CN105777838A - 20(R)-人参皂苷Rg3衍生物、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了如式(Ⅰ)所示的20(R)‑人参皂苷Rg3衍生物、制备方法其抗肿瘤应用。其中：R1＝H，R2＝C_nH_2n+1CO或R1＝C_nH_2n+1CO，R2＝H或R1＝R2＝C_nH_2n+1CO，n＝3～30。

Description

20(R)-人参皂苷Rg3衍生物、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体而言，本发明涉及20(R)-人参皂苷Rg3衍生物及其制备方法，另外还涉及其药物方面的应用。

背景技术

20(R)-人参皂甙Rg3，其结构如下式所示，最初由日本学者北川勋于1980年分离并鉴定了其结构。由于提取率低，如从红参(栽培人参经晒干或烘干再蒸制而成)中提取的提取率仅为0.003％，因此价格昂贵。

嗣后，20(R)-人参皂甙Rg3被证明是人参中的有效活性成分之一，对于很多疾病有改善和预防作用，对于中老年的常见疾病，心脑血管疾病、冠心病、四肢乏力、腿脚不便、记忆力减退都有疗效。

近年来关于人参皂苷Rg3的衍生物研究多集中在其异构体20(S)-人参皂苷Rg3上。例如，国际申请WO9731933A公开了从红参中提取20(S)-人参皂苷Rg3衍生物的方法，但是由于其结果粗略，并未证明其是否对肿瘤具有抑制作用。2013年王慧等(食品科学，34(5):45)虽然合成了20(S)-人参皂苷Rg3衍生物，但该衍生物体外对肿瘤细胞的抑制能力与相应量的人参皂苷Rg3的效果相当甚至略差。由于人参皂苷Rg3是一种昂贵的原料，如果考虑到为合成衍生物而损失原料的情况，人们不会有动机去研究人参皂苷Rg3衍生物用于制备治疗肿瘤的药物。因为这在成本/疗效上是不经济的，不如直接使用人参皂苷Rg3了。

另外，人参皂苷Rg3及其衍生物尽管体外有一定抑制肿瘤细胞生长的能力，但是体内抑制肿瘤的效果并不十分理想，无论是被主要使用的20(S)-人参皂苷Rg3，还是很少使用的20(R)-人参皂苷Rg3，即使大剂量(高成本)使用，体内的抑瘤率(治疗效果)仍旧只有70％或其以下(参见中国专利CN1243128A和CN1883492A)。

所以，人们对人参皂苷Rg3及其衍生物抗肿瘤的继续研究的兴趣不足。这些年的研究趋势也印证了人们正在放弃用人参皂苷Rg3衍生物来治疗肿瘤的研究尝试，例如中国专利CN101133075A、CN101031580A和CN101322714A等都转而致力于抗病毒或者治疗阿尔兹海默氏症等非肿瘤疾病方面的研究，其中人参皂苷Rg3衍生物也大都作为制备的中间体而使用。

此外，一项关于20(S)-人参皂苷Rg3治疗非小细胞肺癌的发明专利中，发现该成分与化疗药物环磷酰胺联合用药，并未见明显的协同增效作用(中国专利CN101732332A)。

本发明人经过长期研究，克服了现有技术的不利影响，合成了技术很少关注的20(R)-人参皂苷Rg3的一些长链衍生物，令人意想不到地发现了这些衍生物对人体肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌等消化道肿瘤具有明显引起肿瘤细胞凋亡及抑制增殖作用(而非细胞毒作用)，其效果明显优于Rg3；尤其是在体内，20(R)-人参皂苷Rg3衍生物在低于20(R)-人参皂苷Rg3原药剂量6倍时，对肺癌、乳腺癌、胃癌及肝癌等多种癌症具有显著抑制肿瘤和延长生存期的治疗作用，其低剂量的治疗效果显著超过高剂量的20(R)-人参皂苷Rg3本身，从而使得给药的有效剂量低(用药量少即可发挥疗效，同时减少潜在的副作用)，节省用药成本。另外，本发明人还优化了适合于工业化放大生产的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物的制备方法，其中损失的20(R)-人参皂苷Rg3原料少，从而进一步节约了成本。

发明内容

本发明的要解决的技术问题是提供新的20(R)-人参皂甙Rg3衍生物。本发明提供的20(R)-人参皂甙Rg3衍生物相对于20(R)-人参皂甙Rg3来说，在给药剂量显著降低的情况下，治疗癌症的效果显著提高，即使扣除制备的损耗，也能够使得这些20(R)-人参皂甙Rg3衍生物得以经济地使用，从而实践中可以推广相应药物。本发明还提供了这些20(R)-人参皂甙Rg3衍生物的使用方法，包括制药的应用方法和治疗方法等。另外，本发明还提供了制备这些20(R)-人参皂甙Rg3衍生物的方法，能降低20(R)-人参皂甙Rg3原料的损耗，同时适合工业化放大生产。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种如结构通式(Ⅰ)所示的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物，

其中，R1＝H，R2＝C_nH_2n+1CO或R1＝C_nH_2n+1CO，R2＝H或R1＝R2＝C_nH_2n+1CO，n＝3～30。

其中，n优选为8～25，进一步优选为12～20，更进一步优选为15～17，再进一步优选为15。

本发明另一方面提供一种上述结构通式(Ⅰ)所示的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物药学上可接受的盐。

药学上可接受的盐是本领域熟知的。代表性酸加成盐包括但不限于乙酸盐、二己酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、3-苯基丙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。能用于形成药学上可接受盐的优选的酸是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。药学上可接受的碱加成盐中的阳离子包括但不限于碱金属或碱土金属离子如锂、钠、钾、钙、镁和铝等，以及非毒性季铵阳离子如铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。优选的碱加成盐包括磷酸盐、tris和乙酸盐。这些盐一般能够增加多肽的溶解性，而且所形成的盐基本上不改变本发明的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物的药用活性。

本发明提供药物组合物，其包括本发明第一方面的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物或其药学上接受的盐，以及药学上可接受的辅料。

药学上可接受的辅料指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、载体、pH调节剂、离子强度调节剂、缓释或控释剂、包裹材料或其他制剂辅料。所用载体可与相应的给药形式相适应，可使用本领域技术人员所知晓的辅料配成注射剂、(注射用)冻干粉、喷雾剂、口服溶液、口服混悬液、片剂、胶囊、肠溶片、丸剂、粉剂、颗粒剂、持续释放或延迟释释放等制剂。优选本发明第一方面的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物通过注射或经消化道方式给药，因此，本发明的药物组合物优选为注射剂或经消化道给药的制剂，即适于配制成注射和经消化道方式给药的辅料特别优选的。其中，“经消化道给药”在本文中指药物制剂通过患者消化道的给药方式，包括口服、灌胃给药和灌肠给药等，优选是口服，如可使用本领域技术人员所知晓的辅料配成口服溶液、口服混悬液、片剂、胶囊、肠溶片、丸剂、粉剂、颗粒剂、持续释放或延迟释释放等制剂；其中，注射给药的制剂主要是针剂和粉针剂。

本发明又一方面提供一种20(R)-人参皂苷Rg3衍生物的制备方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)将20(R)-人参皂苷Rg3溶于有机溶剂，制得20(R)-人参皂苷Rg3溶液；

2)加入酰化试剂，进行酯化反应；

3)将酯化反应后的混合物去除溶剂后进行硅胶柱层析，即得。

其中，步骤1)中所述的有机溶剂选择吡啶、2，4，6-三甲基吡啶或2，6-二甲基吡啶。

特别是，所述有机溶剂选择无水吡啶、无水2，4，6-三甲基吡啶、或无水2，6-二甲基吡啶。

其中，步骤1)中所述20(R)-人参皂苷Rg3的重量与有机溶剂的体积之比为比1：10～100(g/ml)，优选为1：30-60，进一步优选为1：45。

其中，步骤2)中所述酰化试剂选择酰氯。

特别是，所述酰氯的结构通式为C_nH_2n+1COCl，其中n＝3～30。

特别是，所述酰氯的碳原子数优选为n＝8～25，进一步优选为12～20，更进一步优选为n＝15～17，再进一步优选为n＝15。

尤其是，所述20(R)-人参皂苷Rg3溶液的浓度为0.0212-0.0424M，优选为0.028M。

其中，步骤2)中所述酯化反应的反应温度为-10℃-20℃，优选为0-10℃。

特别是，所述酯化反应的时间为0.5-12h，优选为1-10h。

其中，步骤2)中所述酰化试剂与步骤1)中所述20(R)-人参皂苷Rg3的摩尔比为1.5～3：1，优选为1.7～2.5：1，进一步优选为1.9～2.3：1，更进一步优选为2.0～2.2：1，最优为2：1。

特别是，步骤2)中采用滴加的方式向所述20(R)-人参皂苷Rg3溶液中加入酰化试剂。

尤其是，滴加酰化试剂的速度为向浓度为0.028M的20(R)-人参皂苷Rg3溶液中每1-5秒钟滴加1滴所述酰化试剂，即每1-5秒钟加入50ul所述酰化试剂，优选为每1.5～4秒加入50ul所述酰化试剂，进一步优选为每2秒加入50ul所述酰化试剂。

特别是，在滴加所述酰化试剂的过程中，通入惰性气体防止空气中的水分使酰氯变性的条件下加入所述的酰化试剂。

尤其是，所述的惰性气体选择氮气或氩气，优选为氮气。

特别是，在温度保持为-10～0℃的条件下滴加所述酰化试剂，优选为0℃。

特别是，所述酯化反应是在滴加完所述的酰化试剂之后，在温度为-10℃～20℃的条件下进行所述的酯化反应，优选为0～10℃。

尤其是，所述酯化反应是在通入惰性气体保护的条件下进行。

特别是，所述的惰性气体选择氮气或氩气，优选为氮气。

特别是，还包括淬灭酯化反应，向酯化反应体系中加入水、无水甲醇或无水乙醇中的一种或多种，终止所述的酯化反应。

其中，步骤3)中采用减压蒸馏的方法去除酯化反应后的混合物中的溶剂。

特别是，所述减压蒸馏过程中控制相对压力<0MPa，优选为-0.095～0.05MPa。

特别是，步骤3)中所述硅胶柱层析过程中选择氯仿和甲醇组成的混合液为洗脱剂进行硅胶柱洗脱分离。

其中，所述洗脱剂中氯仿与甲醇的体积之比为9:1。

特别是，所述硅胶柱中的硅胶选择GF254硅胶。

本发明又一方面提供一种如上所述20(R)-人参皂苷Rg3衍生物在制备用于治疗或预防肿瘤、癌症药物中的应用。

本发明的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物用于预防或治疗肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌或胰腺癌。

本发明人发现，本发明的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物的抑瘤率和癌症或肿瘤患者的生命延长率均显著提高，可以直接治疗癌症。所以，本发明的药物组合物不必像现有技术的20(R)-人参皂苷Rg3主要用于预防癌症或肿瘤的转移，因此优选本发明的药物组合物不用于预防癌症或肿瘤的转移，更优选用于治疗癌症或肿瘤，如提高抑瘤率和/或提高癌症或肿瘤患者的生命延长率。

本发明的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物或其药学上接受的盐使肿瘤细胞凋亡或抑制肿瘤细胞增殖生长的作用，其对肿瘤细胞直接凋亡和抑制增殖生长作用不是通过细胞毒作用来实现，具有成为药物的实用性和商业价值。

本发明再一方面提供一种上述20(R)-人参皂苷Rg3衍生物在制备抗多种动物实体瘤、抗人体肺癌、抗乳腺癌、抗胃癌、抗肠癌、抗肝癌、抗胰腺癌等药物中的应用。

本发明20(R)-人参皂苷Rg3衍生物用于治疗人体肺癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞及肝癌细胞的裸鼠移植模型，在低于20(R)-人参皂苷Rg3原药6倍剂量的低剂量水平下获得了显著优于20(R)-人参皂苷Rg3原药[高于20(R)-人参皂苷Rg3衍生物6倍剂量]的治疗效果，具有显著抑制肿瘤生长和延长生存期的治疗作用，抗癌抑瘤效果明显，显著提高抑瘤率、提高癌症或肿瘤患者的生命延长率。

本发明20(R)-人参皂苷Rg3衍生物具有微量高活性的药效学特征，即20(R)-人参皂苷Rg3衍生物给药剂量低于20(R)-人参皂苷Rg3原药的6倍时，其抑制人体肺癌、乳腺癌的效果达到80-91％，而20(R)-人参皂苷Rg3原药在高于20(R)-人参皂苷Rg3衍生物6倍剂量时，其抑制肿瘤的效果仅为61-68％；20(R)-人参皂苷Rg3衍生物在低剂量时就能明显延长人体肿瘤裸鼠移植模型动物的带瘤生存期，其对人体胃癌及肝癌裸鼠的生命延长率为181-192％，而20(R)-人参皂苷Rg3原药在高剂量时也仅为156-159％。

预防和治疗的区别对于本领域技术人员来说是熟知的。预防是在病况还没有发生或发现的时候使用药物(包括对健康个体给药)，如防止肿瘤转移用于预防继发性癌症；而治疗是在病况发生或发现后使用药物，通常仅仅对患病个体给药。

本发明的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物在低剂量单独使用的疗效好，为单独使用提供了基础。20(R)-人参皂苷Rg3衍生物或其药学上接受的盐可以单独使用，但不限制与其他抗癌化合物或者抗癌疗法联合使用。

本发明的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物的有效量为0.001～20mg/kg人个体，优选为0.005～10mg/kg人个体，更优选为0.01～1mg/kg人个体，更优选为0.02～0.5mg/kg人个体，更优选为0.03～0.1mg/kg人个体，更优选为0.05～0.08mg/kg人个体，如为0.064mg/kg人个体。给药时，可以根据人个体的体重来计算出用量。

相应地，由于大多数癌症患者是成人，所以制药企业也能够通过成人的平均体重来换算出药物的单位制剂(如一片或一个胶囊口服药物制剂，或者一针注射用针剂或粉针剂)中本发明的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物的含量。优选在本文中，药物的单位制剂中的本发明第一方面的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物的含量为0.06～1200mg，优选为0.3～600mg，更优选为0.6～60mg，更优选为1.2～30mg，更优选为1.8～6mg，更优选为3～4.8mg，如为3.84mg。

本发明的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物的制备方法的条件温和，易于控制，产品的综合得率高，适宜工业化大规模生产。

本发明的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物低剂量使用时具有良好的抗肿瘤活性，所以突破了有机合成希望合成副产物少的教条，调节的制备过程参数对于单一一种20(R)-人参皂苷Rg3衍生物的收率不是最优的，只在40-60％左右，但是其他属于本发明的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物的副产物也有一定产率，使得20(R)-人参皂苷Rg3这一昂贵的原料能够得到更充分的利用。

附图说明

图1为本发明20(R)-人参皂苷Rg3衍生物体外抑制人结肠癌细胞的显微镜照片图；

图2为本发明20(R)-人参皂苷Rg3衍生物体外抑制人胃癌细胞的显微镜照片图；

图3为本发明20(R)-人参皂苷Rg3衍生物体外抑制人胰腺癌细胞的显微镜照片图。

具体实施方式

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。

实施例1

1、将20(R)-人参皂苷Rg3(4g，5.09mmol)加入180ml干燥的无水吡啶中，搅拌溶解，制得20(R)-人参皂苷Rg3溶液；

本发明实施例中溶解20(R)-人参皂苷Rg3的有机溶剂除了无水吡啶之外，还可以选用无水2，4，6-三甲基吡啶、或无水2，6-二甲基吡啶。

2、在冰浴(0℃)条件下，在向反应容器中通入氮气，排除空气，阻止空气中的水分与酰氯试剂接触，导致酰氯变性的条件下，向20(R)-人参皂苷Rg3溶液中滴加棕榈酰氯(3.07ml，约10mmol)，边滴加边搅拌，滴加速度为1滴(约50ul/滴)/2s(即以每2秒钟一滴的速度向20(R)-人参皂苷Rg3溶液滴加棕榈酰氯)，直至滴加完棕榈酰氯，制得人参皂苷-酰氯混合物；其中，20(R)-人参皂苷Rg3与棕榈酰氯的摩尔比为1:2；

本发明实施例中以通入的惰性气体为氮气为例进行说明，其他惰性气体也适用于本发明，例如氩气、氦气等。

3、滴加结束后，在向反应容器中通入氮气，并在搅拌状态下加热，使人参皂苷-酰氯混合物升温至10℃，并在保持温度为10℃的条件下，进行酯化反应1h；

4、加入无水甲醇(5ml)，淬灭酯化反应，制得酯化反应混合物；

本发明实施例中淬灭酯化反应的淬灭试剂以无水甲醇为例，其他如水、无水甲醇或无水乙醇中的一种或多种均适用于本发明。

5、将酯化反应混合物进行减压蒸馏处理，去除溶剂后进行硅胶柱层析，以氯仿和甲醇组成的混合液为洗脱剂进行洗脱，获得3个化合物，其中，减压蒸馏处理过程中相对压力为-0.095MPa，所述硅胶柱中的硅胶选择GF254硅胶，洗脱剂中氯仿与甲醇的体积之比为9:1。

化合物1(3g)为白色固体，溶于氯仿、甲醇。在TLC板上展开(层析液为氯仿/甲醇10：1，Rf为0.4)后喷雾10％H₂SO₄-乙醇试剂呈现紫红色。ESI-MS谱中，m/z[M+Na]⁺为1284.0，分子量为1261.3。

化合物1的¹H-NMR、¹³C-NMR)如下：

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：5.05(1H，m，H-24)，4.46(2H，d，J＝7.6Hz，H-1″)，4.28(3H，dd，J＝8.5Hz，17Hz，H-6′&H-1′)，4.01(2H，s，H-6′)，3.41(2H，J＝8.4Hz，H-12α&H-3″)，3.37(2H，s，H-20&H-4″)，3.31(2H，s，H-2′&H-2″)，3.19(1H，t，J＝8.8Hz，H-3′)，3.09(1H，d，J＝8.8Hz，H-4′)，3.04(2H，t，J＝9.4Hz，H-5′&H-5″)，2.95(1H，d，J＝10.8Hz，H-3α)，2.2(4H，t，J＝6Hz，H-2^a&H-2^b)，1.70-2.0(4H，s，H-16&H-2)，1.59(4H，m，H-26，H-13)，1.53(8H，m，H-27&Me-30&Me-6)，1.43-1.32，(52H，m，fatty carbon)，1.10-1.15(4H，s，H-11&H-15)，0.97(5H，H-21&H-23)，0.93(3H，dd，J＝12.8Hz，H-28)，0.85(6H，s，H-16^a&H-16^b)，0.71(9H，s，Me-18&Me-19&Me-29)，0.67(1H，t，J＝12.8Hz，H-5)；

¹³C-NMR(100MHz，d₆-DMSO)δ(ppm)：172.96(C-1a)，172.75(C-1b)，129.23(C-25)，124.59(C-24)，104.60(C-1″)，103.72(C-1′)，89.00(C-3)，82.71(C-2′)，77.11(C-3″)，76.68(C-3′)，75.47(C-2″)，74.43(C-5″)，73.91(C-5′)，72.46(C-20)，70.86(C-4″)，70.36(C-4′)，70.18(C-12)，63.92(C-6″&6′)，56.34(C-5)，51.39(C-14)，50.16(C-17)，49.99(C-9)，48.73(C-13)，42.59(C-22)，40.25(C-4)，40.04(C-8)，39.25(C-1)，36.85(C-10)，35.01(C-7)，34.22(C-2a&C-2b)，31.59(C-11)，31.16(C-15)，29.47(C-3a&C-4a&C-5a&C-6a&C-3b&C-4b&C-5b&C-6b)，29.40(C-7a&C-8a&C-9a&C-7b&C-8b&C-9b)，29.18(C-10a&C-11a&C-12a&C-10b&C-11b&C-12b)，29.05(C-13a&C-13b)，27.22(C-28)，25.64(C-16)，24.96(C-2)，24.83(C-26)，22.39(C-21)，22.31(C-15a&C-15b)，21.93(C-23)，18.29(C-6)，17.65(C-30)，17.26(C-27)，16.17(C-29)，16.13(C-19)，15.80(C-18)，14.03(C-16a&C-16b)ppm

根据ESI-MS、¹H-NMR和¹³C-NMR的测试数据，确定化合物1的结构式为

确定化合物1为20(R)-人参皂苷Rg3-6′,6″-二棕榈酸酯。

化合物2(680mg)为白色固体，溶于氯仿、甲醇。在TLC板上展开(层析液为氯仿/甲醇7：1，Rf为0.4)后喷雾10％H₂SO₄-乙醇试剂呈现紫红色。ESI-MS谱中，m/z[M+Na]⁺为1045.7，其分子量为1022.7。

化合物2的¹H-NMR、¹³C-NMR如下：

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：5.07(1H，m，H-24)，4.42(1H，d，J＝7.6Hz，H-1″)，4.29(2H，dd，J＝8.5Hz，17Hz，H-6′&H-1′)，4.03(3H，s，H-6′)，3.62(2H，d，J＝9.44Hz，H-12α&H-3″)，3.59(2H，s，H-20&H-4″)，3.50(2H，s，H-2′&H-2″)，3.35(1H，t，J＝8.8Hz，H-3′)，3.13(1H，d，J＝8.8Hz，H-4′)，3.04(2H，t，J＝9.4Hz，H-5′&H-5″)，2.95(1H，d，J＝10.8Hz，H-3α)，2.27(2H，t，J＝1.8Hz，H-2^a)，1.69-2.03(4H，s，H-16&H-2)，1.62(4H，m，H-26，H-13)，1.55(8H，m，H-27&Me-30&Me-6)，1.23(26H，m，H-fattycarbon)，1.05-1.14(4H，s，H-11&H-15)，0.97(5H，d，J＝5.2Hz，H-21&H-23)，0.91(3H，m，H-28)，0.85(6H，s，H-16^a)，0.73(9H，s，Me-18&Me-19&Me-29)，0.67(1H，t，J＝12.8Hz，H-5)。

¹³C-NMR(100MHz，d₆-DMSO)δ(ppm)：172.98(C-1a)，130.41(C-25)，125.62(C-24)，104.51(C-1″)，103.99(C-1′)，88.86(C-3)，81.70((C-2′)),77.29(C-3″)，76.56(C-3′)，76.45(C-5″),75.72(C-2″)，73.63(C-5′)，72.38(C-20)，70.22(C-4″&C-4′)，70.15(C-12)，63.85(C-6′)，61.23(C-6″)，56.13(C-5)，51.39(C-14)，49.68(C-9)，48.48(C-13)，42.57(C-22)，40.31(C-4),40.03(C-8)，39.26(C-1)，36.68(C-10)，34.85(C-7)，34.24(C-1′)，31.82(C-14a),31.78(C-11)，31.68(C-14a&C-14b)，31.08(C-15)，29.68(C-3a&4a&5a)，29.64(C-6a&7a)，29.57(C-8a&9a)，29.42(C-10a&11a)，29.24(C-12a)，29.18(C-13a)，27.82(C-28)，26.21(C-1′)，26.10(C-1′)，25.95(C-16)，25.11(C-2)，22.60(C-15a)，21.92(C-23)，18.18(C-6)，17.83(C-30)，17.13(C-27)，16.36(C-29)，15.75(C-18)，14.43(C-16a)。

根据ESI-MS、¹H-NMR和¹³C-NMR的测试数据，确定化合物2的结构式为

确定化合物2为20(R)-人参皂苷Rg3-6′-棕榈酸酯。

化合物3(690mg)为白色固体，溶于氯仿、甲醇。在TLC板上展开(层析液为氯仿/甲醇7：1，Rf为0.4)后喷雾10％H₂SO₄-乙醇试剂呈现紫红色。ESI-MS谱中，m/z[M+Na]⁺为1045.7，其分子量为1022.7。

化合物3的¹H-NMR、¹³C-NMR如下：

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：5.05(1H，m，H-24)，4.45(1H，d，J＝7.6Hz，H-1″)，4.31(2H，dd，J＝8.5Hz，17Hz，H-6′&H-1′)，3.99(3H，s，H-6′)，3.74(2H，d，J＝9.44Hz，H-12α&H-3″)，3.64(2H，s，H-20&H-4″)，3.57(2H，s，H-2′&H-2″)，3.23(1H，t，J＝8.8Hz，H-3′)，3.17(1H，d，J＝8.8Hz，H-4′)，3.09(2H，t，J＝9.4Hz，H-5′&H-5″)，2.99(1H，d，J＝10.8Hz，H-3α)，2.25(2H，t，J＝1.8Hz，H-2^a)，1.69-2.03(4H，s，H-16&H-2)，1.62(4H，m，H-26，H-13)，1.55(8H，m，H-27&Me-30&Me-6)，1.22(26H，m，fatty carbon)，1.05-1.14(4H，s，H-11&H-15)，0.97(5H，d，J＝5.2Hz，H-21&H-23)，0.91(3H，m，H-28)，0.85(6H，s，H-16^a)，0.72(9H，s，Me-18&Me-19&Me-29)，0.69(1H，t，J＝12.8Hz，H-5)。

化合物3的¹³C-NMR(100MHz，d₆-DMSO)δ(ppm)：173.29(C-1a)，130.45(C-25)，125.54(C-24)，104.85(C-1″)，103.88(C-1′)，88.75(C-3)，83.31(C-2′)，77.10(C-3″)，76.89(C-3′)，76.33(C-5′)，75.46(C-2″)，74.11(C-5″)，72.34(C-20)，70.08(C-4″)，69.83(C-12)，63.95(C-6″)，61.42(C-6′)，55.94(C-5)，51.35(C-14)，49.98(C-17)，49.76(C-9)，48.42(C-13)，42.49(C-22)，40.29(C-4)，39.03(C-8&C-1)，36.65(C-10)，34.81(C-7)，33.88(C-2b)，31.82(C-14a)，31.79(C-11)，31.03(C-1″)，30.43(C-14b)，29.62(C-3b&C-4b&C-5b)，29.57(C-6b&7b)，29.42(C-8b&9b),29.39(C-10b&11b),29.32(C-12b),29.20(C-13b)，27.63(C-28)，26.19(C-16)，25.91(C-2)，24.87(C-26)，22.56(C-15b),22.48(C-21)，21.89(C-23)，18.19(C-6)，17.84(C-30)，17.14(C-27)，16.36(C-29)，16.13(C-19)，15.74(C-18)，14.37(C-16b)。

根据ESI-MS、¹H-NMR和¹³C-NMR的测试数据，确定化合物3的结构式为

确定化合物3为20(R)-人参皂苷Rg3-6″-棕榈酸酯。

实施例2

1、将20(R)-人参皂苷Rg3(4g，5.09mmol)加入180ml干燥的无水吡啶中，搅拌溶解，制得20(R)-人参皂苷Rg3溶液；

2、在冰浴(-10℃)条件下，向反应容器中通入氮气，排除空气，阻止空气中的水分与酰氯试剂接触，导致酰氯变性的条件下，向20(R)-人参皂苷Rg3溶液中滴加棕榈酰氯(3.07ml，约10mmol)，边滴加边搅拌，滴加速度为1滴/2s，直至滴加完棕榈酰氯，制得人参皂苷-酰氯混合物；其中，20(R)-人参皂苷Rg3与棕榈酰氯的摩尔比为1:1.9。

本发明实施例中滴加酰化试剂酰氯的过程中滴加速度以1滴/2s为例进行说明，其他滴加速度如1滴/1-5s均适用于本发明。

3、在始终向反应容器中通入惰性气体(氮气)的条件下，滴加完酰氯试剂后，在搅拌状态下加热，使人参皂苷-酰氯混合物升温至0℃，并保持温度为0℃进行酯化反应10h；

4、加入无水甲醇(5ml)，淬灭酯化反应，制得酯化反应混合物；

5、将酯化反应混合物进行减压蒸馏处理，去除溶剂后进行硅胶柱层析，以氯仿和甲醇组成的混合液为洗脱剂进行洗脱，获得3个化合物，其中，减压蒸馏处理过程中相对压力为-0.095MPa，所述硅胶柱中的硅胶选择GF254硅胶，洗脱剂中氯仿与甲醇的体积之比为9:1。

制得的3个化合物经过ESI-MS、¹H-NMR和¹³C-NMR的测定，与实施例1制备的3个化合物相同，分别为化合物1(3.1g)；化合物2(820mg)；化合物3(810mg)。

实施例3

1、将20(R)-人参皂苷Rg3(4g，5.09mmol)加入180ml干燥的无水吡啶中，搅拌溶解，制得20(R)-人参皂苷Rg3溶液；

2、在冰浴(0℃)条件下，在向反应容器中通入氮气，排除空气，阻止空气中的水分与酰氯试剂接触，导致酰氯变性的条件下，向20(R)-人参皂苷Rg3溶液中滴加棕榈酰氯(3.07ml，约10mmol)，边滴加边搅拌，滴加速度为1滴/2s，直至滴加完棕榈酰氯，制得人参皂苷-酰氯混合物；其中，20(R)-人参皂苷Rg3与硬脂酰氯的摩尔比为1:2.3；

3、在始终向反应容器中通入惰性气体(氮气)的条件下，滴加完酰氯试剂后，在搅拌状态下加热，使人参皂苷-酰氯混合物升温至5℃，并在保持温度为5℃的条件下，进行酯化反应1h；

4、加入无水甲醇(5ml)，淬灭酯化反应，制得酯化反应混合物；

5、将酯化反应混合物进行减压蒸馏处理，去除溶剂后进行硅胶柱层析，以体积比为9:1的氯仿和甲醇组成的混合液为洗脱剂洗脱后获得3个化合物(化合物4、5、6)，其中，减压蒸馏处理过程中相对压力为-0.095MPa。

制得的3个化合物经过ESI-MS、¹H-NMR和¹³C-NMR的测定，与实施例1制备的3个化合物相同，分别为化合物1(2.9g)；化合物2(710mg)；化合物3(700mg)。

实施例4

1、将20(R)-人参皂苷Rg3(4g，5.09mmol)加入180ml干燥的无水吡啶中，搅拌溶解，制得20(R)-人参皂苷Rg3溶液；

2、在冰浴(0℃)条件下，在向反应容器中通入氮气，排除空气，阻止空气中的水分与酰氯试剂接触，导致酰氯变性的条件下，向20(R)-人参皂苷Rg3溶液中滴加棕榈酰氯(3.07ml，约10mmol)，边滴加边搅拌，滴加速度为1滴/2s，直至滴加完硬脂酰氯，制得人参皂苷-酰氯混合物；其中，20(R)-人参皂苷Rg3与硬脂酰氯的摩尔比为1:2。

3、在始终向反应容器中通入惰性气体(氮气)的条件下，滴加完酰氯试剂后，在搅拌状态下加热，使人参皂苷-酰氯混合物升温至5℃，并在保持温度为5℃的条件下，进行酯化反应10h；

4、加入无水甲醇(5ml)，淬灭酯化反应，制得酯化反应混合物；

5、将酯化反应混合物进行减压蒸馏处理，去除溶剂后进行硅胶柱层析，以氯仿和甲醇组成的混合液为洗脱剂进行洗脱，获得3个化合物，其中，减压蒸馏处理过程中相对压力为-0.095MPa，所述硅胶柱中的硅胶选择GF254硅胶，洗脱剂中氯仿与甲醇的体积之比为9:1。

制得的3个化合物经过ESI-MS、¹H-NMR和¹³C-NMR的测定，与实施例1制备的3个化合物相同，分别为化合物1(3.3g)；化合物2(800mg)；化合物3(800mg)。

实施例5 20(R)-人参皂苷Rg3及其衍生物体外抗消化道肿瘤试验比较

1、实验材料

1)受试药物

本发明实施例1制备的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物(即化合物1、2、3)、20(R)-人参皂苷Rg3(中国生物制品检验所，经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定，其纯度为99.6％)

将精确称量上述化合物1、2、3各10μg，分别加入100μl DMEM培养液溶解，于3000rpm离心，吸取上清，-20℃冷冻保存。0.22μm滤膜过滤除菌，备用。

精确称量3份20(R)-人参皂苷Rg3，每份50μg，分别加入100μl DMEM培养液溶解，于3000rpm离心，吸取上清，-20℃冷冻保存。0.22μm滤膜过滤除菌，备用。

2)配制溶液

DMEM培养液：购自Hyclone公司,为基础培养基，培养细胞所使用培养基中本培养基占90％，胎牛血清占10％。

冻存液：胎牛血清(已灭活，过滤除菌)90℅与二甲基亚砜(DMSO)10℅混合，-20℃冰箱保存备用。

BS缓冲液：准确称量NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO4 1.44g、KH₂PO₄ 0.24g，定容1L，调pH 7.4，配制成0.01mol/L(1*PBS),过滤除菌、分装，4℃保存备用。

3)细胞系选择

肿瘤细胞系：胃癌SGC-7901细胞，胰腺癌PANC1细胞系，结肠癌LOVO细胞系。

2、试验方法及主要步骤

1)实验分组：

①正常培养组(Normal)；②Rg3原药组：浓度为50μg/ml的20(R)-人参皂苷Rg3药液；③衍生物组1为化合物1、2；衍生物组2为化合物3、4；衍生物组3为化合物5、6，它们的浓度均为10μg/ml。

2)细胞生长情况观察：

生长状况良好肿瘤细胞系，常规消化制成单细胞悬液，计数，调整细胞成浓度为5×10⁴/ml均匀接种细胞于24孔板，每个实验组设6个复孔，共4个实验组。将上述细胞系试验孔板放于37℃、5％CO2孵箱内，传代后待细胞生长至60-70％融合，正常培养组换液，其他组分别加入相应浓度的药物，记录加药时间点。加药后培养24h、48h、72h后，在每个时间点使用倒置荧光显微镜(Olympus BX51，Olympus DP70；日本Olympus生产)对孔板进行拍照记录，每孔一张，根据复孔总体情况选择有代表性图片，主要通过观察细胞数和状态确定。

3)实验结果

20(R)-人参皂苷Rg3及其衍生物体外抗人结肠癌试验结果如图1所示，20(R)人参皂苷Rg3原药与其衍生物体外对人结肠癌LOVO细胞系增殖的影响初步观察结果(荧光显微照片)。Rg3衍生物A和B(即化合物1和2)在剂量低于Rg3原药5倍时，对人结肠癌LOVO细胞具有凋亡和抑制增殖生长作用，其疗效明显优于Rg3原药。

20(R)-人参皂苷Rg3及其衍生物体外抗胃癌试验结果如图2所示，20(R)人参皂苷Rg3原药与其衍生物体外对胃癌SGC-7901细胞系的影响初步观察结果荧光显微照片。Rg3衍生物B、C(化合物2和3)在剂量低于Rg3原药5倍时，对人胃癌SGC-7901细胞具有凋亡和抑制增殖生长作用，其疗效明显优于Rg3原药。

20(R)-人参皂苷Rg3及其衍生物体外抗人体胰腺癌试验结果见附图3，20(R)人参皂苷Rg3原药与其衍生物体外对人体胰腺癌PANC1细胞系增殖的影响初步观察结果(荧光显微照片)。Rg3衍生物A、C(化合物1和3)在剂量低于Rg3原药5倍时，对人胃癌SGC-7901细胞具有凋亡和抑制增殖生长作用，其疗效明显优于Rg3原药。

从上述实验结果可知：体外试验证明20(R)-人参皂苷Rg3衍生物对人体胃癌、结肠癌、胰腺癌等消化道肿瘤细胞具有明显引起肿瘤细胞凋亡及抑制增殖的作用，而非细胞毒作用，其效果也明显优于20(R)-人参皂苷Rg3；与其他化学合成药物不同的是，20(R)-人参皂苷Rg3衍生物不具有细胞毒作用而能使肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖生长，这在临床治疗中会表现低毒高效的优势，这也是20(R)-人参皂苷Rg3衍生物的一个治疗优势。

实施例6 20(R)-人参皂苷Rg3及衍生物对肿瘤的抑制作用试验

1、试验材料与方法

1.1试验动物

裸小鼠、C57BL/6小鼠均由吉林大学白求恩医学院实验动物中心出售，合格证号:SCXK 20020001。裸小鼠为6周龄，C57BL/6小鼠为18～22克，雌雄均可。

1.2药品与仪器

受试药物：实施例1制备的化合物1-3，纯度均大于98.2％；20(R)-人参皂苷Rg3(简称20(R)-Rg3)，纯度98.5％，购自大连富生天然药物开发有限公司，批号：20110515。

稀释辅料：0.5％CMC-Na溶液。

配制方法精密称取一定量的20(R)-人参皂苷Rg3及其衍生物加入5％CMC-Na制成混悬液至所需浓度即可。

阳性药物：注射用环磷酰胺(缩写为CTX)，上海华联制药集团生产，批号：20110120。

瘤源：人体肺癌A549模型、人体乳腺癌Bcap-37模型、人体胃癌MGC模型及人体肝癌QGY均第二代以上的肿瘤用作瘤源，均购自上海医药工业研究院。

1.3实验方法

1.3.1给药方案

试验组的各20(R)-人参皂苷Rg3衍生物组(即化合物1-6组)分别为3.0mg/kg、1.5mg/kg、0.75mg/kg均隔天给药一次，共给药10次；20(R)-人参皂苷Rg3组(20(R)-Rg3组)给药剂量均为3.0mg/kg。化疗给药环磷酰胺组(CTX、阳性对照组)或腹腔给药,每天一次,连续7天。阴性对照组为相应辅料0.5％CMC-Na混悬液。

1.3.2人体肺癌A549、人体乳腺癌Bcap-37腋皮下接种模型

无菌条件下取生长旺盛的瘤源，以匀浆法制备成约1～2×10⁷/ml细胞悬液；于相应宿主(或裸鼠)足趾皮下或腋皮下接种0.2ml/鼠，次日按实验设计方案给药，三周左右处死各组动物，剖取肿瘤称重，按下列公式计算肿瘤抑制率:

肿瘤抑制率％＝[(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％

1.3.3胃原位接种模型

无菌条件下取生长旺盛的体内传2代的MGC胃癌，以匀浆法制备成约2×10⁷/ml细胞悬液,经手术于裸小鼠的胃大弯肌层内注射细胞悬液0.05ml，次日按实验设计方案给药，按下列公式计算荷瘤宿主生命延长率:

生命延长率％＝给药组平均生存天/对照组平均生存天×100％

1.3.4肝原位接种模型

无菌条件下取生长旺盛的体内传第二代QGY瘤源，以匀浆法1:6制备成约1-2×10⁷/ml细胞悬液，匀浆经100目不锈钢筛网过滤，备用。裸小鼠常规消毒，麻醉于腹腔正中剑突下切开皮肤和腹腔，暴露肝脏，经肝实质部以进口的28ga 1/2ml注射器注射0.05ml细胞悬液，关闭腹腔，逐层缝合腹腔及皮肤。裸小鼠置于层流架中饲养，所用的饲料、垫料、笼具及接触的器械等均应高压消毒后使用。次日按实验设计方案给药，观察各组动物45天内的生存时间，与阴性对照组进行比较，统计生命延长率，计算方法同1.3.3。

2、试验结果

受试的各化合物组对人体肺癌A549抑瘤试验结果见表1；对人体乳腺癌Bcap-37(皮下接种)抑瘤试验结果见表2；对裸鼠接种人体胃癌MGC(原位接种)及人体肝癌QGY(原位接种)的延长生命率试验结果分别见表3和表4。

表1对人体肺癌A549(皮下接种)疗效试验(n＝3)

^***：为与阴性对照组相比p值<0.01；

^###：为Rg3衍生物与Rg3原药相比p值<0.01。

表2 Rg3原药及衍生物对人体乳腺癌Bcap-37(皮下接种)裸鼠模型疗效试验(n＝3)

^***：为与阴性对照组相比p值<0.01；

^###：为Rg3衍生物与Rg3原药相比p值<0.01。

表3对人体胃癌MGC裸鼠模型(原位接种)疗效试验(n＝3)

^***：为与阴性对照组相比p值<0.01；

^###：为Rg3衍生物与Rg3原药相比p值<0.01。

表4对人体肝癌QGY裸鼠模型(原位接种)疗效试验(n＝3)

^***：为与阴性对照组相比p值<0.01；

^###：为Rg3衍生物与Rg3原药相比p值<0.01。

从上述表1-4的实验结果可知：化合物1-3可以对人体乳腺癌Bcap-37(皮下接种)有明显的抑制作用，对人体胃癌MGC裸鼠模型和人体肝癌QGY裸鼠模型有明显的生命延长作用。

试验例7急性毒性试验

选取NIH系健康小白鼠20只，体重为18～20克，雌雄各半。实验前先禁食12小时，实验时，以小白鼠能耐受的最大浓度、最大体积的药量，将本发明20(R)-人参皂苷Rg3衍生物——化合物1-3配成30％浓度，按照15g/kg体重灌胃给药1次，观察7天。实验结果未测出本发明的中药组合物对小鼠LD₅₀值，该剂量相当于临床剂量的2343750倍，本发明Rg3系列衍生物对小白鼠灌胃给药的最大耐受量大于15g/kg，表明本发明的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物求无急性毒性反应，安全性好。

Claims (10)

1.一种如结构通式(Ⅰ)所示的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物或其药学上可接受的盐，

其中，R1＝H，R2＝C_nH_2n+1CO或R1＝C_nH_2n+1CO，R2＝H或R1＝R2＝C_nH_2n+1CO，n＝3～30。

2.一种如权利要求1所述的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下顺序进行的步骤：

1)将20(R)-人参皂苷Rg3溶于有机溶剂，制得20(R)-人参皂苷Rg3溶液；

2)加入酰化试剂，进行酯化反应；

3)将酯化反应后的混合物去除溶剂后进行硅胶柱层析，即得。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤1)所述有机溶剂选择吡啶、2，4，6-三甲基吡啶或2，6-二甲基吡啶。

4.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于步骤2)所述酰化试剂为酰氯。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述酰氯的结构通式为C_nH_2n+1COCl，其中n＝3～30。

6.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于步骤2)所述所述酰化试剂与步骤1)中所述20(R)-人参皂苷Rg3的摩尔比为1.5～3：1。

7.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于步骤2)中所述酯化反应的反应温度为-10℃-20℃；反应时间为0.5-12h。

8.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于所述酯化反应在通入惰性气体保护的条件下进行。

9.如权利要求1所述的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物在制备预防或/和治疗癌症、肿瘤药物中的应用。

10.如权利要求1所述的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物在制备抗多种动物实体瘤、抗肺癌、抗乳腺癌、抗胃癌、抗肠癌、抗肝癌、抗胰腺癌药物中的应用。