CN102716177B - 鲜泽漆汁在制备抗单纯疱疹病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了鲜泽漆汁在制备治疗单纯疱疹病毒药物中的应用，本发明通过大量实验筛选，实验结果表明鲜泽漆汁体外对单纯疱疹病毒致细胞病变效应具有明显的抑制作用，并且毒性低，不良反应小，且泽漆资源广泛，易得，成本较低，可持续开发，应用前景广泛，有望开发成新的抗单纯疱疹病毒药物。
Description
技术领域
本发明涉及鲜泽漆汁的新用途，具体是涉及鲜泽漆汁用于制备治疗单纯疱疹病毒疾病药物的应用。
背景技术
近年来，随着社会人口老龄化、器官移植、免疫抑制剂应用及人类免疫缺陷病毒(HIV) 感染的增加，导致患者机体免疫功能下降。其中，HIV感染导致的机体免疫功能低下是单纯疱疹病毒感染和复发的主要原因，而单纯疱疹病毒又作为辅助因子增加HIV传播的可能性，促进艾滋病发病并影响预后，临床调查显示疱疹病毒的复发感染是免疫功能受损者的主要死亡原因。HSV-1感染能引起唇疱疹、疱疹性甲沟炎和其他皮疹如外伤性疱疹、疱疹性湿疹，疱疹性角膜炎，严重非季节性局灶性脑炎等；HSV-2能引起生殖器疱疹、疱疹性直肠炎、新生儿疱疹等，临床表现变化多样，常不典型或无症状，且可造成潜伏感染，易被人们忽视，同时也是HSV水平和垂直传播的重要因素。HSV感染的严重程度与宿主的免疫功能状态密切相关，宿主免疫功能受损程度越重，病毒就越容易被激活，病毒激活后疾病会越严重。因此，积极防治艾滋病患者的疱疹病毒感染和复发非常重要。
目前，艾滋病合并疱疹病毒感染的治疗，主要使用的抗病毒药物包括：（1）核苷类药物:一代为阿昔洛韦（ACV，治疗HSV和VZV感染），二代为更昔洛韦（治疗CMV感染）、伐昔洛韦，三代为泛昔洛韦（治疗VZV感染）；（2）非核苷类药物：膦甲酸钠、索立夫定（治疗HSV 感染）；（3）生物抗病毒药物：干扰素及干扰素诱生剂。但是，这些药物严重的副作用和病毒抗药株的出现，使研制新的低毒、高效抗病毒药物刻不容缓。天然药物具有来源广泛、不良反应较少的特点，其抗病毒作用日益受到重视。
泽漆为大戟科植物泽漆的全草，别名五朵云、猫儿眼草、奶浆草。据《本草纲目》记载，它具有利水消肿、消痰退热等功效,为民间常用草药。泽漆分布广泛，资源丰富，因此很有必要开发新的抗疱疹病毒的药物。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，通过大量实验筛选，研究开发出鲜泽漆汁在制备治疗单纯疱疹病毒疾病药物的应用。
作为优选方案，以上所述的鲜泽漆汁在制备治疗单纯疱疹病毒药物中的应用，所述的单纯疱疹病毒为单纯疱疹病毒1型或2型。
本发明提供的鲜泽漆汁和药学上可接受的载体如稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等制备成治疗单纯疱疹病毒药物。
本发明所述的药物可按药学领域常规方法制备成注射液、片剂、粉针剂、颗粒剂、胶囊、口服液、凝胶剂、乳剂、膏剂、霜剂等多种剂型。
本发明提供的鲜泽漆汁制成片剂时把鲜泽漆汁和载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。
本发明提供的鲜泽漆汁制成胶囊剂时把鲜泽漆汁和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。
本发明提供的鲜泽漆汁制成颗粒剂时，把鲜泽漆汁和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。
本发明提供的鲜泽漆汁制成注射液时，取鲜泽漆汁加入生理盐水溶解然后加入活性碳，搅拌均匀，80℃加热30分钟，过滤，调节PH值，用垂熔玻璃漏斗或其它滤器过滤至澄明，灌装，在100至115℃灭菌30分钟制成注射液。
本发明所述的鲜泽漆汁在制备治疗单纯疱疹病毒药物中的应用，所述的鲜泽漆汁的制备方法为：取新鲜泽漆，除去根，洗净，将新鲜茎叶花捣碎，纱布过滤挤压汁液，得到含新鲜生药18g/ml的新鲜汁液，过滤除菌后-20℃保存，用于制备治疗单纯疱疹病毒药物。
本发明以体外单纯疱疹病毒感染VERO细胞作为研究对象，与现有技术相比具有以下优点：
1、泽漆资源广泛，易得，成本较低，可持续开发，应用前景广泛，实验结果表明抗单纯疱疹病毒活性强，并且经毒性实验结果表明，本发明提供的有效剂量较小，毒性小，不良反应低，使用更安全；
2、泽漆能和不同的赋形剂制备成不同的药物剂型，能方便临床应用。
具体实施方式：
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
鲜泽漆汁的制备：取新鲜泽漆，除去根，洗净，将新鲜茎叶花捣碎，纱布过滤挤压汁液，得到含新鲜生药18g/ml的新鲜汁液，过滤除菌后-20℃保存，备用。
实施例2 药理实验
1 材料
1.1 细胞株 Vero细胞（非洲绿猴肾细胞），购自中国科学院上海细胞库，本实验室传代、保存。
1.2 药物。本发明实施例1制备得到的鲜泽漆汁，泽漆水煎剂（制备方法为：取干燥的泽漆，加入10倍量的蒸馏水于100℃煎煮至一半体积，过滤得到滤液，浓缩至浸膏，使得含生药量20mg/ml,4℃保存）；阳性对照药物为无环鸟苷(ACV)，湖北潜江制药股份有限公司，批号为20040802。
1.3 主要试剂 青霉素（山东鲁抗），硫酸链霉素（Amresco），MTT（噻唑盐，Genebase），胰蛋白酶（南京生兴），EDTA（Sigma），RPMI-1640培养基 （GIBCO），碘化丙啶（PI，Sigma，美国），RPMI-1640 （GIBCO）， 新生小牛血清（兰州民海，Hyclone合资），96孔培养板（Corning产品）。
1.4 仪器 超净工作台（苏净公司，SW-CJ-1F），CO2培养箱（美国Thermo），倒置显微镜（Olympus，X41），酶标仪（Bio-Teck，POWERWAVE340）。
1.1.2 病毒
人类单纯疱疹病毒Ⅰ（HSV-1）和Ⅱ型（HSV-2），本实验室增殖，保存。
2 方法
2.1 病毒毒力测定 将vero细胞按1×105的浓度，接种到96孔细胞培养板上，每孔0.2ml，18~24h长成单层细胞，弃去上清，备用。将HSV-1和HSV-2两种病毒稀释成不同浓度（10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9），加入20μL病毒液，每个浓度4个复孔，吸附1h，弃去未吸附的病毒，加入细胞培养液0.2ml，37℃ 5％CO2培养72h。根据出现细胞病变（CPE）情况，计算病毒的半数组织感染量（TCID50）。
2.2 药物处理
取本发明实施例1制备得到的鲜泽漆汁和泽漆水煎剂（制备方法为：取干燥的泽漆，加入10倍量的蒸馏水于100℃煎煮至一半体积，过滤得到滤液，浓缩至浸膏，使得含生药量20mg/ml,4℃保存），用10%血清RPMI-1640培养基稀释分别得到终浓度含泽漆生药1g/ml。
2.3 药物对细胞的毒性作用
取长成单层细胞的96孔细胞培养板，弃去上清，将含不同浓度本发明实施例1制备得到的鲜泽漆汁和泽漆水煎剂（制备方法为：取干燥的泽漆，加入10倍量的蒸馏水于100℃煎煮至一半体积，过滤得到滤液，浓缩至浸膏，使得含生药量20mg/ml,4℃保存）的细胞维持液0.2ml加入细胞，不含药物的正常细胞对照，4个复孔，37℃ 5％CO2培养72h，倒置显微镜下观察并记录细胞病变情况。每孔加入20μL 5mg/ml的MTT溶液，继续培养4h，弃去上清，加入0.2mL DMSO充分溶解，酶标仪570-630nm双波长法测O.D值，计算药物半数细胞毒性浓度（TC50）。以最大无毒浓度为起始浓度，2倍倍比稀释几个浓度，进行体外抗病毒实验。
2.4药物抑制单纯疱疹病毒致细胞病变作用
将Vero细胞接种至96孔培养板，18~24h细胞长成单层，弃去培养上清，设药物组包括：本发明实施例1制备得到的鲜泽漆汁和泽漆水煎剂（制备方法为：取干燥的泽漆，加入10倍量的蒸馏水于100℃煎煮至一半体积，过滤得到滤液，浓缩至浸膏，使得含生药量20mg/ml，4℃保存）、阳性对照组、病毒对照组和细胞对照组。将单纯疱疹病毒（HSV）病毒液用PBS稀释成100×TCID50（HSV-1稀释104倍，HSV-2稀释10倍），每孔接种20μL稀释的病毒液，每板均留4孔作正常细胞对照，病毒吸附1h后，弃上清液。将含实施例1制备得到的不同浓度鲜泽漆汁和不同浓度泽漆水煎剂（制备方法为：取干燥的泽漆，加入10倍量的蒸馏水于100℃煎煮至一半体积，过滤得到滤液，浓缩至浸膏，使得含生药量20mg/ml,4℃保存）的10%血清RPMI-1640培养基分别加入接种病毒的细胞培养板上，含0.2mg/mL阿昔洛韦的10%血清RPMI-1640培养基作为阳性对照，病毒对照组和细胞对照组为10%血清RPMI-1640培养基，每孔200μL，设4个复孔。
培养板密封后置入37℃、5%CO2恒温箱内培养72h，每24h在倒置显微镜下观察细胞病变效应（CPE），记录CPE程度。72h后，每孔加入20μL 5mg/ml的MTT溶液，继续培养4h，弃去上清，加入0.2mL DMSO充分溶解，酶标仪570-630nm双波长法测O.D值，计算50%病毒抑制率，公式如下：
2.5 统计学处理 以上各实验重复3次，所得病毒滴度、抑病毒指数等数据构成计量资料，采用F及q检验进行统计学分析处理。
3 结果
3.1 病毒活性检测
结果如表1，HSV-1的TCID50为10-6~10-7，HSV-2的TCID50为10-3~10-4。
表1 HSV-1和HSV-2活性检测
注：“—”表示细胞没有发生病变，“＋”表示大约25％的细胞发生了病变，“＋＋”表示大约50％的细胞发生病变，“＋＋＋”表示大约75％的细胞发生病变，“＋＋＋＋”表示100％的细胞发生病变。
3.2 鲜泽漆榨汁和泽漆水煎剂（制备方法为：取干燥的泽漆，加入10倍量的蒸馏水于100℃煎煮至一半体积，过滤得到滤液，浓缩至浸膏，使得含生药量20mg/ml，4℃保存）的细胞毒性作用
结果如表2和表3所示，实验结果表明鲜泽漆榨汁和泽漆水煎剂细胞毒性均很小，倒置显微镜下未见明显细胞病变效应，MTT法检测细胞增殖活性结果显示，鲜泽漆榨汁1.000g/ml的鲜泽漆榨汁对细胞存活率为78.5%。泽漆水煎剂1.000g/ml对细胞存活率为76.4%
表2 鲜泽漆汁的细胞毒性作用
表3泽漆水煎剂的细胞毒性作用
3.3 鲜泽漆榨汁和泽漆水煎剂对HSV-1和HSV-2的抑制作用
本发明提供的鲜泽漆榨汁对HSV-1致细胞病变的抑制作用结果如表4 所示，倒置显微镜下观察，细胞对照细胞形态正常，阳性对照细胞正常，病毒对照vero细胞完全病变，细胞变圆，浓度为1.000g/ml和0.500g/ml鲜泽漆榨汁具有良好的抑制病毒致细胞病变作用，倒置显微镜下可见细胞形态良好，与阳性对照无明显差异。而MTT法检测细胞增殖活性，计算鲜泽漆榨汁50%病毒抑制浓度为0.420g/ml，显示出了很好的抗HSV-1 作用。
表4鲜泽漆汁抗HSV-1作用
本发明提供的鲜泽漆榨汁对HSV-2致细胞病变的抑制作用如表5，倒置显微镜下观察，细胞对照细胞形态正常，阳性对照细胞正常，病毒对照vero细胞完全病变，细胞变圆，1.000g/ml和0.500g/ml鲜泽漆榨汁具有较好的抑制病毒致细胞病变作用，细胞形态明显比病毒对照好。 MTT法检测细胞增殖活性，当鲜泽漆榨汁为1.000g/ml和0.500g/ml时，对HSV-2的抑制率分别为75.3%和65.3%，也显示出了较好的抗HSV-2作用。
鲜泽漆汁抗HSV-2作用
泽漆水煎剂对HSV-1和HSV-2致细胞病变的抑制作用结果如表6 和表7所示，实验结果表明泽漆水煎剂对HSV-1无明显抑制作用，对HSV-2有较明显的抑制作用。
表6 泽漆水煎剂抗HSV-1作用
| 药物浓度g/ml | 1.000 | 0.500 | 0.250 | 0.125 | 0.063 | 0.031 | 阳性对照 | 病毒对照 | 细胞对照 |
| OD平均值 | 0.810 | 0.858 | 0.492 | 0.503 | 0.326 | 0.411 | 1.043 | 0.533 | 1.505 |
| S | 0.004 | 0.010 | 0.007 | 0.027 | 0.003 | 0.005 | 0.001 | 0.000 | 0.012 |
| 病毒抑制率% | 32.5% | 28.3% | -2.4% | -1.2% | -19.5% | -10.8% | 52.5% |
表7 泽漆水煎剂抗HSV-2作用
| 药物浓度g/ml | 1.000 | 0.500 | 0.250 | 0.125 | 0.063 | 0.031 | 阳性对照 | 病毒对照 | 细胞对照 |
| OD平均值 | 1.010 | 0.987 | 0.712 | 0.603 | 0.526 | 0.498 | 1.469 | 0.515 | 1.487 |
| S | 0.004 | 0.010 | 0.007 | 0.027 | 0.003 | 0.005 | 0.001 | 0.000 | 0.003 |
| 病毒抑制率% | 60.5% | 48.3% | 24.2% | 8.2% | 4.5% | -9.8% | 98.2% |
以上实验结果表明，本发明提供的鲜泽漆榨汁不仅对HSV-1有很好的抑制作用，对HSV-2也具有很好的抑制作用，具有比泽漆水煎剂更广泛，更好的抑制单纯疱疹病毒（HSV）病毒的作用；有望开发成新的抗单纯疱疹病毒（HSV）病毒的药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.鲜泽漆汁在制备治疗单纯疱疹病毒药物中的应用，其特征在于：所述的单纯疱疹病毒为单纯疱疹病毒1型；
所述的鲜泽漆汁的制备方法为：取新鲜泽漆，除去根，洗净，将新鲜茎叶花捣碎，纱布过滤挤压汁液，得到含新鲜生药18g/ml的新鲜汁液，过滤除菌后，-20℃保存，备用。
2.根据权利要求1所述的鲜泽漆汁在制备治疗单纯疱疹病毒药物中的应用，其特征在于：将鲜泽漆汁和药学上可接受的载体制备成注射液、片剂、粉针剂、颗粒剂、胶囊、凝胶剂、乳剂、膏剂、霜剂或口服液剂型的药物。
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