CN103705910A - 一种齐考诺肽注射型皮下植入剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制备技术领域，公开了一种齐考诺肽注射型皮下植入剂的制备方法以及采用该方法制备得到的齐考诺肽注射型皮下植入剂。通过本发明的方法制备得到的植入剂，在使用前，用灭菌注射用水溶解后，再注入人体皮下组织即可。通过本发明的方法制备得到的植入剂是一种缓控释制剂新剂型，可以以液体形式注射到皮下，在体温的作用下，溶液变成凝胶，在体内缓慢释放，实现治疗止痛的长效效果。

Description

一种齐考诺肽注射型皮下植入剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物制备技术领域，具体涉及一种齐考诺肽注射型皮下植入剂及其制备方法。

背景技术

疼痛是一种与组织损伤或潜在的损伤相关的不愉快的主观感觉和情感体验，是许多疾病的共同症状，解决疼痛是许多医学工作者的共同心愿。以往临床治疗以阿片类及非甾体类镇痛药为主，但是对慢性神经源性等疼痛的治疗效果并不理想。随着对疼痛的深入研究，人们发现阻断N型钙离子通道后疼痛介质的释放减少，从而可产生明显的镇痛作用。N型电压敏感钙通道（NVSCC）能够特异地被ω-芋螺毒素（ω-conotoxin，ω-Ctx）所阻断。目前已发现十几种ω-芋螺毒素，随着研究工作的进展，人们发现从致幻芋螺中分离出的一种25肽的ω-芋螺毒素能可逆地阻断N型钙离子通道，动物实验及临床观察均表明其具有明确的镇痛作用，其现已上市，定名为齐考诺肽（ziconotide），由25个氨基酸残基组成，氨基酸序列为：

FDA已经批准Elan公司的N2型钙通道阻断剂齐考诺肽（ziconotide，Prialt）鞘内给药治疗全身疼痛以及吗啡耐受或无效患者的严重慢性疼痛，为新型镇痛药物的研究开辟了新的领域。由于，齐考诺肽需要鞘内滴注给药，临床上使用需要进行手术将导管埋在人体内部，长期鞘内给药，存在感染风险，治疗费用昂贵且存在不足，临床上出现微注射位点发生感染，不可控出血体质以及椎管阻塞导致脑脊液循环不畅。长期鞘内给药可能会出现严重的精神病症状和神经受损。FDA要求所有的病人应经常监测认知功能障碍，幻觉以及情绪或意识的变化。故齐考诺肽（ziconotide，Prialt）鞘内给药存在较大的给药风险。

普通的植入剂需经手术途径植入体内，可持续数月释放药物，但手术对机体的损伤较大，病人的顺应性较差。

若将齐考诺肽制备成注射型皮下植入剂，只需皮下给药，在体内缓慢释放，实现治疗长效止痛的效果，不需进行手术，不会造成感染风险，可以避免长期鞘内给药可能出现的严重的精神病症状和神经受损。

中国专利申请CN102125517A中公开了一种小分子肽类药物的低浓度囊泡型磷脂凝胶剂及其制备方法，虽然该囊泡型磷脂凝胶剂达到了缓释效果，但是在该技术中采用了高压乳匀工艺，制备的产品存在乳化效果不稳定的缺陷，长期存放会出现破乳现象，导致药物产生了突释现象，影响了制剂的缓释效果。

发明内容

针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明一方面提供了一种制备齐考诺肽注射型皮下植入剂的方法，其包括以下步骤：

1、以聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA为骨架制备齐考诺肽微囊

将PLGA完全溶解到有机溶剂中，配制成PLGA有机溶液，将齐考诺肽分散于该有机溶液中，配制成含齐考诺肽的溶液，喷雾干燥或者冷冻干燥，制得微囊。

2、制备温度敏感型水凝胶

将温度敏感型高分子聚合物在低温条件下用水溶解混合，使温度敏感型高分子聚合物充分溶胀至溶液状态，制成水凝胶溶液。

3、制备齐考诺肽注射型皮下植入剂

将齐考诺肽微囊粉末加入到水凝胶溶液中，混合均匀，加入冻干保护剂，进行冷冻干燥，制成齐考诺肽注射型皮下植入剂。

在本发明优选的实施方案中，齐考诺肽、PLGA、温度敏感型高分子聚合物与冻干保护剂的质量比为0.05-0.5:0.5-5:5-75:0.1-10。

在本发明优选的实施方案中，温度敏感型高分子聚合物为泊洛沙姆407或聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸共聚物PLGA-PEG-PLGA，聚合物平均分子量为4000-5000道尔顿。

在本发明优选的实施方案中，PLGA中乳酸LA与羟基乙酸GA的摩尔比为20:80至90:10，更加优选为75:25或50:50，聚合物的平均分子量为10000-50000道尔顿。

在本发明的制备方法中，冻干保护剂为多元糖醇，优选为甘露醇或山梨醇。

在本发明优选的实施方案中，步骤1中所述的有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和丙酮。

在本发明优选的实施方案中，步骤1中配制成2-20%的PLGA有机溶液。

在本发明优选的实施方案中，步骤1中的喷雾干燥条件为25℃，0.2-4MPa。

在本发明优选的实施方案中，步骤2中的低温条件为2-25℃。

通过本发明的方法制备得到的齐考诺肽注射型皮下植入剂，在使用前，用0.2-2ml的灭菌注射用水将齐考诺肽注射型皮下植入剂溶解，再注入人体皮下组织即可。

本发明另一方面还提供了根据上述方法制备得到的齐考诺肽注射型皮下植入剂。

通过本发明的方法制备得到的齐考诺肽注射型皮下植入剂是一种缓控释制剂新剂型，其特点是齐考诺肽和高分子聚合物粉末在临用时在2－25℃下用水将它们混合以液体形式注射入皮下，注射入皮下后高分子聚合物溶液在体温作用下使高分子聚合物基质在注射部位固化、凝胶化，药物通过水溶胀的高分子聚合物扩散释放或高分子聚合物表面或整体溶蚀释放，达到缓释作用。由此可见，该剂型制备工艺简单，条件温和，药物的活性损失小，载药量容易控制，药物包封完全，批量生产易于实现。同时，使用生物可降解的高分子聚合物作为基质，具有良好的生物相容性，释药完毕后无需手术取出。

此外，与中国专利申请CN102125517A不同的是，在本发明的制备方法中，无需采用高压乳匀工艺，制备得到的齐考诺肽注射型皮下植入剂有效克服了乳化效果不稳定的缺陷，即使长期存放也不会出现破乳现象，药物不会产生突释现象，从而保证了植入剂的缓释效果。

附图说明

图1：本发明采用的自制的体外释放装置图。

1：10ml PBS溶液；

2：滤膜圆筒；

3：齐考诺肽注射型皮下植入剂。

图2：实施例1制备的齐考诺肽注射型皮下植入剂的体外释放结果图。

图3：实施例5制备的齐考诺肽注射型皮下植入剂的体外释放结果图。

图4：齐考诺肽注射型皮下植入剂的体外胶凝效果图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。

实施例1：齐考诺肽注射型皮下植入剂的制备

1、处方（1000支）

2、以PLGA为骨架的齐考诺肽微囊的制备

将PLGA（Mn=20000，LA:GA=50:50）完全溶解到二氯甲烷中，配制成2%的PLGA二氯甲烷溶液，将齐考诺肽分散于2%的PLGA二氯甲烷溶液中，配成含齐考诺肽的溶液，在25℃下，0.2MPa压力下，喷雾干燥，制得微囊。

3、温度敏感型水凝胶的制备

将泊洛沙姆407用1ml的注射用水20℃低温下混合在一起，静置使之充分溶胀至溶液状态，制成水凝胶溶液。

4、齐考诺肽注射型皮下植入剂的制备

将齐考诺肽微囊粉末加入到水凝胶溶液中，混合均匀，加入甘露醇进行冷冻干燥，制成1000支齐考诺肽注射型皮下植入剂。

使用前，加入0.2ml的灭菌注射用水溶解，再注入人体皮下组织。

实施例2：齐考诺肽注射型皮下植入剂的制备

1、处方（1000支）

2、以PLGA为骨架的齐考诺肽微囊的制备

将PLGA（Mn=20000，LA:GA=50:50）完全溶解到氯仿中，配制成10%的PLGA氯仿溶液，将齐考诺肽分散于10%的PLGA氯仿溶液中，配成含齐考诺肽的溶液，冷冻干燥，制得微囊。

3、温度敏感型水凝胶的制备

将PLGA-PEG-PLGA（分子量：5000）用1ml的注射用水15℃低温下混合在一起，静置使之充分溶胀至溶液状态，制成水凝胶溶液。

4、齐考诺肽注射型皮下植入剂的制备

将齐考诺肽微囊粉末加入到水凝胶溶液中，混合均匀，加入甘露醇进行冷冻干燥，制成1000支齐考诺肽注射型皮下植入剂。

使用前，加入0.5ml的灭菌注射用水溶解，再注入人体皮下组织。

实施例3：齐考诺肽注射型皮下植入剂的制备

1、处方（1000支）

2、以PLGA为骨架的齐考诺肽微囊的制备

将PLGA（Mn=10000，LA:GA=75:25）完全溶解到丙酮中，配制成20%的PLGA丙酮溶液，将齐考诺肽分散于20%的PLGA丙酮溶液中，配成含齐考诺肽的溶液，在25℃下，3MPa压力下，喷雾干燥，制得微囊。

3、温度敏感型水凝胶的制备

将PLGA-PEG-PLGA（分子量：4000）用1ml的注射用水15℃低温下混合在一起，静置使之充分溶胀至溶液状态，制成水凝胶溶液。

4、齐考诺肽注射型皮下植入剂的制备

将齐考诺肽微囊粉末加入到水凝胶溶液中，混合均匀，加入甘露醇进行冷冻干燥，制成1000支齐考诺肽注射型皮下植入剂。

使用前，加入1.5ml的灭菌注射用水溶解，再注入人体皮下组织。

实施例4：齐考诺肽注射型皮下植入剂的制备

1、处方（1000支）

2、以PLGA为骨架的齐考诺肽微囊的制备

将PLGA完全溶解到甲醇中，配制成15%的PLGA甲醇溶液，将齐考诺肽分散于15%的PLGA甲醇溶液中，配成含齐考诺肽的溶液，在25℃下，4MPa压力下，喷雾干燥，制得微囊。

3、温度敏感型水凝胶的制备

将PLGA-PEG-PLGA（分子量：4000）用2ml的注射用水10℃低温下混合在一起，静置使之充分溶胀至溶液状态，制成水凝胶溶液。

4、齐考诺肽注射型皮下植入剂的制备

将齐考诺肽微囊粉末加入到水凝胶溶液中，混合均匀，加入甘露醇进行冷冻干燥，制成1000支齐考诺肽注射型皮下植入剂。

使用前，加入2ml的灭菌注射用水溶解，再注入人体皮下组织。

实施例5：齐考诺肽注射型皮下植入剂的制备

1、处方（1000支）

2、以PLGA为骨架的齐考诺肽微囊的制备

将PLGA完全溶解到氯仿中，配制成20%的PLGA氯仿溶液，将齐考诺肽分散于20%的PLGA氯仿溶液中，配成含齐考诺肽的溶液，冷冻干燥，制得微囊。

3、温度敏感型水凝胶的制备

将PLGA-PEG-PLGA（分子量：5000）用2ml的注射用水2℃低温下混合在一起，静置使之充分溶胀至溶液状态，制成水凝胶溶液。

4、齐考诺肽注射型皮下植入剂的制备

将齐考诺肽微囊粉末加入到水凝胶溶液中，混合均匀，加入甘露醇进行冷冻干燥，制成1000支齐考诺肽注射型皮下植入剂。

使用前，加入2ml的灭菌注射用水溶解，再注入人体皮下组织。

实施例6：本发明齐考诺肽注射型皮下植入剂的体外释放实验

本实验采用自制的体外释放装置（参见附图1），其构造为：选用聚偏氟乙烯微孔滤膜（0.45μm），制成内部为平底的圆筒，其高不小于5mm，直径为8mm，容积为0.2ml左右。将其放入10ml试管中，圆筒底部为单层滤膜，多余部分折叠成短柄状，以胶带固定，放入试管后该短柄结构起支撑作用，同时保证圆筒底部液体交换顺畅。

将实施例1和实施例5制备的本发明的植入剂注入到上述装置的微孔滤膜圆筒中，在该圆筒的外围加入10ml等渗的磷酸盐缓冲液（pH7.4），在37℃条件下，依次在不同时间段取出植入剂，冷冻干燥。冻干后的植入剂以2ml乙腈溶解，涡旋至无团块，15000rpm离心5min，去除上清液，沉淀再加入2ml乙腈洗涤，重复三次，将沉淀真空干燥，以10ml2%的醋酸复溶，涡旋至全溶，15000rpm离心5min，取上清液进高效液相色谱仪。同上法，根据不同时间的植入剂中所残留的齐考诺肽浓度，计算出本发明植入剂的齐考诺肽累积释放百分率。实验平行三份，取平均值，制作释放曲线，结果分别参见附图2和附图3。从附图中可见，本发明的齐考诺肽注射型皮下植入剂的首日突释为16％左右，可缓释7至28天内累积释放达90％左右。

对体内外累积释放百分率作线性回归，得线性回归相关系数为0.9899，说明本发明齐考诺肽注射型皮下植入剂体内外释放相关性良好。实验结果表明，本发明所用的体外释放装置可客观评价注射型皮下植入剂的体外释放效果。

实施例7：齐考诺肽注射型皮下植入剂的体外胶凝试验

取实施例1-5中的齐考诺肽注射型皮下植入剂，分别用0.5ml的灭菌注射用水溶解混匀，将该混合溶液加热到37℃，每半分钟取出观察凝胶形成情况，以试管倒置30s内凝胶不流动为凝胶形成的标志。本发明的齐考诺肽注射型皮下植入剂在37℃下、1至5分钟内形成凝胶（参见图4）。

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5
						胶凝时间	1分钟	2分钟	4分钟	5分钟	5分钟

实施例8：本发明齐考诺肽注射型皮下植入剂的细胞毒性实验

本实验分成6组，分PBS组和样品组（实施例1-5），每组3个体外释放装置，分别将实施例1-5制备的本发明植入剂注入体外释放装置的微孔滤膜圆筒中，并将该圆筒浸没在10ml等渗的磷酸盐缓冲液（pH7.4）中，1-6组依次在0h，24h，72h，168h分别更换新鲜释放液，更换后1h各取释放液5ml，用无菌的0.22μm微孔滤膜过滤后，分别以无菌等渗的PBS稀释至一系列浓度（100％，50％，25％，12.5％）备用。将处于对数生长期的小鼠成纤维细胞NIH3T3接种于96孔细胞板，接种密度为105cells/ml，每孔100μl，培养基为含有10％新生牛血清的DMEM高糖培养基。培养板在37℃、5%CO2条件下培养24h，吸除原有培养基，加入150μl新鲜培养基。向培养板中加入50μl上述不同浓度的释放介质稀释液，PBS作为对照。24h后，按CCK-8试剂盒的使用说明书向各实验孔中加入10μl细胞活性检测试剂CCK-8，继续培养4h。酶标仪测定各实验孔在450nm的吸光度值，以630nm作为参比波长。各浓度释放液作三复孔，取吸光度平均值，以释放时间为横坐标，吸光度值为纵坐标作图，实验结果PBS组和其它组没有显著性差异（p＞0.05），而未见明显的吸光度值减小，说明细胞活性相差不大。MTT细胞毒性试验结果显示，其平均细胞增殖率均大于85％，细胞毒等级1级，不具有细胞毒性。

由此可见，本发明的齐考诺肽注射型皮下植入剂的细胞毒性低，生物相容性较好。

实施例9：本发明齐考诺肽注射型皮下植入剂的组织刺激性实验

雄性SD大鼠（200-220g）18只，分别取本发明齐考诺肽注射型皮下植入剂，注入0.2ml齐考诺肽注射型皮下植入剂于SD大鼠背部右侧皮下，背部左侧皮下注射等体积0.9％NaCl，作为对照。在1d，7d，14d各处死大鼠一只，取下注射部位周围的皮下组织，放于10％的中性福尔马林溶液中固定过夜。按常规将组织50%～100%浓度梯度的乙醇脱水后包埋于石蜡中。苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察组织细胞。

结果表明，本发明齐考诺肽注射型皮下植入剂给药1天后，可见明显的淋巴细胞浸润，7天后淋巴细胞明显减少，到14天时已经基本下降至正常水平，未见组织损伤或坏死。在7天和14天可以观察到巨噬细胞有所增多，表明组织产生了一定的慢性炎症反应，但这也是机体组织对外来损伤产生的正常的免疫反应。

由此可见，本发明的齐考诺肽注射型皮下植入剂的组织刺激性较小，安全性良好。

实施例10：本发明齐考诺肽注射型皮下植入剂的药效学评价实验

选用SPF级SD大鼠，体质量180～220g，采用经典动物疼痛模型—脊神经选择结扎模型（Spinal nerve ligation mode,SNL），此模型稳定，能较好地再现临床慢性神经病理性疼痛的症状和特点，被疼痛界广泛认可和应用。采用经典的腰5脊神经结扎加切断术建立神经病理性疼痛模型，取大鼠，10%水合氯醛0.35～0.4ml/100g腹腔麻醉后，备皮、消毒，分离左侧腰5脊神经，结扎后切断；再于逐层缝合切口，待大鼠苏醒后，单笼喂养。

为消除大鼠心理因素对测试结果的影响，在基础值测定前1周，每日将大鼠放置于监测仪器的透明有机玻璃箱内不少于15min。动物造模前第1、3天及造模后第4、6天需进行50%PWT及热刺激撤足潜伏值（TWD）的测定，对比造模前后疼痛阈值，除假手术组外，造模后疼痛阈值显著降低者视为疼痛模型成功。

建模手术后7d（记为7d）将建模成功的大鼠随机分为4组，每组8只。

模型对照组（L5SNL）：0.9%生理盐水20μl；

齐考诺肽注射型皮下植入剂低剂量组：50μg（以齐考诺肽计）；

齐考诺肽注射型皮下植入剂中剂量组：200μg（以齐考诺肽计）；

齐考诺肽注射型皮下植入剂高剂量组：500μg（以齐考诺肽计）。

分别皮下注射给药，监测大鼠给药前、后1、7、14、28天的痛阈变化，收集数据。

50%PWT的测定：待大鼠安静后，采用Up－Down方法，选8根强度呈对数递增方式的von Frey hair（0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51、15.14g）分别对大鼠后肢左右脚足心部进行机械性刺激，每次刺激持续时间为6～8ｓ。以2.041ｇ刺激强度为初始刺激强度，根据撤足反应阴、阳性的变化，选择相邻递增或递减的von Frey hair继续刺激，以第一个转折点为起点连续5次的刺激结果为最终的撤足反应模式，根据公式：

50%PWT（g）＝10（Xf+kδ）/10000，式中Xf为最末次测试Von Frey纤维丝的对数值；k可根据撤足反应模式查表（参见Chaplan SR，Bach FW，PogrelJW,et al.Quantitative ass-ssment oftactile allodynia in the rat paw[J].J NeurosciMethods,1994，53（1）：55）得出；δ为8根Von Frey纤维丝间对数差值的均值。

另根据公式计算最大效应百分比（MPE，%），用以评价抗神经病理性疼痛的效果（MPE）＝（给药后撤足阈值－基础撤足阈值）/（15g－基础撤足阈值）×100％，其中撤足阈值即为50%PWT，基础撤足阈值为－1d的50%PWT。

结果表明，与模型对照组相比，皮下给药齐考诺肽注射型皮下植入剂低、中、高剂量，大鼠给药后各时间点的MPE均明显增加（P＜0.01），且呈明显量效关系；齐考诺肽低、中、高剂量组大鼠的平均第1天MPE分别为（80.30±15.52）%、（87.12±13.21）%、（99.11±2.53）%，抗机械性疼痛的最大治疗效应均达到80%以上，表明低、中、高剂量组基本甚至完全抑制了模型大鼠的神经病理性疼痛超敏反应。低剂量组抑制了模型大鼠的神经病理性疼痛超敏反应维持在7天，中剂量组抑制了模型大鼠的神经病理性疼痛超敏反应维持在14天，高剂量组抑制了模型大鼠的神经病理性疼痛超敏反应维持28天。可见采用齐考诺肽注射型皮下植入剂给药能抑制神经病理性疼痛超敏反应维持在7－28天，具有长效止痛效果。

Claims (11)

1.一种制备齐考诺肽注射型皮下植入剂的方法，其包括以下步骤：

（1）以聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA为骨架制备齐考诺肽微囊

将PLGA完全溶解到有机溶剂中，配制成PLGA有机溶液，将齐考诺肽分散于该有机溶液中，配制成含齐考诺肽的溶液，喷雾干燥或者冷冻干燥，制得微囊；

（2）制备温度敏感型水凝胶

将温度敏感型高分子聚合物在低温条件下用水溶解混合，使温度敏感型高分子聚合物充分溶胀至溶液状态，制成水凝胶溶液；

（3）制备齐考诺肽注射型皮下植入剂

将齐考诺肽微囊粉末加入到水凝胶溶液中，混合均匀，加入冻干保护剂，进行冷冻干燥，制成齐考诺肽注射型皮下植入剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中齐考诺肽、PLGA、温度敏感型高分子聚合物与冻干保护剂的质量比为0.05-0.5:0.5-5:5-75:0.1-10。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中温度敏感型高分子聚合物为泊洛沙姆407或聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸共聚物PLGA-PEG-PLGA，聚合物平均分子量为4000-5000道尔顿。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中PLGA中乳酸LA与羟基乙酸GA的摩尔比为20:80至90:10，优选为75:25或50:50，聚合物的平均分子量为10000-50000道尔顿。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中冻干保护剂为多元糖醇，优选为甘露醇或山梨醇。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤（1）中所述的有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和丙酮。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤（1）中配制成2-20%的PLGA有机溶液。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤（1）中喷雾干燥的条件为25℃，0.2-4MPa。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤（2）中的低温条件为2-25℃。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在使用前，用0.2-2ml的灭菌注射用水将齐考诺肽注射型皮下植入剂溶解，再注入人体皮下组织即可。

11.根据权利要求1-10任一项所述的方法制备得到的齐考诺肽注射型皮下植入剂。

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