述的心肾同治法治疗病态窦房结综合征的中药组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

按配方量取生黄芪、红参、制附子、生地黄、三七和补骨脂，加水煎煮两次，滤过，合并滤液，即得。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将滤液浓缩为清膏，及干燥的步骤。

8.一种心肾同治法治疗病态窦房结综合征的药物，其特征在于，所述药物以权利要求1-5任一所述的中药组合物为活性成分。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

10.根据权利要求8或9所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为煎剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂或口服液。

11.权利要求1-5任一所述的中药组合物在制备治疗病态窦房结综合征药物中的应用。