CN101322714A - 抗单纯疱疹病毒ⅰ型的药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及达玛烷型四环三萜类化合物为活性成分的药物组合物及其在医药领域中的应用。从人参属植物三七中分离得到如下结构式所示的3个达玛烷型四环三萜类化合物，经体外药理实验证明其对单纯疱疹病毒I型有较好的体外抑制活性，可在制备抗单纯疱疹病毒I型药物中应用，用于治疗由单纯疱疹病毒I型引起的疱疹性角膜炎、脑炎、肺炎以及口腔溃疡、水疱等。

Description

抗单纯疱疹病毒Ⅰ型的药物组合物及其应用

技术领域

本发明属于药物组合物领域，具体地，涉及达玛烷型四环三萜类化合物为活性成分的药物组合物，其在制备治疗由单纯疱疹病毒I型感染所引起的疾病，以及在制备由于病毒感染引起的口腔溃疡、水疱的药物中的应用。

背景技术

单纯疱疹病毒是DNA病毒，属于疱疹病毒科a病毒亚科。从发生后四个月到数年被感染的人数可达人口总数的50-90％，是最易侵犯人的一种病毒，但在临床仅有一部份发病。根据抗原性的差别可分为I型和II型。单纯疱疹病毒I型(HSV-1)主要引起生殖器以外的皮肤、粘膜(口腔粘膜)、角膜和器官(脑)的感染。临床表现主要是粘膜或皮肤局部集聚的疱疹，偶尔也可发生严重的全身性疾病，累及内脏。

目前临床治疗主要采用局部皮肤护理，同时结合一些口服抗病毒药物等。临床适用的中成药则主要是利用其清热解毒的药效治疗。中药三七药理作用广泛，曾有报道以三七为主要原料的“云南白药”可用于治疗带状疱疹等疾病。另有文献报道同属植物人参、西洋参的茎叶皂苷成分对HSV-1感染的细胞有保护作用，人参茎叶皂苷(GNS)可抑制HSV-1病毒复制，利用含GNS霜剂治疗HSV-1感染引起的口唇疱疹及口腔溃疡患者进行涂敷治疗，治愈率达到87.10％。此外，单体皂苷成分人参皂苷Rg3、Rb3、Rb1等对HSV-1型病毒有一定的体外抑制活性。

现有技术中未见有达玛烷型四环三萜类化合物为活性成分在制备治疗由单纯疱疹病毒I型感染所引起的疾病，以及在制备由于病毒感染引起的口腔溃疡、水疱的药物中的应用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供达以玛烷型四环三萜类化合物为活性成分的药物组合物，及其用于治疗由单纯疱疹病毒I型感染所引起的疾病和用于治疗由于病毒感染引起的口腔溃疡、水疱疾病中的用途。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：

抗单纯疱疹病毒I型的药物组合物，包括如下结构式所示的达玛烷型四环三萜类化合物和药用载体，

该三个化合物的结构式如下：

人参皂苷Rd    20(R/S)-6”-O-acetylginsenoside Rg3 20(S)-原人参三醇

达玛烷型四环三萜类化合物在制备抗单纯疱疹病毒I型药物中的应用。

达玛烷型四环三萜类化合物在制备治疗由单纯疱疹病毒I型感染所引起的疾病，包括单纯疱疹性角膜炎、疱疹性脑炎、疱疹性肺炎的药物中的应用。

达玛烷型四环三萜类化合物在制备由于病毒感染引起的口腔溃疡、水疱的药物中的应用。

本发明首先对经炮制过的三七进行了系统地化学成分研究，利用多种分离手段，包括大孔树脂柱层析、正反相硅胶柱层析等，从中获得了28个达玛烷型四环三萜类化合物。

之后以单纯疱疹病毒I型毒株(HSV-1)和Vero细胞为实验对象进行药效试验。在Vero细胞上进行的体外抗病毒试验结果表明，其中3个已知化合物表现出较好的活性，结果如下：

其中有2个化合物属于原人参二醇型糖苷，在3位或20位与糖基相连，而20(S)-原人参三醇为苷元。基于上述结果，本发明证实了3种达玛烷型四环三萜类化合物可在制备抗单纯疱疹病毒I型药物中应用，其中2个化合物是原人参二醇型三萜皂苷。

具体地说是对炮制过的三七进行了系统地化学成分研究，从中获得了一系列达玛烷型四环三萜类化合物，之后对其进行体外抗病毒活性筛选，其中3个化合物具有良好的体外抑制单纯疱疹病毒I型的活性，可用于制备抗单纯疱疹病毒I型药物。

本发明提供了用于治疗单纯疱疹病毒1型相关疾病的药物组合物，包括有效治疗剂量的作为活性成分的达玛烷型四环三萜类化合物，以及药物学上可接受的载体。

本发明所述的治疗单纯疱疹病毒1型相关疾病的药物组合物，由达玛烷型四环三萜类化合物与药学上可接受的载体制备的药物剂型包括片剂、胶囊、口服液、针剂或粉针剂。由于达玛烷型四环三萜类化合物可从三七及相关药材中提取分离，而片剂、胶囊、口服液、针剂或粉针剂等药物剂型的制备也是本领域的常规知识，因此，由达玛烷型四环三萜类化合物与相应载体制备的各种药物剂型也能够由本领域技术人员容易实现。

上文所述的的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂黏土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、以及和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、胶囊和注射剂。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1％～99.5％的活性成分，最优选含有重量比为0.5％～95％的活性成分。

本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01～10mg/kg体重，优选0.1～5mg/kg体重。可以一次或多次施用。

具体实施方式：

下面结合实例对本发明作进一步阐述，但不对其有任何限制。

实施例1：

3个活性化合物的提取分离和结构鉴定：

5kg三七购于云南，将其粉碎成颗粒状后，用双层纱布包裹，置于高压锅中，将温度控制在高温120℃，蒸制12小时后即得熟三七。将熟三七用工业乙醇回流提取(5L×4)，减压回收溶剂浓缩后得总浸膏778g。将浸膏用水溶解，用D101大孔吸附树脂(90×8.5cm)进行柱层析，先用水洗脱至流出液Molish反应呈阴性，再用工业甲醇洗脱即得粗皂苷440g。

将粗皂苷用硅胶(200-300目)约500g拌样，经硅胶(200-300目)干柱层析，以氯仿-甲醇-水(85∶15∶1)为流动相，共得9个组分。组分7(38g)经硅胶柱层析，从梯度氯仿-甲醇-水(80∶20∶2)逐步增加极性，得到组分7(7.6g)，将此组分经两次硅胶柱层析得到组分2、3(3.8g)，再经硅胶柱层析后得到第4号流分，将此流分经反相RP-18柱层析，流动相为甲醇-水(60∶40)，逐步增加甲醇浓度，得到第7号流分，即为人参皂苷Rd(1)(1076mg)。

粗皂苷经硅胶柱层析得到的组分5(60g)，以氯仿-甲醇-水(85∶15∶1)为流动相，经硅胶柱层析得到组分1(39g)。此流分再经硅胶柱层析，从氯仿-甲醇-水(90∶10∶1)逐步增加极性至(80∶20∶2)，得到组分8(2.3g)。将此组分经反相RP-18柱层析，流动相为甲醇-水(60∶40)，逐步增加甲醇浓度，得到第4号流分，此流分最后再经反相RP-18柱纯化，流动相为甲醇-水(75∶25)，得到第1号流分，即为20(R/S)-6”-O-acetylginsenoside Rg3(2)(16mg)。

粗皂苷经硅胶柱层析得到组分3(21g)，以石油醚-丙酮(11∶1)为流动相洗脱，逐步增加极性至(1∶1)，得到组分11、12(1g)。将组分11、12用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(100∶1.5)为流动相，得到第2号流分。将此流分再经RP-18反相柱层析，流动相为甲醇-水(75∶25)，逐步增加甲醇浓度，得到第2号流分，即为20(S)-原人参三醇(3)(23mg)。

3个活性化合物的结构鉴定：

主要利用核磁共振谱(¹H-NMR、¹³C-NMR)、质谱(负离子FAB-MS)分析以及与已知文献对照来鉴定结构。

人参皂苷Rd(1)白色无定形粉末，分子式为C₄₈H₈₂O₁₈，易溶于甲醇、吡啶等有机溶剂，FAB-MS(负离子)：946[M]^-，784[M-162]^-，622[M-162-162]^-。¹H NMR(pyridine-d₅，400MHz)：δ_H0.79(3H，s，Me-19)，0.93(3H，s，Me-18)，0.94(3H，s，Me-30)，1.09(3H，s，Me-29)，1.27(3H，s，Me-28)，1.57(6H，s，Me-26，27)，1.61(3H，s，Me-21)，4.91(1H，d，J＝7.6Hz，Glc H-1′)，5.19(1H，d，J＝7.8Hz，Glc H-1″′)，5.37(1H，d，J＝7.6Hz，Glc H-1″)；¹³C NMR(pyridine-d₅，100MHz)：见表1。

20(R/S)-6″-O-acetylginsenoside Rg3(2)白色无定形粉末，分子式为C₄₄H₇₄O₁₄，易溶于甲醇、吡啶等有机溶剂，FAB-MS(负离子)：826[M]^-，784[M-42]^-，622[M-42-162]^-。¹H NMR(pyridine-d₅，500MHz)：δ_H0.81或0.84(3H，s，Me-19)，0.95或0.96(3H，s，Me-18)，0.99或1.01(3H，s，Me-30)，1.12或1.13(3H，s，Me-29)，1.33或1.34(3H，s，Me-28)，1.40或1.42(3H，s，Me-21)，1.61或1.64(3H，s，Me-27)，1.65或1.69(3H，s，Me-26)，4.91(1H，d，J＝7.5Hz，Glc H-1′)；5.32(1H，d，J＝7.5Hz，Glc H-1″)；¹³C NMR(pyridine-d₅，100MHz)：见表1。

表1人参皂苷Rd(1)和20(R/S)-6″-O-acetylginsenoside Rg3(2)的¹³C-NMR化学位移值(δppm，in C₅D₅N)

20(S)-原人参三醇(3)白色无定形粉末，分子式为C₃₀H₅₂O₄，易溶于氯仿、甲醇、吡啶等有机溶剂，¹H NMR(pyridine-d₅，500MHz)：δ_H 0.95(3H，s，Me-30)，0.99(3H，s，Me-19)，1.10(3H，s，Me-18)，1.41(3H，s，Me-21)，1.44(3H，s，Me-29)，1.62(3H，s，Me-27)，1.65(3H，s，Me-26)，1.99(3H，s，Me-28)；¹³C NMR(pyridine-d₅，100MHz)：δ_C 39.4(t，C-1)，28.1(t，C-2)，78.4(d，C-3)，40.4(s，C-4)，61.8(d，C-5)，67.7(d，C-6)，47.7(t，C-7)，41.2(s，C-8)，50.1(d，C-9)，39.4(s，C-10)，32.1(t，C-11)，71.1(d，C-12)，48.2(d，C-13)，51.7(s，C-14)，31.4(t，C-15)，26.9(t，C-16)，54.8(d，C-17)，17.5(q，C-18)，17.6(q，C-19)，73.0(s，C-20)，27.1(q，C-21)，35.9(t，C-22)，23.0(t，C-23)，126.3(d，C-24)，130.8(s，C-25)，25.9(q，C-26)，17.7(q，C-27)，32.0(q，C-28)，16.5(q，C-29)，17.1(q，C-30)。

实施例2：

人参皂苷Rd(1)对Vero细胞的毒性测定试验：

Vero细胞经胰酶消化后，加入96孔培养板中，100μL/孔，待细胞长成单层后弃生长液，每孔加100μL含样品维持液，每个稀释度设四个复孔，同时设正常细胞对照组，置5％CO₂孵箱中37℃培养，每天观察细胞的变化，计算药物的最大无毒浓度TC₀。

结果人参皂苷Rd对Vero细胞的最大无毒浓度TC₀为200μg/mL，无明显的毒性作用。

实施例3：

人参皂苷Rd(1)的抗HSV-1病毒药效学实验：

Vero细胞在96孔板培养至单层，弃生长液，将样品用维持液分别稀释成七个浓度(在样品最大无毒范围内)，每孔加入含样品维持液和病毒稀释液各50μL，每个浓度设4个复孔，同时设阳性对照组、病毒对照组和正常细胞对照组，置5％CO₂孵箱中37℃培养，每天观察细胞病变(CPE)的情况。待病毒对照组的细胞病变达到75％及以上而正常细胞对照组正常时，观察并记录各孔的CPE，采用MTT法检测样品对病毒的抑制率，并计算样品对HSV-1的半数抑制浓度(IC₅₀)。

表2人参皂苷Rd(1)的抗HSV-1病毒药效学实验

结果人参皂苷Rd对HSV-1的半数抑制浓度(IC₅₀)为50μg/mL，有较好的体外活性。

实施例4：

片剂：实施例1所得化合物人参皂苷Rd或20(R/S)-6”-O-acetylginsenoside Rg3或20(S)-原人参三醇10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg；

制备方法：将化合物、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，化合物含量为10mg。

实施例4：

安瓿剂：实施例1所得化合物人参皂苷Rd或20(R/S)-6″-O-acetylginsenoside Rg3或20(S)-原人参三醇2mg，氯化钠10mg；

制备方法：将化合物和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例5：

胶囊剂：实施例1所得化合物人参皂苷Rd或20(R/S)-6″-O-acetylginsenoside Rg3或20(S)-原人参三醇10mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg；

制备方法：将化合物与助剂混合，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。

Claims (4)

1、抗单纯疱疹病毒I型的药物组合物，包括如下结构式所示的达玛烷型四环三萜类化合物和药用载体，

2、权利要求1所述的达玛烷型四环三萜类化合物在制备抗单纯疱疹病毒I型药物中的应用。

3、如权利要求2所述，达玛烷型四环三萜类化合物在制备治疗由单纯疱疹病毒I型感染所引起的疾病，包括单纯疱疹性角膜炎、疱疹性脑炎、疱疹性肺炎的药物中的应用。

4、权利要求1所述的达玛烷型四环三萜类化合物在制备由于病毒感染引起的口腔溃疡、水疱的药物中的应用。