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orexin-A载药脂质体的制备方法及用于治疗发作性睡眠的药剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种orexin-A载药脂质体的制备方法及用于治疗发作性睡眠的药剂，所述orexin-A载药脂质体的制备方法包括下述步骤：a.将orexin-A多肽准确称量，用磷酸盐缓冲液配制成20μg/ml的orexin-A原液；b.称取一定量的卵磷脂、胆固醇、膜材PEG2000-DSPE，溶解于三氯甲烷中得到混合液；c.将上述混合液在常温水浴减压旋转蒸发；d.蒸干物中滴加磷酸盐缓冲液，制得水性混悬液；e.用对水性混悬液超声3～5min，冷至室温；将步骤a所得orexin-A原液加入超声后的水性混悬液中室温下磁力搅拌30min，0.45μm滤膜过滤2次，即得orexin-A载药脂质体。对该orexin-A载药脂质体进行冷冻干燥即得治疗发作性睡眠的鼻喷剂：将该鼻喷剂溶于生理盐水中即得静脉注射剂。

Description

orexin-A载药脂质体的制备方法及用于治疗发作性睡眠的药剂
技术领域
本发明涉及一种人工合成orexin-A(食欲素A)载药脂质体的制备方法，以及含有所得载药脂质体的用于治疗发作性睡眠的两种常用药剂。
背景技术
发作性睡眠病是以不可抗拒的短期睡眠发作为特点的一种疾病，多发生于儿童和青春期的青少年，成年人偶有发生。大多数学者认为，该病是由于睡眠介质紊乱引起，部分病人有脑炎和颅脑外伤史。也可以发生在免疫功能低下、脑肿瘤、多发性硬化或者情绪紧张之后。约有10％～30％的病人有家族遗传史，多数病人没有明显的诱因。发作性睡眠的发病病因尚未完全明确，但最近有学者提出自身免疫假说。研究发现，发作性睡眠和HLA一些基因变化存在着相关性，HLA的复杂多样性可以增加机体自动免疫反应的能力，从而使下丘脑神经元产生一种名为食欲素的蛋白质，其作用是控制食欲和睡眠。而患有发作性睡眠的病人，其下丘脑内能产生食欲素的神经元明显降低。治疗发作性睡眠要根据个人症状和治疗反应，治疗可能需要数月或者更长的时间，药物要经常进行调整。目前发作性睡眠的主要治疗方案是口服安非他明、甲基苯丙胺或者莫达非尼。
Orexin-A是存在于下丘脑的一种神经多肽，参与调节摄食、睡眠-觉醒周期、生殖、体温、血压、激素分泌和感觉等生理功能。1998年Yanagisawa等在大鼠下丘脑腹外侧发现了两种与食欲有关的神经肽，命名为orexin-A(食欲素-A)和orexin-B(食欲素-B)。近年来有多项研究证实orexin系统功能受损可导致多种神经系统疾病的发生，例如睡眠障碍、急性颅脑损伤、蛛网膜下腔出血等。有研究发现，发作性睡眠的发生是由于下丘脑内orexin蛋白质表达降低所导致。因此，我们推测用脂质体包裹神经多肽orexin-A可治疗发作性睡眠。
目前国际上在使用orexin治疗中枢神经系统疾病时大部分还仅限于脑室给药，然而这种给药方式易引起损伤和感染，给临床应用带诸多不便，限制了其在临床上的应用。
发明内容
为解决orexin-A治疗中脑室给药所存在的问题，本发明的目的是提供一种采用脂体包裹orexin-A的制备工艺，可以得到纳米级orexin-A脂质体，使载药脂质体更易穿透血脑屏障，增加其脑组织药物摄入量，增加orexin-A在体内的稳定性，达到了较好的疗效。
为达到以上目的，本发明是采取如下技术方案予以实现的：
一种orexin-A载药脂质体的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
a.将orexin-A多肽准确称量，用pH为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液PBS，配制成20μg/ml的orexin-A原液；
b.称取400mg卵磷脂、160mg胆固醇、96mg的膜材PEG2000-DSPE，溶解于100ml三氯甲烷中得到混合液；
c.将上述混合液在常温水浴减压旋转蒸发；
d.蒸干物中滴加10ml磷酸盐缓冲液PBS，制得水性混悬液；
e.用对水性混悬液超声3～5min，冷至室温；
f.将10ml的步骤a所得orexin-A原液加入超声后的水性混悬液中室温下磁力搅拌30min，0.45μm滤膜过滤2次，即得orexin-A载药脂质体。
上述方法中，所述步骤a中，orexin-A多肽可采用商售的产品(美国Tocris公司，No.1455)，也可采用本发明自制的orexin-A多肽，其制备方法包括以下步骤；
(1)将1g的Rink-MBHAresin树脂用10ml的DMF溶液溶胀40分钟；
(2)将溶胀后的上述Rink-MBHAresin树脂用DMF溶液洗涤三次；
(3)洗涤后的Rink-MBHAresin树脂加入10ml的DMF溶液反应20分钟；
(4)在步骤(3)反应后的溶液中加入3倍于溶液质量的Fmoc-L-Leu-OH，和4倍于溶液质量的HOBT和DIC，以及10ml的DMF溶液，反应45分钟，得到连接有多肽分子的树脂；
(5)将步骤(4)连接有多肽分子的树脂用甲醇清洗，冻干后用95％三氟乙酸溶液浸泡1～2小时，将树脂上的多肽分子切掉；将切掉多肽分子后的三氟乙酸溶液迅速倒入预冷的乙醚中，得到白色沉淀即为还原型orexin-A多肽；
(6)将还原性orexin-A多肽以浓度为0.5-1mg/ml的量加入PH值为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液PBS中，并用1％的H2O2氧化，12-36小时后停止氧化，得到氧化的orexin-A多肽。
本发明的另一目的是提供两种治疗发作性睡眠的常用药剂，其中之一为鼻喷剂，该鼻喷剂的特征在于：对本发明前述方法所得的orexin-A载药脂质体进行冷冻干燥即可。另一种为静脉注射剂，该静脉注射剂的特征在于：对经冷冻干燥所得鼻喷剂，将其溶解于生理盐水中即可临床使用。
与现有莫达非尼作为已知的治疗发作性睡眠的药物相比，通过动物实验，本发明的优点在于：
1、在制备工艺中可通过分次载药提高载药率，通过超声处理和滤膜过滤相结合降低脂质体粒径，可以得到纳米级orexin-A脂质体。
2、采用本发明脂质体包裹orexin-A可以防止orexin-A被体内的酶所降解，从而提高其稳定性，延长其体内半衰期，具有较好的发挥orexin-A生物活性的能力。
3、本发明所提供的orexin-A脂质体鼻喷剂(或注射剂)可明显提高大鼠觉醒时间，从而提高治疗发作性睡眠的疗效。
此外，由于orexin-A是正常存在于人体中的一种神经多肽，因此就开发成药品的角度而言，其具有毒副作用小，对正常生理功能干扰小等独特优势，研制开发orexin-A类药物用于治疗发作性睡眠具有广泛的应用前景。
说明书附图
图1为传统工艺与改良工艺脂质体包封率比较。
图2为orexin-A脂质体、orexin-A与空白组12h活动时间比较。
图3为orexin-A给药前与给药后12h活动时间比较
图4为orexin-A不同剂量组24h总体活动时间。
图5为orexin-A与莫达非尼给药前后12h活动时间。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种orexin-A载药脂质体的制备方法，包括下述步骤：
a、准确称量orexin-A，用pH＝7.2-7.6的PBS(磷酸盐缓冲液)配制成质量浓度为20μg/mlorexin-A原液；其中orexin-A多肽采用商售的产品(美国Tocris公司，No.1455)；
b、称取卵磷脂400mg，胆固醇160mg，膜材PEG2000-DSPE(长循环脂质体)96mg，溶解于100ml三氯甲烷中得到混合液；
c、将上述混合液于30℃水浴减压旋转蒸发；
d、蒸干后滴加PBS溶液10ml，制得水性混悬液；
e、探头式超声仪超声3min，冷至室温；
f、将orexin-A原液5ml加入水性混悬液中超声1min后，再加入orexin-A原液5ml，室温下磁力搅拌30min，0.45μm滤膜过滤2次，即得orexin-A载药脂质体，终浓度10μg/ml。所得载药脂质体平均粒径54.5±5.6nm，包封率也从原来的72％提高到98％(图1)。
对所得脂质体微囊和包裹于其中的神经多肽食欲素-A，可应用制备治疗发作性睡眠的凝胶剂、喷雾剂、溶液剂、混悬剂、粉针剂。例如对实施例1所制备的orexin-A载药脂质体进行冷冻干燥即得鼻喷剂。或将该orexin-A载药脂质体的鼻喷剂溶于生理盐水中，可用于腹腔及静脉注射。
实施例2
另一种orexin-A载药脂质体的制备方法，与实施例1不同的是，其中的orexin-A多肽采用自制的合成orexin-A，包括下述步骤：
合成原料：多肽合成用树脂Rink-MBHAresin(美国默克公司出品)
有机溶剂：DMF(二甲基甲酰胺)，甲醇，乙醚。TFA(三氟乙酸)溶液
其它试剂：1-羟基苯并三唑(HOBT)，N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)
①称取1g的Rink-MBHAresin树脂用10mlDMF溶胀40分钟。
②溶胀后的上述Rink-MBHAresin树脂用DMF洗涤三次
③洗涤后的RinK-MBHAresin树脂加入10ml的DMF溶液反应20分钟，脱去树脂上的Fmoc保护基团。
④在步骤③反应后的溶液中加入3倍量的Fmoc-L-Leu-OH(金思特科技有限公司生产的)，和4倍量的HOBT，DIC，以及10ml的DMF，反应45分钟，反应后得到连接有多肽分子的树脂，并用茚三酮检验连接效率。
⑤将连接有多肽分子的树脂用甲醇清洗，冻干后用质量浓度95％TFA溶液浸泡2小时，树脂上的多肽分子被切掉，进入TFA溶液中，将溶液迅速倒入预冷的乙醚中，得到白色沉淀，然后通过HPLC(高效液相色谱法)纯化，得到纯度大于98％的产品，即为还原型orexin-A多肽。
⑥将还原性orexin-A多肽以浓度为0.5-1mg/ml的量加入PH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中溶解，用质量浓度1％的H2O2氧化，12-36小时后停止氧化，通过HPLC监测并纯化，得到氧化的orexin-A多肽。通过质谱检验，比对氧化的样品和标准对照品。
鼻腔注射orexin-A，监测大鼠觉醒时间
1.实验方法
1.1动物分组及实验计划
1.1.1orexin-A与orexin-A脂质体(本发明实施例1所得orexin-A载药脂质体)比较
此部分实验共采用18只SD大鼠，随机分为3组：对照组、orexin-A组、orexin-A脂质体组。三组每隔4小时分别鼻腔注射相应剂量生理盐水(0.1ml)、orexin-A脂质体10μg/kg(用PBS溶解稀释成0.1ml)、orexin-A10μg/kg(用PBS溶解稀释成0.1m)，放于视频系统下观察大鼠12小时内总体活动时间。
1.1.2orexin-A脂质体与空白组自体比较
此部分实验共采用12只SD大鼠。实验第1日所有大鼠均每隔4小时给予生理盐水，放于视频系统下观察大鼠12小时内总体活动时间，作为该大鼠活动时间标准。实验第2日，大鼠每隔4小时鼻腔注射orexin-A脂质体30μg/kg(用PBS溶解稀释成0.5ml)，放于视频系统下观察大鼠12小时内总体活动时间。
1.1.3orexin-A脂质体与空白组异体比较
此部分实验采用24只SD大鼠，随机分为3组：对照组、orexin-A脂质体30μg/kg组(OXA-30)、orexin-A脂质体100μg/kg组(OXA-100)。三组每隔6小时分别鼻腔注射溶剂(NaCl，0.5ml)或相应剂量的orexin-A脂质体(0.5ml，用PBS溶解稀释成不同浓度)，放于视频系统下观察大鼠24h内总体活动时间。
1.1.4orexin-A脂质体与莫达非尼组比较
根据第三部分实验结果，我们选择30μg/kg作为orexin-A脂质体治疗组的给药剂量，与已知可以治疗发作性睡眠的的药物莫达非尼进行比较，进一步检验其治疗发作性睡眠的效果。此部分实验采用12只SD大鼠，随机分为2组：莫达非尼组、orexin-A脂质体30μg/kg组(OXA-30)。实验第1日所有大鼠均每隔4小时给予生理盐水，放于视频系统下观察大鼠12小时内总体活动时间，作为该大鼠活动时间标准。实验第2日，OXA-30组大鼠每隔4小时鼻腔注射给药30mg/kg，对照组每隔4小时莫达非尼灌胃50mg/kg，放于视频系统下观察大鼠12小时内总体活动时间。
1.2统计学处理
采用SPSS13.0统计分析软件进行所用实验数据统计学分析。计量资料用x±s表示，采用非参数检验(Kruskal-Wallis H法)，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2.实验结果
2.1orexin-A与orexin-A脂质体比较
图2示出了orexin-A脂质体、orexin-A与空白组12h活动时间比较。表1显示大鼠12h内平均总体活动时间。通过鼻腔注射orexin-A与orexin-A脂质体均能明显提高大鼠12h内总体活动时间，且OXA脂质体组优于OXA组，对于提高大鼠总体活动时间有统计学意义(P＜0.05)。
表1
Figure BDA0000057869030000061
2.2orexin-A脂质体与空白组自体比较
图3示出了orexin-A给药前与给药后12h活动时间比较，表2显示大鼠12h内平均总体活动时间。通过鼻腔注射orexin-A脂质体能明显提高大鼠12h内总体活动时间。给药后对于提高大鼠总体活动时间有统计学意义(P＜0.05)。
表2
Figure BDA0000057869030000062
2.3orexin-A脂质体与空白组异体比较
图4示出了orexin-A不同剂量组24h总体活动时间，表3显示各组大鼠24h内平均总体活动时间。通过鼻腔注射orexin-A脂质体能明显提高大鼠24h内总体活动时间。给药组与对照组相比有明显统计学差异(P＜0.05)。
表3
Figure BDA0000057869030000071
2.4与莫达非尼比较
图5示出了orexin-A与莫达非尼给药前后12h活动时间。表4显示两组大鼠12h内平均总体活动时间。通过鼻腔注射orexin-A脂质体和莫达非尼灌胃均能明显提高给予生理盐水的大鼠12h内的总体活动时间，并且OXA-30组的效果明显优于莫达非尼组。
表4
Figure BDA0000057869030000072
3.结论
结果表明，外源性给予orexin-A纳米脂质体可明显提高大鼠活动时间，其中以食欲素A脂质体制备成30μg/kg或100μg/kg，用于治疗发作性睡眠效果最佳。
本发明上述实验证实外源性给予orexin-A纳米脂质体具有延长动物活动时间的作用。由于orexin-A是正常存在于人体中的一种神经多肽，因此就开发成药品的角度而言，其具有毒副作用小，对正常生理功能干扰小等独特优势。我们有理由相信，研制开发orexin-A类药物，改变患者体内的orexin-A，将会对治疗发作性睡眠有良好的疗效。

Claims (4)

1.一种orexin-A载药脂质体的制备方法，其特征在于，包括下述步骤
a.将orexin-A多肽准确称量，用pH为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液PBS，配制成20μg/ml的orexin-A原液；
b.称取400mg卵磷脂、160mg胆固醇、96mg的膜材PEG2000-DSPE，溶解于100ml三氯甲烷中得到混合液；
c.将上述混合液在常温水浴减压旋转蒸发；
d.蒸干物中滴加10ml磷酸盐缓冲液PBS，制得水性混悬液；
e.用对水性混悬液超声3～5min，冷至室温；
f.将10ml的步骤a所得orexin-A原液加入超声后的水性混悬液中室温下磁力搅拌30min，0.45μm滤膜过滤2次，即得orexin-A载药脂质体。
2.根据权利要求1所述的orexin-A载药脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤a中的orexin-A多肽的制备方法包括下述步骤；
(1)将1g的Rink-MBHAresin树脂用10ml的DMF溶液溶胀40分钟；
(2)将溶胀后的上述Rink-MBHAresin树脂用DMF溶液洗涤三次；
(3)洗涤后的Rink-MBHAresin树脂加入10ml的DMF溶液反应20分钟；
(4)在步骤(3)反应后的溶液中加入3倍于溶液质量的Fmoc-L-Leu-OH，和4倍于溶液质量的HOBT和DIC，以及10ml的DMF溶液，反应45分钟，得到连接有多肽分子的树脂；
(5)将步骤(4)连接有多肽分子的树脂用甲醇清洗，冻干后用95％三氟乙酸溶液浸泡1～2小时，将树脂上的多肽分子切掉；将切掉多肽分子后的三氟乙酸溶液迅速倒入预冷的乙醚中，得到白色沉淀即为还原型orexin-A多肽；
(6)将还原性orexin-A多肽以浓度为0.5-1mg/ml的量加入PH值为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液PBS中，并用1％的H2O2氧化，12-36小时后停止氧化，得到氧化的orexin-A多肽。
3.一种治疗发作性睡眠的鼻喷剂，其特征在于，该鼻喷剂为：对权利要求1所述的orexin-A载药脂质体进行冷冻干燥所得。
4.一种治疗发作性睡眠的静脉注射剂，其特征在于，该静脉注射剂为：对权利要求3所述的经冷冻干燥所得鼻喷剂溶于生理盐水中获得。
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