CN104688753A - 人参皂苷单体化合物在制备治疗黄病毒科病毒感染的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人参皂苷单体化合物在制备治疗黄病毒科病毒感染的药物中的用途,属于人参皂苷单体化合物的新医药用途领域。本发明从多种人参皂苷单体化合物中筛选出具有良好的抗牛病毒性腹泻病毒的人参皂苷单体化合物,这些化合物通过直接杀灭病毒颗粒、阻断病毒侵入细胞或抑制病毒在细胞内复制等方式发挥抗牛病毒性腹泻病毒作用,能够用于治疗由牛病毒性腹泻病毒或丙型肝炎病毒等黄病毒科病毒感染所导致的疾病。本发明进一步公开了一种治疗黄病毒科病毒感染的药物组合物,包括治疗上有效量的人参皂苷单体化合物和药学上可接受的辅料或载体。
Description
技术领域
本发明涉及人参皂苷单体化合物的新医药用途,尤其涉及人参皂苷单体化合物在制备治疗黄病毒科病毒感染药物中的用途,属于人参皂苷单体化合物的新医药用途领域。
背景技术
人参皂苷(Ginsenoside)是人参的主要成分之一,以往研究人参皂苷多集中于抗癌活性及免疫调节作用。人参皂苷具有一定的抗病毒作用,而具体人参皂苷单体的直接抗病毒作用的报道较少。
牛病毒性腹泻/黏膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的牛等动物的重要传染病。目前,BVDV免疫抑制及持续性感染所引发的经济损失非常严重。BVDV与丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)均隶属于黄病毒科,且由于基因组结构、复制翻译策略和蛋白质功能与丙型肝炎病毒(HCV)密切相似,BVDV一直被认为是研究HCV生命活动及抗病毒药物筛选的理想替代模型。筛选出具有直接抗病毒作用的人参皂苷单体,对于治疗黄病毒科病毒感染具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供人参皂苷单体化合物在制备治疗黄病毒科病毒感染的药物中的新用途,这些化合物通过直接杀灭病毒颗粒、阻断病毒侵入细胞或抑制病毒在细胞内复制等方式发挥抗病毒作用,能够用于治疗由牛病毒性腹泻病毒或丙型肝炎病毒等黄病毒科病毒感染所导致的疾病。
为解决上述技术问题,本发明所采取的技术方案是:
本发明首先将包括人参皂苷Rb1,Rb2,Rb3,Rc,Rd,Re,Rg1,Rg2,Rg3(s),Rf,Rh1(s),Rh2,拟人参皂苷Rh2,拟人参皂苷F11,三七皂苷R1,刺五加皂苷B和刺五加甙E等在内的多种人参皂苷单体化合物通过细胞毒性实验确定这些人参皂苷单体化合物在MDBK细胞的安全浓度。细胞毒性实验结果发现:人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Re、Rg1、Rf、Rh1(s)、拟人参皂苷F11、三七皂苷R1、刺五加皂苷B和刺五加甙E这些单体化合物在最大浓度(500μg/mL)对MDBK细胞无毒性,细胞单层完整,细胞单折光性良好,视野中未见死细胞;Rg3(s)以及Rh2浓度高于62.5μg/mL对MDBK细胞有毒性;拟人参皂苷Rh2浓度高于31.25μg/mL对MDBK细胞有毒性,浓度高于250μg/mL时,细胞单层严重残缺,基本不成层,折光性很差,视野中主要为圆细胞或死细胞。
在确定了人参皂苷单体化合物对于细胞毒性的基础上,本发明进一步通过人参皂苷单体化合物对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)致细胞病变的抑制实验以期望筛选得到对BVDV病毒有良好的抑制作用且对细胞无毒的人参皂苷单体化合物;实验结果发现,Rb2和Rb3大于100μg/mL即可对BVDV病毒产生良好的抑制作用,细胞状态正常,证明人参皂苷单体化合物不仅对于牛病毒性腹泻病毒有非常好的抑制作用,而且对于细胞无毒;Rd,Rh2和Rg3(s)尽管对于病毒有产生一定的抑制作用,但是这些单体化合物对于细胞的毒性很大;其余的人参皂苷单体化合物即便在最大浓度(500μg/mL)时对BVDV病毒无任何抑制作用。
人参皂苷单体化合物Rb2或Rb3抑制BVDV病毒复制方式确定实验结果表明,人参皂苷单体化合物Rb2或Rb3浓度为200μg/mL时,可以直接杀灭病毒颗粒、抑制病毒在细胞内复制等环节阻抗病毒作用。通过预防组结果表明,人参皂苷单体化合物Rb2或Rb3具有一定阻断病毒侵入细胞作用。因此,人参皂苷单体化合物Rb2,Rb3通过直接杀灭病毒颗粒、阻断病毒侵入细胞或抑制病毒在细胞内复制等多个环节的方式发挥抗病毒作用,可以用于制备治疗由牛病毒性腹泻病毒或丙型肝炎病毒等黄病毒科病毒感染所导致的疾病的药物。
本发明所述黄病毒科病毒包括牛病毒性腹泻病毒(Bovine ViralDiarrhea Virus,BVDV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)、猪瘟病毒(Classical Swine fever virus,CSFV)或绵羊边界病毒(Border diseasevirus,BDV)中的任意一种或多种。
由于研究发现能够抑制BVDV在细胞中复制的药物一般都可以用于治疗HCV感染(Buckwold V,Beer B,Donis R,Bovine viral diarrhea virus asa surrogate model of hepatitis C virus for the evaluation of antiviral agents.Antiviral Research,2003,60(1):1–15;Michelle P Walker,Nanhua Yao,ZhiHong Promising candidates for the treatment of chronic hepatitis C.ExpertOpinion on Investigational Drugs,August 2003,Vol.12,No.8:1269-1280.)因此,本发明所筛选的人参皂苷单体化合物在治疗丙型肝炎病毒感染方面亦具有一定效果。
本发明还公开了一种治疗黄病毒科病毒感染的药物组合物,包括:治疗上有效量的人参皂苷单体化合物和药学上可接受的辅料或载体。
其中,所述人参皂苷单体化合物包括人参皂苷Rb2、Rb3、Rd、Rg3(s)或Rh2中的任意一种或多种;优选的,所述人参皂苷单体化合物为人参皂苷Rb2或人参皂苷Rb3中的任意一种或两种。
本发明所述人参皂苷Rb2、Rb3、Rd、Rg3(s)或Rh2的分子式、化学结构式见表1。
表1 人参皂苷Rb2、Rb3、Rd、Rg3(s)或Rh2的分子式及化学结构式
本发明所述人参皂苷单体化合物可以商品化购买,也可以在人参茎叶中或人参根部提取,其提取方法为本领域技术人员所熟知。
本发明技术方案与现有技术相比,具有以下有益效果:
本发明筛选出的人参皂苷单体化合物Rb2以及Rb3通过直接杀灭病毒颗粒、阻断病毒侵入细胞或抑制病毒在细胞内复制等多个环节的方式发挥抗病毒作用,具有优异的抗病毒活性且对细胞无毒,可以用于制备治疗由牛病毒性腹泻病毒或丙型肝炎病毒等黄病毒科病毒感染所导致疾病的药物。
附图说明
图1为人参皂苷单体化合物Rb2和Rb3对BVDV抑制的荧光检测结果;其中,A:MDBK细胞对照;B:DMSO对照;C:BVDV对照;D:Rb2预防组;E:Rb2治疗组;F:Rb2灭活组;G:Rb3预防组;H:Rb3治疗组;I:Rb3灭活组。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的,不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、实验材料
药物:人参皂苷标准品Rb1,Rb2,Rb3,Rc,Rd,Re,Rg1,Rg2,Rg3(s),Rf,Rh1(s),Rh2,拟人参皂苷Rh2,拟人参皂苷F11,三七皂苷R1,刺五加皂苷B,刺五加甙E,购买于吉林大学,HPLC检测含量〉98%;
其中Rb1,Rc,Rd,Rg1,Rg3(s),Rf,Rh1(s),Rh2,三七皂苷R1采用无水乙醇溶解,Rb2,Rb3,Re,Rg2,拟人参皂苷F11,拟人参皂苷Rh2,刺五加甙E,刺五加皂苷B采用DMSO溶解,4℃保存备用。
细胞:MDBK细胞,购于中国兽医药品监察所,培养于含有6%无BVDV病毒污染的胎牛血清的DMEM培养液中;
病毒:BVDV-C24V毒株,购于中国兽医药品监察所。
实施例1人参皂苷单体化合物对细胞毒性实验
1、实验方法
将MDBK细胞用0.25%胰酶消化后加入生长液吹散混匀,100μl/孔接种于96孔细胞培养板,37℃,5%CO2中培养24h后生长为单层细胞,弃去培养液,待用。将人参皂苷标准品做2倍倍比稀释进行粗筛。每一浓度接种事先准备好的细胞5孔,每孔100μl。以样品溶剂和正常MDBK细胞作为阴性对照。无水乙醇与DMSO在2.5%浓度以下基本无细胞毒性,所有测试样品均在溶剂无毒性范围内进行实验,37℃,5%CO2中培养,第二日起,每日在倒置显微镜下逐日观察细胞形态,观察72小时后记录最终结果。
2、实验结果
实验结果见表2。
表2 人参皂苷单体化合物在MDBK细胞的安全浓度确定
注:“-”表示细胞单层完整,细胞单折光性良好,视野中未见死细胞。
“+”表示细胞单折光性正常,视野中可见极少量圆细胞或死细胞。
“++”表示单层有较大残缺,折光性较差,视野中可见大量圆细胞或死细胞。
“+++”表示细胞单层严重残缺,基本不成层,折光性很差,视野中主要为圆细胞或死细胞。
实施例2人参皂苷单体化合物对BVDV病毒抑制实验
1、实验方法
将MDBK细胞接种于96孔细胞培养板,每孔0.1ml,待细胞长成单层,将不同浓度的人参皂苷单体化合物与BVDV病毒混合,在37℃感作1小时后,接种于事先准备好的细胞,100μl/孔,同时设置溶剂对照、病毒对照和正常细胞对照,37℃,5%CO2中培养72小时后,通过观察细胞病变和免疫荧光试验确定药物对病毒的杀灭情况。
2、实验结果
人参皂苷单体化合物对BVDV病毒致细胞病变的抑制作用实验结果见(表3)表明,Rb2和Rb3大于100μg/mL即可对病毒产生良好的抑制作用;Rd,Rh2和Rg3(s)对细胞的毒性很大,但同时对病毒亦产生一定的抑制作用。其余人参皂苷单体化合物(Rb1、Rc、Re、Rg1、Rg2、Rf、Rh1(s)、拟人参皂苷Rh2、拟人参皂苷F11、三七皂苷R1、刺五加皂苷B和刺五加甙E)在最大浓度(500μg/mL)对BVDV病毒无任何抑制作用。
表3 不同浓度人参皂苷单体化合物抗牛病毒性腹泻病毒结果
注:“+++”表示大于75%细胞呈现阳性;
“++”表示50%细胞呈现阳性;
“+”表示25%以下细胞呈现阳性;
“-”表示细胞状态正常,无阳性。
实施例3人参皂苷单体化合物Rb2或Rb3抑制BVDV病毒复制方式确定实验
1、实验方法
将MDBK细胞接种于24孔细胞培养板,待细胞长成单层,分别设立预防组、直接灭活组、治疗组、BVDV病毒感染对照、正常MDBK细胞对照及DMSO对照组。通过观察细胞病变和免疫荧光试验确定药物对病毒的杀灭情况。
预防组:先加入人参皂苷单体化合物Rb2或Rb3(浓度为200μg/mL)500μl/孔,37℃,5%CO2中培养2小时后,弃药物,加入BVDV病毒(104.0TCID50/mL)500μl/孔,放入37℃,5%CO2培养箱中继续培养,通过观察细胞病变和免疫荧光试验确定药物对病毒感染细胞的阻断情况。
直接灭活组:将人参皂苷单体化合物Rb2或Rb3(浓度为200μg/mL)与BVDV病毒(104.0TCID50/mL)1:1混合后,37℃,5%CO2中培养2小时后,加入细胞培养板,500μl/孔,放入37℃,5%CO2培养箱中继续培养,通过观察细胞病变和免疫荧光试验确定药物对病毒的杀灭情况。
治疗组:先加入BVDV病毒(104.0TCID50/mL)500μl/孔37℃,5%CO2中培养2小时后,弃病毒,加入人参皂苷单体化合物Rb2或Rb3(浓度为200μg/mL)500μl/孔,放入37℃,5%CO2培养箱中继续培养,通过观察细胞病变和免疫荧光试验确定药物对病毒的抑制情况。
2、实验结果
结果见图1。图1E-F表明,人参皂苷单体化合物Rb2浓度为200μg/mL时,可以直接杀灭病毒颗粒、抑制病毒在细胞内复制等环节阻抗BVDV病毒。预防组结果(图1D)表明,人参皂苷单体化合物Rb2具有一定阻断病毒侵入细胞作用。
图1H-I表明,人参皂苷单体化合物Rb3浓度为200μg/mL时,可以直接杀灭病毒颗粒、抑制病毒在细胞内复制等环节阻抗BVDV病毒。预防组结果(图1G)表明,人参皂苷单体化合物Rb3具有一定阻断病毒侵入细胞作用。
因此,本发明认为人参皂苷单体化合物Rb2,Rb3以其直接杀灭病毒颗粒、阻断病毒侵入细胞或抑制病毒在细胞内复制等多个环节的方式发挥抗病毒作用,可以应用于制备抗黄病毒科病毒药物。
Claims (9)
1.人参皂苷单体化合物在制备治疗黄病毒科病毒感染的药物中的用途。
2.人参皂苷单体化合物在制备杀灭黄病毒科病毒颗粒的药物中的用途。
3.人参皂苷单体化合物在制备阻断黄病毒科病毒侵入细胞的药物中的用途。
4.人参皂苷单体化合物在制备抑制黄病毒科病毒在细胞内复制的药物中的用途。
5.按照权利要求1至4任何一项所述的用途,其特征在于:所述黄病毒科病毒包括牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)、猪瘟病毒(Classical Swine fever virus)或绵羊边界病毒(Border disease virus)中的任意一种或多种。
6.按照权利要求1至4任何一项所述的用途,其特征在于:所述人参皂苷单体化合物包括人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg3(s)或人参皂苷Rh2中的任意一种或多种;优选的,所述人参皂苷单体化合物为人参皂苷Rb2或人参皂苷Rb3中的任意一种或两种。
7.一种治疗黄病毒科病毒感染的药物组合物,其特征在于,包括:治疗上有效量的人参皂苷单体化合物和药学上可接受的辅料或载体。
8.按照权利要求7所述的药物组合物,其特征在于:所述人参皂苷单体化合物包括人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg3(s)或人参皂苷Rh2中的任意一种或多种;优选的,所述人参皂苷单体化合物为人参皂苷Rb2或人参皂苷Rb3中的任意一种或两种。
9.按照权利要求7所述的用途,其特征在于:所述黄病毒科病毒包括牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus)、丙型肝炎病毒(hepatitisC virus)、猪瘟病毒(Classical Swine fever virus)或绵羊边界病毒(Borderdisease virus)中的任意一种或多种。
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