CN102838652A - 一种具有抗恶性肿瘤作用的齐墩果酸衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗恶性肿瘤药物技术领域，提供具有式Ⅰ结构的齐墩果酸衍生物，其中R¹为氢，C₁-C₄直链或支链烷基；R²为被卤素，羟基，C₁-C₄直链或支链烷基，C₁-C₄直链或支链烷氧基取代的乙基。本发明还涉及上述化合物的制备方法，并同时公开了以该化合物作为活性有效成分的药物组合物，以及它们在作为抗恶性肿瘤药物方面的应用。

Description

一种具有抗恶性肿瘤作用的齐墩果酸衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，更确切地说，是涉及一类具有抗恶性肿瘤作用的化合物及其制备方法。

背景技术

齐墩果酸（Oleanic acid，OA）别名土当归酸，庆四素。以游离形式或结合成苷的形式广泛存在于自然界中。特别是在青叶胆全草、女贞子果实、白花蛇舌草、山楂、丁香、大枣、枇杷叶、夏枯草等植物中含量较高。OA是一种齐墩果烷型五环三萜类化合物，白色针状结晶，不溶于水，可溶于乙醇、氯仿、乙醚、丙酮、由于其在自然界分布广泛且结构较为复杂人工合成困难，目前主要从中药植物中提取。国内外的大量研究表明OA具有护肝降酶、解肝毒、降糖、降脂、治疗胃溃疡、抗炎、抗HIV、强心利尿、抗肿瘤、抗突变、抗氧化等药理作用（昌盛，李龙.齐墩果酸药理作用研究进展，广州化工，2011，39（14）：30-32），尤其对急性黄疸型肝炎和慢性病毒性肝炎疗效显著。又因其毒性低，副作用小，应用安全广泛应用于临床。

OA临床制剂主要以片剂和滴丸剂为主，由于其水溶性很差（20℃时0.11461g），为了提高生物利用度近几年来新剂型的研究和开发成为了一个热点。例如将其制备成脂质体（王梅，高晓黎.齐墩果酸新型前体脂质体的制备和性质研究，2007,42（11）：839-843）。

此外，还有研究表明可以通过将OA成盐（CN1248583）或进行结构修饰的方法来提高OA的水溶性进而改善其生物利用度。陈莉等将其3和28位进行结构改造，得到了一种新型的NO供体型具有协同保肝活性的新化合物（陈莉，许昌胜，孟飞，等.单／双硝酸酯类齐墩杲酸衍生物的合成及生物活性，药学进展，2010,34（12）：559-564）。赵龙铉等研究了28位酯化后化合物的抗癌活性（赵龙铉，贺兴隆，金礼吉，等.齐墩果酸和甘草次酸衍生物的合成与表征及抗癌活性研究，辽宁师范大学学报，2010,33（4）：474-479）。李群林等在3位或28位引入取代基以提高其抗HIV活性（李群林，顾军，李灵芝.齐墩果酸衍生物的合成，合成化学，2010,18，（3）：290-296）。Yoshikawa等对连接不同糖基后OA降糖活性的改变进行了研究（Ma Chaomei，Nakamura Norio，Miyashiro Hirotsugu，et a1．Inhibitory effects of constituents from Cynomoriumsongaricum and related triterpene derivatives on HIV-1Protease．Chem Pharm Bul1．1999．47(2)：141），还有在其母核上引入羰基、羟基和双键等官能团。另外一些专利文献中也涉及了OA结构改造方面的工作：CN1414012，CN101235071，CN1715291，CN1724556，CN102286056A，CN101402667，CN101525366，CN101724007A，CN102070697A。

但是，其中通过结构改造的方法提高其抗肿瘤活性的报道不多见。目前临床常用的抗肿瘤药物大多具有较强的毒副作用，甚至对正常组织、器官产生损害，进行治疗的同时会造成很大的痛苦，严重地降低了患者的生活质量，甚至导致死亡。

发明内容

本发明的一个目的在于，公开一类齐墩果酸衍生物类化合物。

本发明的另一个目的在于，公开了以一类齐墩果酸衍生物类化合物为主要活性成分的药物组合物。

本发明的再一个目的在于，公开了一类齐墩果酸衍生物类化合物的制备方法。

本发明还有一个目的在于，公开了一类齐墩果酸衍生物类化合物，作为抗恶性肿瘤药物方面的应用，特别是在用于制备治疗肝癌、白血病、结肠癌、口腔癌药物方面的用途。

本发明具体涉及通式Ⅰ结构的化合物：

其中：

R¹为氢，C₁-C₄直链或支链烷基；

R²为被卤素，羟基，C₁-C₄直链或支链烷基，C₁-C₄直链或支链烷氧基取代的乙基；

本发明所述的C₁-C₄直链或支链烷基具体代表甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，仲丁基，叔丁基等；卤素为氟、氯、溴等。

本发明涉及的具有式Ⅰ结构的化合物，其中部分化合物为：

式Ⅰ化合物的制备路线如下：

其中R¹、R²的定义如前所述。

将齐墩果酸溶于二氯甲烷、三氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮等溶剂中，再加入Sarrett试剂和与其等量的硅藻土，搅拌反应。反应完毕后过滤，滤液水洗，干燥，柱分离得到中间体Ⅱ。中间体Ⅱ在甲醇、乙醇或丙酮等溶剂中，与盐酸羟氨类化合物在三乙胺、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠或氢氧化钾等缚酸剂的催化下，-30～85℃反应制得关键中间体Ⅲ。将中间体Ⅲ溶于二氯亚砜，回流反应，即可得到中间体Ⅳ。

将中间体Ⅲ溶解在二氯甲烷或三氯甲烷中，加入DCC，反应一段时间后加入DMAP，然后再加入相应的胺，反应得到目标化合物Ⅰ；或者将中间体Ⅳ溶于二氯甲烷或三氯甲烷中，在三乙胺、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠或氢氧化钾等缚酸剂的催化下，和相应的胺反应得到目标化合物Ⅰ。

此类化合物对于治疗人类恶性肿瘤是有效的。尽管本发明的化合物可以不经任何配制直接给药，但所述的各种化合物优选以药物制剂的形式使用，给药途径可以是非肠道途径（如静脉、肌肉给药）及口服给药。

本发明化合物的药物组合物制备方法如下：使用标准和常规的技术，使本发明化合物与制剂学上可接受的固体或液体载体结合，以及使之任意地与制剂学上可接受的辅助剂和赋形剂结合制备成微粒或微球。固体剂型包括片剂、分散颗粒、胶囊、缓释片、缓释微丸等等。固体载体可以是至少一种物质，其可以充当稀释剂、香味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂以及包裹剂。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、聚山梨酯80、糊精、淀粉、明胶、纤维素类物质例如甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液体剂型包括溶剂、悬浮液例如注射剂、粉剂等等。

药物组合物以及单元剂型中含有的活性成份（本发明化合物）的量可以根据患者的病情、医生诊断的情况特定地加以应用，所用的化合物的量或浓度在一个较宽的范围内调节。通常，活性化合物的量范围为组合物的0.5％～90％（重量），另一优选的范围为0.5%～70%。

本发明的具有式Ⅰ结构的化合物或其药学上可接受的盐，在体外、体内对肿瘤有明显的抑制作用。

体外的抗肿瘤作用

（1）实验方法：

采用经典的细胞毒活性体外检测法MTT法，检测发明化合物对体外培养的人肿瘤细胞的细胞增殖毒性。

（2）实验材料：

实验样品：齐墩果酸的衍生物类化合物由发明人自制提供。实验时样品以DMSO助溶，无血清DMEM培养基稀释到所需浓度，部分样品溶液呈悬浮状。

主要试剂：MTT，Amresco公司分装，批号：04M0904；完全DMEM培养基，Gibco公司产品，批号：1290007；小牛血清，兰州民海生物，批号：20060509；胰蛋白酶，Amresco公司分装，批号：016B0604；氟尿嘧啶注射液，0.25g/10ml(支)，批号：0512022，天津金耀氨基酸有限公司。

实验仪器：超净工作台，苏州净化设备厂；CO₂培养箱，Thermo公司，型号：HERACell150；倒置显微镜，Carl Zeiss公司，型号：Axiovert 200；酶联免疫检测仪，TECAN公司，型号：Sunrise；离心机，Kerdro公司，型号：Heraeus。

细胞株：肝癌SMMC-7721细胞、早幼粒细胞白血病HL-60细胞、结肠癌SW-480细胞、口腔癌KB细胞，均购自中国科学院上海细胞研究所。

（3）实验步骤：

细胞培养：肿瘤细胞接种在含10%小牛血清，100IU/ml青霉素G钠盐及100ug/ml硫酸链霉素的DMEM培养液中，置于37℃、100%相对湿度、含5%CO₂的培养箱中，传代3次后备用。

MTT法测定：取对数生长期的细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后（悬浮细胞无须消化），悬浮于含10%小牛血清的DMEM培养液中，用玻璃滴管轻轻吹打成单细胞悬液，显微镜下用血细胞记数板记数活细胞。96孔培养板每孔接种细胞悬液90μL（细胞浓度调整为6～10×10⁴个/mL），在37℃、100%相对湿度、含5%CO₂、95%空气的培养箱培养24h后，每孔加10μL药液（终浓度设为：40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL和2.5μg/mL五个浓度）。另外，每个浓度设阴性对照（等浓度DMSO）及空白本底（不加细胞），各组均设6个复孔。再连续培养24h，然后每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，继续培养4h后，仔细吸去上清液（悬浮细胞，需要先离心，再吸去上清）。每孔加入100μL DMSO，置微量振荡器震荡5min以使结晶完全溶解，酶标仪492nm单波长比色，测定OD值。以下述方法计算细胞生长抑制率作为评价指标。

抑制率(%)=[1-（实验组OD均值-空白组OD均值）/（对照组OD均值-空白组OD均值）]×100％。根据细胞生长抑制率，以直线回归方法计算IC₅₀值。

（4）实验结果：

表1对体外培养的肿瘤细胞的IC₅₀(μg/mL)

（5）结论：

根据上述体外试验结果（见表1），我们可以看出具有式Ⅰ结构的化合物对上述4种人类肿瘤细胞具有较强的抑制作用，尤其对结肠癌SW-480细胞和肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用较突出，其中Ⅰ-2对4种肿瘤细胞的抑制作用较突出。

体内的抗肿瘤作用

（1）实验材料：

样品：I-2由发明人自制提供。

细胞株：肝癌H22细胞，购自中国科学院上海细胞研究所。

阳性对照药：环磷酰胺，批号：07020121，江苏恒瑞医药股份有限公司。

仪器：PB303-N型千分之一电子天平，梅特勒-托利多公司生产。

动物：昆明种小鼠，SPF级，雌雄各半，体重18-22g，购于中国医学科学院放射医学研究所，合格证号：SCXK（津）2005-0001。

（2）实验方法：

取腹腔接种瘤株9天，肿瘤生长良好，腹部膨隆明显的荷瘤小鼠，无菌操作下吸取腹水，按1：3生理盐水稀释配成癌细胞混悬液，于所有实验小鼠右前肢腋部皮下接种（0.2mL/鼠），所有操作在30min内完成。次日将接种瘤液小鼠按体重随机分组，即荷瘤对照组，环磷酰胺组（25mg/kg），I-2组（100mg/kg、50mg/kg）。各给药组均腹腔注射给药，每日一次，对照组给予同体积生理盐水。小鼠连续给药10天，末次给药24h后，脱颈椎处死，剥离肿瘤，称取瘤重，计算各组小鼠瘤重平均值及抑制率。

抑制率=[（对照组平均瘤重-实验组平均瘤重）/对照组平均瘤重]×100%

（3）结果：

表2对H22荷瘤小鼠瘤重及抑制率的影响

（4）结论：

从上述动物体内试验结果（见表2），可以看出I-2对H22荷瘤小鼠的肿瘤生长具有一定的抑制作用。两个剂量组腹腔注射给药时，肿瘤生长抑制率均强于阳性对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步地说明，实施例仅为解释性的，决不意味着它以任何方式限制本发明的范围。所述的化合物经高效液相色谱（HPLC），薄层色谱（TLC）进行检测。随后可以采用诸如红外光谱（IR），核磁共振谱（¹H NMR，¹³C NMR），质谱（MS）等更进一步确证其结构。

参考实施例1：中间体Ⅱ的合成

将4.57g（0.01mol）齐墩果酸溶解于25mL二氯甲烷中，滴加5.40g（0.025mol）PCC的二氯甲烷溶液30mL，再加入与PCC等量的硅藻土，室温下搅拌反应，TLC监控反应进程。反应完毕后过滤，滤液用3×50mL水洗涤，分取二氯甲烷层，用无水硫酸钠充分干燥，过滤，减压蒸尽二氯甲烷，柱分离[流动相：v(石油醚):v(乙酸乙酯)=4:1]，即得白色固体产物2.77g（HPLC：99.3%），收率60.8%。

参考实施例2：中间体Ⅲ-1的合成

在装有搅拌、冷凝器、温度计的反应瓶中加入4.55g（0.01mol）中间体Ⅱ，用30mL无水甲醇将其溶解，搅拌下加入吡啶10mL。将2.78g（0.04mol）盐酸羟氨分批加入反应体系。加完，于50℃下继续反应3.5h（板层显示反应完全）。将无水甲醇蒸干，用3×30mL水洗涤反应液，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠充分干燥，过滤，减压蒸尽二氯甲烷，即得白色固体2.0g（HPLC：94.5%），收率43.5%。

参考实施例3：中间体Ⅲ-2的合成

在装有搅拌、冷凝器、温度计的反应瓶中加入4.55g（0.01mol）中间体Ⅱ，用25mL丙酮将其溶解，搅拌下加入氢氧化钾2.24g。将3.34g（0.04mol）甲氧基胺盐酸盐分批加入反应体系。加完，于40℃下继续反应2h（板层显示反应完全）。将丙酮蒸干，用3×30mL水洗涤反应液，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠充分干燥，过滤，减压蒸尽二氯甲烷，即得白色固体3.0g（HPLC：96.7%），收率62.5%。

参考实施例4：中间体Ⅲ-3的合成

在装有搅拌、冷凝器、温度计的反应瓶中加入4.55g（0.01mol）中间体Ⅱ，用40mL无水乙醇将其溶解，搅拌下加入三乙胺4.05g。将3.90g（0.04mol）乙氧基胺盐酸盐分批加入反应体系。加完，于70℃下继续反应1.5h（板层显示反应完全）。将无水乙醇蒸干，用3×30mL水洗涤反应液，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠充分干燥，过滤，减压蒸尽二氯甲烷，即得浅黄色固体3.50g（HPLC：90.2%），收率70.3%。

参考实施例5：中间体Ⅳ-1的合成

在装有搅拌、冷凝器、温度计的反应瓶中加入4.70g（0.01mol）中间体Ⅲ-1，再加入20mL二氯亚砜将其溶解，升温至回流反应，待不放出酸性气体后停止反应。减压蒸尽二氯亚砜，得中间体Ⅳ-1。

实施例1：化合物Ⅰ-1

在装有搅拌、冷凝器、温度计的反应瓶中加入中间体Ⅳ-1 4.88g（0.01mol），用30mL二氯甲烷将其溶解，搅拌下冷却至-5℃，加入无水碳酸钾4.2g。将二(2-氯乙基)胺盐酸盐1.78g（0.01mol）分批加入反应体系中，加毕升温至回流继续反应2h（板层显示反应完全）。过滤，用3×30mL水洗涤反应液，分取二氯甲烷层，用无水硫酸钠充分干燥，过滤，减压蒸尽二氯甲烷，即得白色固体产物4.9g（HPLC：97.0%），收率82.4%。Rf＝0.41[单点，展开剂：v(石油醚):v(乙酸乙酯)=4:1]。MS，m/Z：593.4（M+1）。

实施例2：化合物Ⅰ-2

在装有搅拌、冷凝器、温度计的反应瓶中加入中间体Ⅲ-2 4.84g（0.01mol），用30mL二氯甲烷将其溶解，加入DCC 4.1g，搅拌一段时间后加入DMAP。再搅拌一段时间，将二(2-羟基乙基)胺盐酸盐1.1g（0.01mol）分批加入反应体系中，加毕升温至回流继续反应2h（板层显示反应完全）。过滤，滤液用3×40mL水洗涤反应液，分取二氯甲烷层，用无水硫酸钠充分干燥，过滤，减压蒸尽二氯甲烷，柱分离[洗脱剂：v(石油醚):v(乙酸乙酯)=90:10]，即得白色固体产物3.81g（HPLC：99.4%），收率66.8%。MS，m/Z：571.3（M+1）。

实施例3：化合物Ⅰ-3

参照实施例2的制备方法，用中间体Ⅲ-3和二(2-甲氧基乙基)胺盐酸盐反应，可制得化合物Ⅰ-3浅黄色固体产物，HPLC：98.2%，收率58.4%。Rf＝0.51[单点，展开剂：v(石油醚):v(乙酸乙酯)=4:1]。MS，m/Z：612.5（M）。

实施例4：化合物Ⅰ-4

参照实施例1的制备方法，用中间体Ⅳ-1和二丙基胺盐酸盐反应，可制得化合物Ⅰ-4白色固体产物，HPLC：99.7%，收率78.2%。Rf＝0.39[单点，展开剂：v(石油醚):v(乙酸乙酯)=4:1]。MS，m/Z：552.5（M）。

为了更充分地说明本发明的具有抗恶性肿瘤作用的齐墩果酸衍生物的药物组合物，下面提供下列制剂实施例，所述实施例仅用于说明，而不是用于限制本发明的范围。所述制剂可以使用本发明化合物中的任何活性化合物及其盐，优选使用实施例1~4中所描述的化合物。

实施例5：

用下述成分制备硬明胶胶囊：

制备工艺：将原辅料预先干燥，过100目筛备用。按处方量将上述成分混匀，过60目筛三次，加适量10%聚维酮乙醇（95%）溶液制软材，过18目筛制粒，40℃干燥，过16目筛整粒，填充入硬明胶胶囊中。

实施例6：

用下述成分制备片剂：

制备工艺：将原辅料预先干燥，过100目筛备用。先将处方量的辅料充分混匀。将原料药以递增稀释法加到辅料中，每次加时充分混匀2－3次，保证药与辅料充分混匀，过20目筛，在55℃通风烘箱中干燥2h，干颗粒过16目筛整粒，测定中间体含量，混合均匀，在压片机上压片。

实施例7：

注射液的制备：

制备方法：取活性成分加入到已溶解山梨醇和丙二醇的注射用水中，加入药用碱调节pH值至4~8使其溶解。加入活性炭，搅拌吸附30min，除炭、精滤、灌封、灭菌。

实施例8：

注射用冻干粉的制备：

化合物Ⅰ-4    50mg

药用碱        0.1-7.0%

甘露醇        55－80%

制备方法：取活性成分加入注射用水，用药用碱调节pH值至4~8使其溶解。再加入甘露醇，按注射剂的要求进行高压灭菌，加入活性炭，采用微孔滤膜过滤，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得疏松块状物，封口，即得。

Claims (9)

1.具有式Ⅰ结构的化合物：

其中：

R¹为氢，C₁-C₄直链或支链烷基；

R²为被卤素，羟基，C₁-C₄直链或支链烷基，C₁-C₄直链或支链烷氧基取代的乙基。

2.如权利要求1中所述的具有式Ⅰ结构的化合物：

其中：

R¹为氢，甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，仲丁基，叔丁基；

R²为被氟，氯，溴，羟基，甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，仲丁基，叔丁基，甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基取代的乙基。

3.如权利要求2中所述的具有式Ⅰ结构的化合物，选自：

4.如权利要求1-3任一项所述的具有式Ⅰ结构的化合物的制备方法，其特征在于：将中间体Ⅲ溶解在二氯甲烷或三氯甲烷中，加入DCC，反应一段时间后加入DMAP，然后再加入相应的胺，反应得到目标化合物Ⅰ,

其中R¹、R²的定义如权利要求1所述。

5.如权利要求1-3任一项所述的具有式Ⅰ结构的化合物的制备方法，其特征在于：将中间体Ⅲ溶于二氯亚砜，回流反应，即可得到中间体Ⅳ，将中间体Ⅳ溶于二氯甲烷或三氯甲烷中，在缚酸剂的催化下，和相应的胺反应得到目标化合物Ⅰ，

其中R¹、R²的定义如权利要求1所述。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述缚酸剂包括三乙胺、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾。

7.一种抗恶性肿瘤的药物组合物，它包含治疗有效量的如权利要求1所述的具有式Ⅰ结构的化合物及一种或多种药用赋形剂。

8.如权利要求1中所述的具有式Ⅰ结构的化合物在用于制备抗恶性肿瘤药物方面的应用。

9.如权利要求8所述的应用，在用于制备治疗肝癌、白血病、结肠癌、口腔癌药物方面的用途。