CN101461817A

CN101461817A - 1,2,3,4,6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖的用途

Info

Publication number: CN101461817A
Application number: CNA200810220686XA
Authority: CN
Inventors: 王一飞; 张颖君; 杨崇仁; 裴赢; 钱垂文; 张美英; 刘青; 北里海雄
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University; University of Jinan
Priority date: 2008-12-31
Filing date: 2008-12-31
Publication date: 2009-06-24

Abstract

本发明提供了1，2，3，4，6－五－O－没食子酰基－b－D－葡萄糖作为制备抗单纯疱疹病毒的药物的用途，特别涉及其作为制备抗单纯疱疹1型病毒的药物的用途。1，2，3，4，6－五－O－没食子酰基－b－D－葡萄糖对HSV－1感染的细胞具有预防和治疗作用，还可以降低对MRC－5细胞的感染性，对HSV－1具有直接杀伤作用，可以使HSV－1感染MRC－5细胞的活性下降；以其为有效成分制备的抗单纯疱疹病毒1型药物，在安全剂量范围内，对单纯疱疹病毒1型的抑制率高；预防单纯疱疹病毒1型感染的作用强；愈后快，可以减轻感染病人的综合症状；药物毒性小，稳定性好。

Description

1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖的用途

技术领域

本发明涉及1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖作为制备抗单纯疱疹病毒的药物的用途，特别涉及其作为制备抗单纯疱疹1型病毒的药物的用途，属于药品领域。

背景技术

1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖从余甘子(phyllanthus emblicaL.)的枝叶中提取而得。余甘子(Phyllanthus emblica L.)来源于大戟科(Euphorbiaceae)叶下珠属植物(Phyllanthus)的成熟果实，又名滇橄榄、油柑，广泛分布于西亚、北非、印度南部以及东南亚各地。我国西南至东南沿海地区均有分布。在我国的中草药、藏药、蒙药、傣药、维吾尔药等民族药体系以及印度寿命吠陀传统药物体系中，均具有十分悠久的用药史。

单纯疱疹病毒属α亚科，分单纯疱疹病毒1型和2型，是最早发现的疱疹类病毒。单纯疱疹病毒1型引起唇疱疹、疱疹性角膜炎等。单纯疱疹原发感染愈后病毒基因潜伏于神经节，当机体抵抗力低下时，病毒基因被激活并开始繁殖，病情反复发作。

单纯疱疹病毒(HSV)为典型疱疹病毒形态，球形，有包膜，颗粒直径120-150nm，内有核衣壳，直径100-110nm，包膜和核衣壳之间有无定形纤维组织皮质层，内有核心，核心内有病毒DNA和蛋白质。

单纯疱疹病毒在全球广泛分布，人类是唯一的宿主。感染主要通过人群与易感者之间的密切接触，无季节差异。机体感染病毒后可产生抗体，抗体不能清除病毒，但可作为了解HSV感染流行病学的指标。

单纯疱疹病毒感染在人群中广泛存在，初次原发感染绝大多数形成隐性感染，无临床症状，感染后产生中和抗体，60％-90％的人群中抗体检测为阳性，但不能清除病毒。少数感染者出现黏膜、皮肤复发性疱疹病灶，新生儿或免疫力低下者感染后可发展为疱疹性脑炎或全身性感染。唇疱疹为单纯疱疹病毒1型(HSV-1)常见的皮肤感染，局部出现疱疹病灶，一般自愈，可复发。也可引起皮肤疱疹、湿疹。眼角膜炎为单纯疱疹病毒常见的黏膜感染，单纯疱疹病毒1型感染引起角膜炎，发病率较高。原发性感染多为急性树枝状角膜炎，愈后经常反复发作，病变深入角膜基层组织，发展为角膜溃疡，影响视力，甚至导致失明，发作病程长达数月。新生儿或免疫力低下者感染疱疹病毒，可侵染神经系统，引发脑炎，病情严重、未治疗病人病死率高达70％，治疗后也多发生后遗症。严重者可引起全身性单纯疱疹病毒感染，病死率极高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供了1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖(1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)作为制备抗单纯疱疹病毒的药物的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖作为制备抗单纯疱疹病毒的药物的用途。

所述抗单纯疱疹病毒的药物是抗单纯疱疹病毒1型的药物。

所述抗单纯疱疹病毒的药物含有治疗有效量的1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖和药学上可接受的载体。

所述抗单纯疱疹病毒的药物制成片剂、胶囊、口服液、针剂或粉针剂。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：(1)本发明以单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒株和人胚肺成纤维细胞(MRC-5)细胞为实验对象，观察1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖抗单纯疱疹病毒1型的活性，确定了1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖对HSV-1感染的细胞具有预防和治疗作用，还可以降低对MRC-5细胞的感染性，明确了1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖对HSV-1具有直接杀伤作用，使HSV-1感染MRC-5细胞的活性下降；(2)将1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖用于制备抗单纯疱疹病毒1型的药物，在安全剂量范围内，对单纯疱疹病毒1型的抑制率高；预防单纯疱疹病毒1型感染的作用强；愈后快，可以减轻感染病人的综合症状；药物毒性小，稳定性好，具有重要的开发与应用前景。

附图说明

图1是正常细胞对照组的显微镜图(10 x 10倍)。

图2是病毒对照组的显微镜图(10 x 10倍)。

图3是本发明的药物组的显微镜图(10 x 10倍)。

图4是阳性对照药物ACV组的显微镜图(10 x 10倍)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实验材料的说明如下：

1、器材：进口24孔培养板(平底)；倒置显微镜；CO₂细胞培养箱；微量可调加样器；培养基为MEM(含青霉素、链霉素双抗各250U/ml)，除菌过滤前用碳酸氢钠调pH至7.0-7.2；小牛血清经56℃ 30min灭活补体，除菌分装；消化液为5％胰蛋白酶5ml+0.01mol/L(pH7.2)PBS 93ml，除菌分装，低温保存。

2、病毒和细胞株

单纯疱疹病毒1型毒株是来源于美国ATCC(VR733)，引自武汉病毒所。MRC-5细胞购于购自中国科学院细胞库，由申请人所在的实验室保存。MRC-5细胞系来自14周龄男性胎儿的正常肺组织，是正常二倍体细胞系，是疱疹病毒敏感细胞。MRC-5细胞用含10％胎牛血清的MEM培养基连续传代3次保持在对数生长期，供实验用，维持液为含2％小牛血清的MEM培养基。

3、药物

将10mg1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖先加入100μlDMSO(二甲基亚砜)溶解后配成药物储存液，-20℃保存备用。阳性对照药无环鸟苷(ACV)为湖北科益药业股份有限公司产品，临用前用MEM维持液稀释。

实施例1

药物稀释：将药物储存液用MEM维持液稀释，倍比稀释为20μg/ml，10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1.25μg/ml。

阳性对照药物ACV稀释：将10mg ACV样品溶于100μl去离子水配制药物母液，4℃长期保存，使用时用MEM维持液稀释，稀释为20μg/ml，10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1.25μg/ml。

分别将20μg/ml，10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1.25μg/ml的1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖维持液和20μg/ml，10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1.25μg/ml的ACV维持液以100μl/孔的量加到单层MRC-5细胞的孔中，每个浓度设4个复孔，培养2小时后，接种100TCID50(病毒感染力滴度)HSV-1病毒液100μl/孔，置于5％CO2细胞培养箱继续培养2小时，病毒完全吸附到细胞后，加入由2倍的MEM维持液和1％羧甲基纤维素以1∶1的比例配成的完全覆盖液800μl，培养72小时，观察药物处理后的细胞对HSV-1感染的影响，同时设定病毒对照组、正常细胞对照组，实验重复3次。

试验分析方法：

72小时后，病毒对照组的细胞不再出现空斑时，弃去维持液，以10％甲醛溶液固定30分钟，然后用5％结晶紫溶液染色后作空斑计数，计算空斑抑制率。

空斑抑制率(％)＝(病毒对照组空斑数-药物处理组空斑数)/病毒对照组空斑数×100％

计算IC50(半数抑制浓度)，计算方法为加权直线回归法，从而估测1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖对HSV-1的感染有无预防作用。

结果显示：1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖药物对预防HSV-1感染的半数有效剂量(IC50)为：2.104μg/ml。可见：1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖对HSV-1感染的细胞具有预防作用。

实施例2

1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖药物和阳性对照药物ACV的稀释方法同实施例1。

先接种100TCID50的HSV-1于24孔板的单层MRC-5细胞上，在37℃、CO2细胞培养箱吸附2小时，再将20μg/ml，10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1.25μg/ml的1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖维持液和20μg/ml，10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1.25μg/ml ACV维持液以100μl/孔的量加到单层MRC-5细胞的孔中，每个浓度设4个复孔，置于5％CO₂细胞培养箱继续培养72小时，观察空斑形成的情况。同时设病毒对照组、正常细胞对照组，实验重复3次。

试验分析方法：

统计不同的药物浓度作用下的空斑形成数目，计算IC50。

结果显示：1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖药物对预防HSV-1感染的半数有效剂量(IC50)为：1.600μg/ml。可见：1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖对HSV-1感染的细胞具有治疗作用。

实施例3

分别将20μg/ml，10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1.25μg/ml的1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖维持液和HSV-1存储液各100μl混合后，以200μl/孔的量加到24孔板单层MRC-5细胞上，每个浓度设定4个复孔，置于5％CO2细胞培养箱培养72小时，观察药物对HSV-1感染细胞的综合作用。同时设病毒对照组、正常细胞对照组，实验重复3次。

试验分析方法：

统计各药物浓度作用下的空斑形成数，计算IC50。

结果显示：1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖药物对预防HSV-1感染的半数有效剂量(IC50)为：5.340μg/ml。可见：1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖可降低HSV-1对MRC-5细胞的感染性。

实施例4

分别将20μg/ml，10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1.25μg/ml的1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖维持液和HSV-1存储液各100μl混合后，置37℃培养箱培养2小时后，将此混合液以200μl/孔的量加入单层MRC-5细胞孔中，37℃、5％CO₂细胞培养箱培养72小时，观察药物对HSV-1的直接杀伤作用。同时设病毒对照组、正常细胞对照组和同样在37℃、5％CO₂细胞培养箱中放置2小时的病毒对照组，实验重复3次。

试验分析方法：

统计各药物浓度的空斑数，计算IC50。

结果显示：1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖药物对预防HSV-1感染的半数有效剂量(IC50)为：为1.302μg/ml。可见：1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖对HSV-1具有直接杀伤作用，使HSV-1感染的MRC-5细胞的活性下降。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1、1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖作为制备抗单纯疱疹病毒的药物的用途。

2、根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抗单纯疱疹病毒的药物是抗单纯疱疹病毒1型的药物。

3、根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抗单纯疱疹病毒的药物含有治疗有效量的1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-b-D-葡萄糖和药学上可接受的载体。

4、根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抗单纯疱疹病毒的药物制成片剂、胶囊、口服液、针剂或粉针剂。