CN115737785A - 多肽C16与血管生成素Ang-1的复合制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了多肽C16与血管生成素Ang‑1的复合制剂及其应用，利用纳米材料的优势，结合血脑屏障的解剖学和生理学特征，开发新的脑内药物递送系统，达到穿透血脑屏障治疗神经退行性疾病的最佳效果。是可以针对炎症局部进行靶向性运送药物的载体，白细胞趋化性肽fMLP所修饰的脂质体是装载蛋白多肽类生物药物的良好选择，解决Ang‑1+C16复合药物的给药问题。

Description

多肽C16与血管生成素Ang-1的复合制剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别地，涉及多肽C16与血管生成素Ang-1的复合制剂及其应用。

背景技术

目前临床主要抗炎治疗手段：肾上腺糖皮质激素，非甾体抗炎药物，抗生素等等，但疗效并不理想。滥用抗生素，尤其是广谱抗生素，会导致体内菌群失调，出现呕吐、恶心等症状，加剧病情。抗菌素有许多副作用，如白细胞下降,就会进一步降低机体的抗病能力。抗菌素对胃肠道黏膜的刺激出现药物性胃炎，肠道菌群失调，长期使用抗菌素，或高级抗菌素，广谱或联合使用抗菌素。肠道内一些非致病菌被杀灭，出现菌群失调，破坏肠道内微生物平衡，而出现肠道疾病。甚至出现伪膜性肠炎，机会菌--霉菌二重感染，一些非致病菌由于失去了相互制约,而成为致病菌。

长程使用糖皮质激素可引起皮质功能亢进综合征。满月脸、水牛背、高血压、多毛、糖尿、皮肤变薄、体重增加、下肢浮肿、紫纹、易出血倾向、创口愈合不良、痤疮、月经紊乱、肱或股骨头缺血性坏死、骨质疏松及骨折(包括脊椎压缩性骨折、长骨病理性骨折)、肌无力、肌萎缩、低血钾综合征、胃肠道刺激(恶心、呕吐)、胰腺炎、消化性溃疡或穿孔，儿童生长受到抑制、青光眼、白内障、良性颅内压升高综合征、糖耐量减退和糖尿病加重。患者可出现精神症状：欣快感、激动、谵妄、不安、定向力障碍，也可表现为抑制。并发以真菌、结核菌、葡萄球菌、变形杆菌、绿脓杆菌和各种疱疹病毒为主的感染。患者在停药后出现头晕、昏厥倾向、腹痛或背痛、低热、食欲减退、恶心、呕吐、肌肉或关节疼痛、头疼、乏力、软弱。

长期使用免疫抑制剂治疗可造成系统和器官的不良反应，如硫唑嘌呤，麦考酚酸酯和米托蒽醌，可导致患者发生上消化道出血，无菌性骨坏死，白细胞下降，肝肾功能损害。血浆置换和免疫调节剂对缓解疾病的复发有一定作用，但价格昂贵，长期应用加重患者的经济负担。近年来国内外学者在中药治疗，基因治疗，自体造血干细胞移植等方面也做了大量的探索性研究，但是中药成分复杂，毒副作用较难以控制；基因治疗本身是一把双刃剑，病毒载体的使用更易产生严重的副作用。T细胞疫苗，干细胞移植目前都还处于实验探索阶段，临床治疗应用很少，且远期效应有待进一步观察。因此目前尚缺乏经济、安全、长效的治疗方法。

无论哪种机制所导致的炎症，都要经历血管通透性增加和炎性细胞贴附管壁，穿越血管内皮细胞层，从血管内游走到组织中这一过程。所以，只要阻断炎性细胞的贴壁，游走穿越，并尽量降低血脑屏障的通透性，就可以在相当程度上减轻炎症和改善其内部的微环境。

血脑屏障将中枢神经系统和外周血循环分隔开,能限制免疫细胞进入中枢神经系统。在正常生理条件下淋巴细胞通过血脑屏障向脑实质浸润非常少，近年来有报道认为即使受损的血脑屏障依然可以有效控制炎性细胞募集进入中枢神经系统，因此单纯的血脑屏障物理结构破坏不能解释免疫细胞的中枢神经系统浸润。除了物理性的血脑屏障,白细胞向中枢神经系统浸润受到细胞粘附分子、趋化因子和基质金属蛋白酶的调控。因此靶向血脑屏障和黏附分子(整合素)的研究对于神经系统炎症反应有着十分重要的现实意义和临床应用价值。

整合素(integrin)不仅是在保持细胞与其周围环境之间相互作用中起机械稳定性作用的黏附分子，而且是血管内炎性细胞的贴壁，黏附，变形和穿越血管壁的重要介导成分。研究表明，多种炎性细胞如单核细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的表面都表达多种整合素，而这些炎性细胞如需定向穿越血管内皮细胞层，从血管内游走到炎性组织中，则有赖于这些细胞表面的整合素分子与血管内皮细胞表面的整合素受体结合，从而诱导炎性细胞内细胞骨架重排细胞发生形变，炎细胞才能通过血管内皮细胞间隙。如果阻断这种结合，炎细胞的逸出和浸润也将被阻止。

C16(KAFDITYVRLKF)是血管内皮细胞所附着的基底膜上的重要基质分子层粘蛋白(laminin)r1链上的多肽，具有识别并与整合素(integrin)αvβ3和α5β1特异性结合的作用。研究发现，在加入C16多肽的体外培养体系中，受TransweII培养板下池中IL-16的趋化作用T淋巴细胞从血管内皮细胞层的一侧穿越到另一侧的数目较对照组明显减少。C16对培养的THP-1单核细胞穿越血管内皮细胞层的阻滞作用与直接使用αvβ3抗体相近。这些结果表明，C16不但可以通过与炎性细胞表面的整合素分子αvβ3结合，竞争性阻止其识别与结合血管内皮细胞表面的整合素受体，也可能与血管内皮细胞表面所表达的αvβ3结合，同样竞争性地阻止其与炎性细胞上的相应配体结合，从而导致炎细胞骨架结构变形，游走穿过血管内皮细胞间隙的动态过程。

既往研究显示，血管生成素-1(Angiopoietin1，Ang-1)和受体Tie2结合后，Tie2受体磷酸化，功能活化的Tie2不仅可以吸引血管平滑肌细胞、周细胞等血管周围细胞包围、支持内皮细胞形成完整的血管壁，促进血管成熟并维持血脑屏障的稳定，而且可以通过细胞-细胞间的紧密连接、细胞-基质等相互作用维持血管结构。Ang-1/Tie-2通路对血管通透性的调控是通过内皮细胞内PI3K/Akt信号通路来介导的。研究显示，内皮细胞内PI3K/Akt信号通路具有多种调节作用，包括抗内皮细胞凋亡，促进内皮细胞迁移，促进新生血管重塑以及抑制炎症基因表达等。而增强Ang-1/Tie-2信号通路活性后，胞内的PI3K/Akt磷酸化水平随之增加，说明Ang-1/Tie-2通路对PI3K/Akt信号通路具有激活作用。研究发现，Ang-1具有促进血管内皮细胞存活，降低损伤局部血管通透性和抑制T淋巴细胞逸出的效应，在与C16多肽联合使用时可产生一定的协同作用，进一步促进损伤后的功能恢复。

值得注意的是，“那它珠单抗”(整合素α4的抗体，拮抗剂)应用于视神经脊髓炎无治疗作用，而C16多肽在视神经脊髓炎、多发性硬化的动物模型上却能发挥效应。推测其原因，不仅与不同的αβ结合链有关，而且提示单独的免疫黏附抑制，作用效果有限。C16不但可以竞争性地阻止炎性细胞穿越游走，向血管外组织中逸出的进程，而且还是整合素αvβ3和α5β1特异性激活剂。活化的整合素分子可激活PI3K/Akt信号通路，αvβ3和α5β1的活化还可以促进Tie-2的磷酸化，并有利于Ang-1/Tie-2结合，反过来Ang-1/Tie-2也可通过PI3K途径来活化整合素，形成正反馈。Tie-2/αvβ3与Tie-2/α5β1相互作用也可以通过选择性地刺激PI3K/Akt信号通路，来提高Ang-1的效应。这一切提示在机体存在整合素、Ang-1/Tie-2互活化作用机制。

所以，把二者以一定比例配合起来制成混合制剂，可以起到互相促进，互相提高效应，相辅相成的作用。专利WO2009114539公开了Ang-1和C16的复合制剂，调节血管通透性，减轻炎症细胞浸润。动物实验中，给药后全血细胞计数显示，除了轻度的血小板计数降低之外，C16对机体全身免疫系统并没有抑制作用。这些现象均提示，C16多肽具有抑制T淋巴细胞血管外逸和组织内浸润的效应。可减轻局部炎性细胞浸润，但却没有全身免疫抑制的副作用，是一种相对安全的药物。由于C16与Ang-1的主要作用靶点是在血管内，作用于血管内皮细胞，药物并不需要穿越血脑屏障到神经组织中去，更加快速有效和安全；而在血脑屏障破坏严重的脑区内，进入神经系统的C16+Ang-1混合制剂，更有可能通过激活前述的PI3K/AKt信号通路，以减少小胶质细胞的活化，促进血管内皮细胞存活和稳定，保护血管内皮细胞的紧密连接。该药物的具体配方组成：C16多肽(溶于0.3％醋酸)溶液混合Ang-1蛋白(溶于双蒸水)。其终浓度均为2mg/ml。该药物已在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)、肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、多发性硬化(multiplesclerosis,MS)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)等一系列中枢神经系统炎性疾病中发现有效，是一种并非针对某一种特殊疾病的，非特异性抗炎药物。在表现出神经系统炎症的神经退行性疾病中可有治疗效应。

虽然现有研究已表明Ang-1+C16复合药物在抗炎的同时没有抑制全身免疫系统的危险，但其他可能产生的毒副作用尚待阐明。同时，C16多肽溶于偏酸性溶剂，而血管生成素Ang-1溶于中性溶剂。两者混合后溶液仍偏酸，在过滤除菌后需要将药剂的pH值重新调至适合人体的pH 7.4左右，但此时易产生沉淀，影响药物的利用率。此外，蛋白混合制剂口服会被破坏，肌肉注射不易进入血管，静脉注射则由于偏酸性药物溶剂具有一定的血管刺激性，长时间用药有可能会引起静脉炎。这些弊端极大地限制了其血管内给药的治疗。

近年来载药体系的发展，尤其是纳米载药体系在增强疗效、降低毒性、提高患者耐受性等方面表现出了独特的优势，具有易于在生物体内降解、无毒性和无免疫原性等特点,越来越受到人们的重视并得到广泛的应用于神经退行性疾病。例如，固体脂质纳米粒，脂质体，纳米乳，微胶粒等多种纳米载体都曾被被应用于神经退行性疾病的治疗。外泌体作为天然内源性纳米载体递送药物，避免了单核吞噬细胞系统的清除以及免疫排斥，是极具前景的治疗阿尔茨海默病药物新载体。金纳米粒子带负电荷，由神经生长因子受体介导内吞作用穿透血脑屏障，可以减少黑质纹状体多巴胺能神经元的凋亡，在体外和体内对帕金森病模型都具有良好的治疗效果。固体脂质体纳米颗粒和聚乳酸羟基乙酸具有良好的生物相容性、可生物降解、缓释及靶向作用等优势，已被美国FDA批准应用于亨廷顿病的治疗。在这个系统中，固体脂质纳米粒是目前公认输送药物的优良载体，其最出色的优势体现在高比表面积(可提供较高的药物载量)、离子表面带电荷(有助于药物结合或官能化)、可与配体(如抗体、靶向肽)结合实现靶向特异性等方面，如今，对该药物的研究已被应用于ADS，PD，MS等多种与严重相关的神经退行性疾病上。然而，固体脂质纳米粒载药量一般只有1％-5％。虽然也有提高载药量的报道，但过高的载药量又可能导致固体脂质纳米粒凝胶化。此外，固体脂质纳米粒在存放过程中稳定性差，可能发生粒径增长或药物降解等现象。上述问题限制了纳米颗粒(NPs)的广泛应用。目前作为载药系统的载体材料一般都倾向于选择生物可降解型的高分子材料，以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)为代表，它具有良好的生物相容性，不会在重要器官发生聚集，在人体内代谢的中间产物乳酸是体内糖代谢的产物，最终产物是二氧化碳和水，因此被美国FDA批准为药物辅料，广泛应用于制药、医用工程材料和药物缓释剂。PLGA纳米颗粒作为纳米载药系统的载体，一般指直径为101-103nm之间的颗粒，其载药体系是将药物或具有生物活性的物质通过溶解、包裹等作用包埋于纳米颗粒内部，或通过附着、静电吸附等作用定位于纳米颗粒表面。这种体系的主要优点是可以在保证药效的前提下，减少给药次数，从而降低药物对机体的毒副作用；可实现靶向运输和定位给药；可控制药物缓释，延长其在体内的半衰期等。

发明内容

本发明目的在于提供多肽C16与血管生成素Ang-1的复合制剂及其应用，以解决多肽C16与血管生成素Ang-1组合给药方面的技术问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种多肽C16与血管生成素Ang-1的复合制剂，其有效成分为偶联fMLP的载多肽C16脂质体与偶联fMLP的载血管生成素Ang-1脂质体，两者摩尔比为8：1。

优选的，血管生成素Ang-1、多肽C16的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示；

血管生成素Ang-1：

KLENYIVENMKSEMAQIQQNAVQNHTATMLEIGTSLLSQTAEQTRKLTDVETQVLNQTSRLE IQLLENSLSTYKLEKQLLQQTNEILKI，如SEQ ID NO.1所示；

多肽C16：

KAFDITYVRLKF，如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述偶联fMLP的载多肽C16脂质体或偶联fMLP的血管生成素Ang-1脂质体是通过以下制备方法得到的：先以DSPE-mPEG2000-NH₂(二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基交联物)与fMLP为原料交联反应得到DSPE-PEG2000-fMLP，然后将其与多肽C16或血管生成素Ang-1反应即得。

进一步优选的，DSPE-PEG2000-fMLP的制备方法如下：先将DSPE-mPEG2000-NH₂、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、fMLP溶于甲醇中，37℃搅拌反应2小时，干燥，即得。

更进一步优选的，DSPE-mPEG2000-NH₂、EDC、NHS、fMLP、甲醇的用量比为150mg：10.3mg：6.2mg：25mg：2mL。

进一步优选的，DSPE-PEG2000-fMLP与多肽C16或血管生成素Ang-1的反应方法如下：先将DSPE-mPEG2000、DSPE-PEG2000-fMLP溶于质量浓度5％葡萄糖溶液中，接着加入多肽C16或血管生成素Ang-1，冰水浴超声处理15分钟，0.22μm滤膜过滤纯化即可。

更进一步优选的，与血管生成素Ang-1反应时，DSPE-mPEG2000、DSPE-PEG2000-fMLP、多肽的摩尔比为6：2：1，DSPE-mPEG2000与葡萄糖溶液的质量体积比为39.4mg：3mL。

更进一步优选的，与多肽C16反应时，DSPE-mPEG2000、DSPE-PEG2000-fMLP、多肽的摩尔比为3：1：1，DSPE-mPEG2000与葡萄糖溶液的质量体积比为268.8mg：22mL。

本发明提供了上述一种多肽C16与血管生成素Ang-1的复合制剂在制备中枢神经系统炎性疾病治疗药物中的应用。

(其中原材料的用量除了DSPE-mPEG2000-NH₂的量为固定值150mg，其他组分可上下波动1mg，但按照上述配比制备的脂质体包封率最高)

本发明具有以下有益效果：

fMLP是最早发现的白细胞趋化性肽，最新研究提出fMLP具有强大的白细胞趋化活性，它通过与靶细胞表面的甲酰肽受体(FPR)结合可高效激活吞噬细胞，诱导机体的趋化反应、细胞脱颗粒以及失敏反应等，对机体的炎症反应和天然免疫起着重要作用。基于炎症时白细胞增多的特点，胆固醇上共价修饰fMLP，构建fMLP修饰的脂质体，可以将多肽药物靶向递送到深层次的炎症部位，为增强炎症病灶传递提供了新的策略。本申请通过白细胞趋化性肽fMLP修饰的脂质体可以提高脂质体向炎症病灶的传递能力。

本发明利用纳米材料的优势，结合血脑屏障的解剖学和生理学特征，开发新的脑内药物递送系统，达到穿透血脑屏障治疗神经退行性疾病的最佳效果。是可以针对炎症局部进行靶向性运送药物的载体白细胞趋化性肽fMLP所修饰的脂质体是装载蛋白多肽类生物药物的良好选择，解决血管生成素Ang-1和C16多肽复合药物的给药问题。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是偶联fMLP的载12肽脂质体的水动力尺寸(偶联后)；

图2是偶联fMLP的载12肽脂质体的Zeta电位(偶联后)；

图3是偶联fMLP的载血管生成素脂质体的电镜图；

图4是偶联fMLP的载12肽脂质体的电镜图；

图5是偶联fMLP的载血管生成素脂质体的荧光光谱图；

图6是偶联fMLP的载12肽脂质体的荧光光谱图；

图7是大鼠实验结果，其中，A为行为学结果，B为皮质体感电位，C为皮质运动电位；

图8是C16+Ang-1组、载16肽脂质体+载Ang-1脂质体组、偶联fMLP的载16肽脂质体+偶联fMLP的载Ang-1脂质体组通过血脑屏障和血脊髓屏障的图，其中，A-C为药物通过血脑屏障在神经组织内弥散，D-F为药物通过在神经组织内弥散血脊髓屏障，G-I为A-C的局部放大图，J-L为D-F的局部放大图。

图9为新西兰大白兔耳缘实验结果，其中，A-B为C+A直接注射组，C-D为脂质体载药组。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

本发明所使用的实验试剂和仪器见表1和表2。

表1.实验试剂

表2.实验仪器

应用实施例1：

精密称取DSPE-PEG2000-NH₂ 150mg，EDC 10.3mg，NHS 6.2mg，fMLP 25mg溶于2mL甲醇中，37℃反应2h，干燥，得DSPE-PEG2000-fMLP粉末。

应用实施例2：

称取13.1mg DSPE-mPEG2000溶于2mL 5％葡萄糖溶液中，加入6.0mg血管生成素(摩尔比DSPE-mPEG2000：血管生成素＝8：1)和微量2M NaOH助溶，水浴超声，0.22μm滤膜过滤纯化，得载血管生成素脂质体。

应用实施例3：

精密称取89.6mg DSPE-mPEG2000溶于6mL 5％葡萄糖溶液中，加入12.0mg 12肽(摩尔比DSPE-mPEG2000：12肽＝4：1)，水浴超声，0.22μm滤膜过滤纯化，得载12肽脂质体。

实施例1：

精密称取39.4mg DSPE-mPEG-2000，14.9mg DSPE-PEG2000-fMLP溶于3mL 5％葡萄糖溶液中，加入24.0mg血管生成素(摩尔比DSPE-mPEG-2000：DSPE-PEG2000-fMLP：血管生成素＝6：2：1)和微量2M NaOH助溶，水浴超声，0.22μm滤膜过滤纯化，得偶联fMLP的载血管生成素脂质体。

实施例2：

精密称取101.7mg DSPE-PEG2000-fMLP，268.8mg DSPE-mPEG2000溶于22mL5％葡萄糖溶液中，48.0mg 12肽(摩尔比DSPE-mPEG-2000：DSPE-PEG2000-fMLP：12肽＝3：1：1)，水浴超声，0.22μm滤膜过滤纯化，得偶联fMLP的载12肽脂质体。

检测表征

1、多肽包封率检测

两亲性磷脂介导多肽的溶解并形成脂质体，超滤后滤液澄清透亮无荧光，表明多肽全部被包封。

2、Zeta电位、水动力尺寸检测

检测结果：

12肽脂质体水动力尺寸(偶联后)见图1，Zeta电位(偶联后)见图2，具体数据见表3。

表3.12肽脂质体室温水动力尺寸和Zeta电位检测结果

12肽本身带正电荷，被偶联fMLP的磷脂包载并形成脂质体后显示磷脂和fMLP所携带的负电荷。

注：fMLP为先修饰磷脂，后制备成脂质体，故无需检测偶联前水动力尺寸和Zeta电位。

4、透射电子显微镜检测

偶联fMLP的载血管生成素脂质体的电镜图见图3，根据电镜图像，脂质体粒径在25-40nm左右，形状规整，尺寸较为均一。

偶联fMLP的载12肽脂质体的电镜图见图4，根据电镜图像，脂质体粒径在25-40nm左右，形状规整，尺寸较为均一，与DLS检测结果大致相符。

5、荧光光谱检测

偶联fMLP的载血管生成素脂质体的荧光光谱见图5，偶联fMLP的载12肽脂质体的荧光光谱见图6。检测结果显示，偶联fMLP的载血管生成素脂质体最大吸收波长在601nm，偶联fMLP的载12肽脂质体最大吸收波长在688nm，与理论上的565nm和670nm有所偏差，可能是因为荧光基团位于激发态时通过振动弛豫消耗了部分能量，或因为磷脂分子、多肽与荧光基团碰撞损失了部分能量，产生了Stokes位移。

综上，荧光光谱检测结果表明，多肽被成功包载进脂质体内；水动力尺寸、电子显微镜检测表明多肽颗粒均一，形状规整，分散性良好；Zeta电位检测表明颗粒表面带负电荷，说明多肽被包载到了脂质体内部，表面只显示磷脂和fMLP所携带的负电荷。

本发明的方法脂质体包封率大于80％。

动物实验

以豚鼠脊髓匀浆为抗原致敏DA大鼠建立急性EAE模型。

以豚鼠脊髓匀浆(Guinea pig spinal cord homogenate，GPSCH)与弗氏完全佐剂(completeFreund adjuvant，CFA)均匀混合抽打成油包水状作为抗原佐剂乳化物。豚鼠用戊巴比妥钠麻醉后(50mg/kg，腹腔注射)，以预冷的冰生理盐水心脏灌注至右心房流出液清亮时，小心取出豚鼠脊髓，挑去脊膜及血管，称量，加等量的完全弗氏佐剂，用注射器反复抽打，制成油包水状。DA大鼠尾根部皮肤常规消毒后，进行单点皮下注射抗原佐剂乳化物0.2mL。正常对照组动物注射同等剂量CFA+生理盐水。免疫当日及免疫后所有动物每日观察大鼠饮食、活动情况，并称量体重。

大鼠神经功能评分标准如下：0分，无明显异常；1分，尾巴无力松弛；2分，行动迟缓，轻度共济失调；3分，后肢无力；4分，后肢麻痹；5分，四肢麻痹或死亡。

在图7中，(A)：行为学结果显示，多发性硬化实验动物的功能障碍程度分为：0级：无症状；1级，部分尾巴下垂；2级，完全尾巴下垂；3级，完全尾巴下垂，后肢部分瘫痪；4级，后肢完全瘫痪；5级，濒死状态。对照组实验大鼠造模两周后，功能障碍多在四级到五级之间，而C16和Ang-1常规注射给药组和普通脂质体包裹的给药组在3级左右，fmlp-普通脂质体包裹的给药组可降至2级左右。(B，C)：电生理结果显示，对照组实验大鼠造模两周后，皮质体感电位(B)和皮质运动电位(C)都可出现潜伏期延长(表示神经传导速度下降)以及波幅降低(表示存活的神经纤维数量减少)，而C16和Ang-1常规注射给药组，普通脂质体包裹的给药组以及fmlp-普通脂质体包裹的给药组都可起到减轻的作用，其中又以fmlp-普通脂质体包裹的给药组最为明显。

图8为C16+Ang-1组、载16肽脂质体+载Ang-1脂质体组、偶联fMLP的载16肽脂质体+偶联fMLP的载Ang-1脂质体组通过血脑屏障的图，其中，A-C为血脑屏障，D-F为血脊髓屏障，G-I为A-C的局部放大图，J-L为D-F的局部放大图。从图8可以看出fmlp-普通脂质体包裹的C16(红色标记G-I)和Ang-1(蓝色标记J-L)分子均可通过血脑屏障(A-C)和血脊髓屏障(D-F)，进入到神经组织中。

在图9中，新西兰大白兔耳缘实验显示，在大白兔耳缘静脉直接注射C16+Ang-1溶液(偏酸性)，局部会出现红肿，血管周围出现刺激导致的渗出和炎细胞浸润(A-B，红色箭头)。而使用了纳米粒包裹的，局部未出现明显的血管刺激症状(C-D)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种多肽C16与血管生成素Ang-1的复合制剂，其特征在于，其有效成分为偶联fMLP的载多肽C16脂质体与偶联fMLP的载血管生成素Ang-1脂质体，两者摩尔比为8：1。

2.根据权利要求1所述的复合制剂，其特征在于，血管生成素Ang-1、多肽C16的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；

血管生成素Ang-1：

KLENYIVENMKSEMAQIQQNAVQNHTATMLEIGTSLLSQTAEQTRKLTDVETQVLNQTSRLE IQLLENSLSTYKLEKQLLQQTNEILKI，如SEQ ID NO.1所示；

多肽C16：

KAFDITYVRLKF，如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的复合制剂，其特征在于，所述偶联fMLP的载多肽C16脂质体或偶联fMLP的血管生成素Ang-1脂质体是通过以下制备方法得到的：先以DSPE-mPEG2000-NH₂与fMLP为原料交联反应得到DSPE-PEG2000-fMLP，然后将其与多肽C16或血管生成素Ang-1反应即得。

4.根据权利要求3所述的复合制剂，其特征在于，DSPE-PEG2000-fMLP的制备方法如下：先将DSPE-mPEG2000-NH₂、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、fMLP溶于甲醇中，37℃搅拌反应2小时，干燥，即得。

5.根据权利要求4所述的复合制剂，其特征在于，DSPE-mPEG2000-NH₂、EDC、NHS、fMLP、甲醇的用量比为150mg：10.3mg：6.2mg：25mg：2mL。

6.根据权利要求3所述的复合制剂，其特征在于，DSPE-PEG2000-fMLP与多肽C16或血管生成素Ang-1的反应方法如下：先将DSPE-mPEG2000、DSPE-PEG2000-fMLP溶于质量浓度5％葡萄糖溶液中，接着加入多肽C16或血管生成素Ang-1，冰水浴超声处理15分钟，0.22μm滤膜过滤纯化即可。

7.根据权利要求6所述的复合制剂，其特征在于，与血管生成素Ang-1反应时，DSPE-mPEG2000、DSPE-PEG2000-fMLP、多肽的摩尔比为6：2：1，DSPE-mPEG2000与葡萄糖溶液的质量体积比为39.4mg：3mL。

8.根据权利要求6所述的复合制剂，其特征在于，与多肽C16反应时，DSPE-mPEG2000、DSPE-PEG2000-fMLP、多肽的摩尔比为3：1：1，DSPE-mPEG2000与葡萄糖溶液的质量体积比为268.8mg：22mL。

9.权利要求1～8中任一项所述一种多肽C16与血管生成素Ang-1的复合制剂在制备中枢神经系统炎性疾病治疗药物中的应用。

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