CN101590072B - 毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐在制备抗艾滋病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，公开了毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐的新的医药用途。经药理试验证明，毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐具有抗艾滋病毒作用，可治疗艾滋病，可在制备抗艾滋病药物中应用。

Description

毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐在制备抗艾滋病药物中的应用 

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐的新的医药用途，其可用于治疗艾滋病。

背景技术

艾滋病的全称是“获得性免疫缺陷综合征”(Acquired immunodeficiencysyndrome，AIDS)，它是由艾滋病病毒，即“人类免疫缺陷病毒”(Humanimmunodeficiency virus，HIV)感染而导致的一种传染性疾病。

自从1981年艾滋病首次被发现以来，该病迅速在全球传播，已成为严重危害人民健康的恶性传染病。联合国艾滋病规划署2008年7月29日发布的“2008全球艾滋病流行状况报告”显示，目前全世界共有约3300万艾滋病毒感染者，2007年仍有约270万新增感染者，另有约200万人死于艾滋病。

号称“超级癌症”的艾滋病，传播快，死亡率高，世界各国的医药学家均致力于研究与探索抗艾滋病新药，不断有新的药品试用或问世。抗艾滋病药物主要有以下几类：核苷类逆转录抑制剂，如叠氮胸苷(AZT，齐多夫定)、拉米夫定等；非核苷类逆转录酶抑制剂，如地拉韦定、奈韦拉等；蛋白酶抑制剂，如沙喹那韦、利托那韦、吲哚那韦等；整合酶抑制剂，如齐多夫定单核苷酸等；侵入抑制药，如T20等。叠氮胸苷(AZT)是1987年在临床上最先使用的抗HIV药物，单一或二联治疗HIV感染，由于这种治疗通常在6个月内即出现明显的耐药性，而且对机体的免疫重建不佳，并且还有骨髓抑制、白细胞下降、总淋巴细胞数减少及巨幼红细胞贫血等反应，因而很少取得疗效。齐多夫定、拉米夫定为双脱氧核苷类，主要治疗AIDS及其相关综合征，减少机会性感染，但仍无法根治AIDS，且大多数有严重 不良反应，需长期或终身用药。沙喹那韦、利托那韦和吲哚那韦与核苷类联用可有效地抑制HIV复制，并减少不良反应。

此外，免疫调节药物，如干扰素、白细胞介素2和丙种球蛋白等，都具有抗病毒、抗细菌感染和增强免疫调节的作用。其中白细胞介素2还可使患者淋巴细胞数增加，改善人体免疫功能。

目前，艾滋病治疗有美国先进的进入细胞抑制剂T20治疗，T20是一种肽类，不能口服，只能注射，价格昂贵。每位患者每年的治疗费用都在20,000美元以上，药价的昂贵使得绝大多数艾滋病患者都无法得到有效治疗。

中国医药是一个伟大的宝库，继承和发扬祖国几千年来的传统医学，挖掘医学宝库，利用现代的分离分析手段，筛选出有效治疗艾滋病的中药有效部位和有效成分，开发出治疗艾滋病的有效药物。目前已报道的从中药中提取的有效部位和成分有松塔多糖、香菇多糖、人参皂苷、天花粉蛋白、喜树碱、罂粟碱等。

毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，中文化学名称为3′-羟基-4′-甲氧基异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(3′-hydroxy-4′-methoxyisoflavone-7-O-β-D-glucopyranoside)，分子式为C₂₂H₂₂O₁₀，分子量为446，结构式如下：

毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷可以从黄芪等植物中提取分离得到，文献报道其有治疗病毒性心肌炎和抗心肌缺血等医药用途。本发明人研究发现毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐对HIV-1病毒有显著的抑制作用，有望开发成一个抗艾滋病新药。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其 盐的新的医药用途，即在制备治疗艾滋病的药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种治疗艾滋病的方法，即向艾滋病患者给予治疗有效量的毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐。

本发明的又一目的在于提供一种抗艾滋病的药物组合物，其包含治疗有效量的毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐和一种或多种药学上可接受的载体。

毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐对C8166细胞的毒性小，CC₅₀为200μg/ml；对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体抑制的EC₅₀为7.02μg/ml，治疗指数(TI值)28.49，毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐具有显著的抗HIV-1活性。

附图说明

图1说明毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷对C8166细胞的毒性作用；

图2说明AZT对C8166细胞的毒性作用；

图3说明毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷对HIV-1_IIIB诱导C8166细胞病变的抵制作用；

图4说明AZT对HIV-1_IIIB诱导C8166细胞病变的抵制作用。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的实质，下面详细地描述毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐抗艾滋病的应用。

毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷可以从黄芪等植物中提取分离得到，例如宋纯清等[《植物学报》，1997年39卷第8期第764页至768]报道，采用乙醇提取、正丁醇萃取、硅胶柱层析、甲醇重结晶的方法从膜荚黄芪中提取鉴别的异黄酮化合物中就有毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷。毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷在水中的溶解性不好，难以制成注射等剂 型给药。制成氢氧化物盐可大大增加在水中的溶解度，但不改变毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷的母核结构，即在体内产生抑制HIV-1作用的仍为毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷。这是本领域技术人员根据公知的理论和经验可以预测和实施的。其盐可以按如下方法得到：用稀的氢氧化物溶液溶解毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，低温减压浓缩，即可得到固体盐，例如可以是钠盐、钾盐等。

根据本发明的第一方面，本发明提供毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐在制备治疗爱滋病药物中的应用。

毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐对C8166细胞的毒性小，CC₅₀为200μg/ml；对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体抑制的EC₅₀为7.02μg/ml，治疗指数(TI值)28.49，具有显著的抗HIV-1活性，可用于制备治疗爱滋病的药物。

根据本发明的另一方面，本发明提供一种治疗艾滋病的方法，即向艾滋病患者给予治疗有效量的毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐。

根据本发明的还一方面，毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐可以和一种或多种药学上可接受的载体形成组合物，而用于治疗艾滋病。此外，该组合物可以进一步包含其他的抗艾滋病活性成分，而用于治疗艾滋病。

根据本发明，毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐可与一种或多种固体或液体药物赋型剂和/或辅料结合，制成可作为药物使用的适当的施用形式或剂量形式。

毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐，或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、皮下、肌肉、直肠、口腔粘膜、皮肤、鼻腔、腹膜或鼻腔等，优选口服。

给药途径可为注射给药，注射包括肌肉注射、静脉注射、皮内注射、皮下注射和穴位注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型和半固体剂型。如液体剂型可以是口服液、糖浆剂、注射液；固体剂型可以是粉剂、丸剂、栓剂、冻干粉针剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂和软胶囊剂。半固体剂型可以是乳剂等。

毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐可以制成普通制剂，也可制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂、前体药物制剂、固体分散制剂及各种微粒给药系统。

为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子：例如稀释剂与吸收剂，如甘露醇、蔗糖、淀粉、硫酸钙、乳糖、氯化钠、白陶土、微晶纤维素、葡萄糖、尿素、碳酸钙或硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、丙醇、淀粉浆、葡萄糖溶液、甘油、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇、糊精、糖浆、蜂蜜、乙醇、紫胶、甲基纤维素、乙基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如交联聚维酮、羧甲基淀粉钠、改性淀粉starch 1500、干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素或乙基纤维素等；崩解抑制剂，如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂或氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、氮酮或十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、微粉硅胶、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡或聚乙二醇等。此外，还可以将片剂进一步制成包衣片，如糖衣片、薄膜包衣片、肠溶衣片，可以为双层片或多层片。

为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子：例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土或滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、西黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、米糊或面糊等；崩解剂如交联聚维酮、羧甲基淀粉钠、改性淀粉starch 1500或干燥淀粉等。

为了将给药单元制成胶囊，可将毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或 其盐与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物填充于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或压成片剂或制成注射剂应用。

为了制成注射用制剂，如溶液型、混悬液型、乳状液型、冻干粉型，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。例如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等中。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，还可以添加常规的增加主药溶解性的附加剂(如吐温)、帮助主药混悬或乳化的附加剂(如F-68、卵磷脂、豆磷脂)、防止主药氧化的附加剂(如亚硫酸钠、硫脲)、抑制微生物增殖的附加剂(如苯酚、三氯叔丁醇)、调整pH值的附加剂(如盐酸、枸橼酸、氢氧化钠)以及减轻疼痛的附加剂(如苯甲醇、盐酸利多卡因等)。

此外，如果需要也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它辅料。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，可以根据最后制剂中所含有的实际药物活性成分数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成预防或治疗的目的。

毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐的每天的合适剂量范围为 0.01-250mg/kg体重，优选为0.1-150mg/kg体重，更优选为0.2-50mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药，这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

每一种治疗所需总剂量可分成多次或按一次剂量给药。毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐或其组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。

下面的制备实施例和生物活性试验实施例可更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

制备实施例1毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷的提取和结构鉴定

取黄芪药材饮片1.84kg，以70％乙醇(v/v)15L回流提取三次，每次3小时，然后过滤，合并滤液，减压回收溶剂，浓缩至无醇味，得黄芪醇提浸膏I；

向浸膏I中加水9L，混溶过滤，滤液上大孔树脂(AB-8型)，先用水2L洗脱，再用70％乙醇(v/v)2L洗脱，所得的70％乙醇洗脱液减压浓缩得浸膏II；

浸膏II以适量甲醇溶解，拌样，上200-300目硅胶柱，以氯仿-甲醇梯度洗脱(氯仿-甲醇5∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，各500ml)，TLC检测(TLC检测所用对照品为毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，其结构式经UV、IR、¹H-NMR、¹³C-NMR确证，纯度大于98％)，10％硫酸-乙醇显色，合并含对照品的流分，蒸干，再用甲醇热溶，静置，有白色絮状物析出，抽滤，得白色粉末状结晶，再用C₁₈反相柱纯化，而后甲醇重结晶，得无色针状结晶，(552mg，得率0.0292％)。

【薄层色谱(TLC)鉴别】

分别吸取浓度为1mg/ml的本品供试品溶液1μl、10μl，以及浓度为 0.5mg/ml的毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品溶液5μl，点于同一硅胶G薄层板上，用三个展开系统(A：氯仿-甲醇(9∶1，v/v)；B：氯仿-丙酮(4∶1，v/v)；C：乙酸乙酯-甲醇(12∶1，v/v)展开，吹干，用10％硫酸-乙醇显色，115℃加热15分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，均显示相同颜色的斑点。供试品色谱中除主斑点外，均未显其它斑点，表明本品为单一成分。

【纯度检验】

色谱柱：C₁₈键合硅胶色谱柱

柱温：25℃

流动相：甲醇-水(47∶53，v/v)

流速：1.0ml/min

检测器：紫外210nm

结果：样品纯度为99.3％。

【质谱】

仪器：Q-TOF micro质谱仪

离子源：电喷雾源

分辨率：6000

结果：469.07是[M+Na]⁺峰，446.98是[M+H]⁺峰，表明本品的分子量是446。

【紫外吸收光谱】

仪器：Shimadzu UV-2401

溶剂：分析纯甲醇

扫描范围：200～400nm

结果：在218.80nm，249.20nm，259.60nm，285.20nm有最大吸收。

【红外吸收光谱】

仪器：Perkin-Elmer 983型红外分光光度仪

测定条件：KBr压片

数据：参见表1红外光谱数据

表1：红外光谱数据

频率(cm-1)	强度	基团振动方式
			3386.4	强	O-H不对称伸缩振动
2908.2	中	甲基，次甲基(CH3，CH)对称伸缩振动
			1625.7	强	羰基伸缩振动
1600.0	中强	苯环骨架振动
			1510.0	中强	苯环骨架振动
1444.4	中	甲基CH3不对称弯曲振动
			1080.0	强	C-O伸缩振动
852.4	中	C-H面外弯曲振动

解析：

(1)、红外图谱在3386.4cm^-1处有一非常强的宽峰；在1080.0cm^-1处出现强且宽的峰，并且分裂成多个峰，这是典型的糖信号。说明该物质为一苷类化合物。前者为O-H不对称伸缩振动吸收峰，后者为C-O的伸缩振动吸收峰。

(2)、红外图谱在2908.2cm^-1和1444.4cm^-1出现的吸收峰表明该化合物里有甲基、次甲基(CH₃，CH)，前者为甲基、次甲基的对称伸缩振动吸收峰，后者为甲基CH₃不对称弯曲振动吸收峰。

(3)、1625.7cm^-1为羰基伸缩振动吸收峰。

(4)、1600cm^-1附近的吸收峰以及1510.0cm^-1的吸收峰表明该化合物里有苯环骨架，这些信号都是苯环骨架振动吸收峰。852.4cm^-1为苯环上氢的面外弯曲振动吸收峰，表明苯环上的取代形式可能为1、2、4-3取代。

【核磁共振氢谱】

仪器：Bruker DRX-400型核磁共振仪

溶剂：DMSO-d₆，TMS内标

数据：参见表2¹H-NMR数据

表2¹H-NMR数据归属

化学位移(ppm)	多重性	质子数	归属
				3.16	t(J＝8.4)	1	7位Glc-4CH
3.28	m	1	7位Glc-2CH
				3.29	m	1	7位Glc-3CH
3.44	m	1	7位Glc-5CH
				3.45	m	1	7位Glc-6CH
3.68	dd(J＝9.5，14.7)	1	7位Glc-6CH
				3.77	s	3	4′位OCH3
5.09	d(J＝7.7)	1	7位Glc-1CH
				6.94	b，s	2	5′，6′位CH
7.04	s	1	2′位CH
				7.13	dd(J＝2.2，8.8)	1	6位CH
7.21	d(J＝2.5)	1	8位CH
				8.03	d(J＝8.8)	1	5位CH
8.36	s	1	2位CH

注：s＝单峰  d＝双峰  t＝三重峰  b＝宽峰

【核磁共振碳谱】

仪器：Bruker DRX-400型核磁共振仪

溶剂：DMSO-d₆，TMS内标

数据：参见表3¹³C-NMR数据

表3¹³C-NMR数据归属

化学位移(ppm)	碳的类型	归属
			55.69	伯碳	4′位OCH3
60.60	仲碳	7位Glc-6CH2
			69.59	叔碳	7位Glc-4CH
73.08	叔碳	7位Glc-2CH

76.38	叔碳	7位Glc-3CH
			77.21	叔碳	7位Glc-5CH
100.01	叔碳	7位Glc-1CH
			103.42	叔碳	8位CH
111.98	叔碳	5′位CH
			115.65	叔碳	6位CH
116.41	叔碳	2′位CH
			118.52	季碳	10位C
119.61	叔碳	6′位CH
			123.65	季碳	3位C
124.47	季碳	1′位C
			127.02	叔碳	5位CH
146.25	季碳	3′位C
			147.65	季碳	4′位C
153.60	叔碳	2位CH
			157.02	季碳	9位C
161.45	季碳	7位C
			174.69	季碳	4位C

【碳氢相关HSQC谱】

仪器：Bruker DRX-400型核磁共振仪

溶剂：DMSO-d₆，TMS内标

数据及解析：依据HSQC，分别归属了各位氢，参见表4

表4由HSQC得出的碳氢对应关系

碳号	碳原子化学位移(ppm)	对应质子位移(ppm)
			2	153.60	8.36
3	123.65
			4	174.69
5	127.02	8.03
			6	115.65	7.13
7	161.45
			8	103.42	7.21
9	157.02
			10	118.52
1′	124.47
			2′	116.41	7.04
3′	146.25
			4′	147.65
5′	111.98	6.94
			6′	119.61	6.94
Glc-1	100.01	5.09
			Glc-2	73.08	3.28
Glc-3	76.38	3.29
			Glc-4	69.59	3.16

Glc-5	77.21	3.44
			Glc-6	60.60	3.45，3.68
OMe	55.69	3.77

【碳氢远程相关HMBC谱】

仪器：Bruker DRX-400型核磁共振仪

溶剂：DMSO-d₆，TMS内标

数据及解析：依据HMBC，分别找到了糖与苷元、苷元内部之间的连接顺序与位置，参见表5。

表5由HMBC得出的对应关系

碳号	碳原子化学位移(ppm)	对应质子位移(ppm)
			2	153.60
3	123.65	7.04，8.36
			4	174.69	8.03，8.36
5	127.02
			6	115.65	7.21
7	161.45	5.09，7.13，7.21，8.03
			8	103.42	7.13
9	157.02	7.21，8.03，8.36
			10	118.52	7.13，7.21
1′	124.47	6.94，8.36
			2′	116.41	6.94
3′	146.25	6.94
			4′	147.65	3.77，6.94
5′	111.98

6′	119.61	7.04
			Glc-1	100.01
Glc-2	73.08	3.29
			Glc-3	76.38	3.16，3.28
Glc-4	69.59	3.44
			Glc-5	77.21	3.45
Glc-6	60.60

通过HMBC，可以确定葡萄糖是连接在苷元的7位上。

【比旋光及熔点】

仪器：Perkin Elmer 241型旋光仪，XT4-100X熔点测定仪，未校正。结果： 

(DMSO；c 0.483)，mp：221～222℃，与文献[宋纯清，郑志仁，刘涤等，膜荚黄芪中的异黄酮化合物，《植物学报》，1997，39(8)：764-768]相符。

【综合解析】

该化合物Molish反应阳性，盐酸镁粉反应阴性，另外该化合物酸水解，检出葡萄糖，紫外吸收在259.60nm、285.20nm有最大吸收，以上结果说明该化合物为一异黄酮苷类化合物。

红外数据表明该化合物分子结构中存在甲基、亚甲基、羟基、芳香环结构以及羰基。

¹H-NMR中，δ：5.09ppm处有一个单质子双峰，应为葡萄糖的端基质子，它的偶合常数是7.7Hz，说明它的构型为β型；δ：3.0～4.0ppm范围内有多组多重峰，为糖环质子信号；δ：7.13ppm，7.21ppm，8.03ppm，由偶合常数可以看出构成一个ABX系统；δ：8.36ppm(s)可知应为异黄酮的2位质子信号。

¹³C-NMR图中共有22个碳峰，为典型的甲氧基取代黄酮苷型信号。其 中100.01ppm、73.08ppm、76.38ppm、69.59ppm、77.21ppm和60.60ppm为β-D-葡萄糖成苷的一组信号。100.01ppm碳上相连的氢(δ：5.09ppm)在碳氢远程相关谱上与7号碳161.45ppm(季碳)相偶合，故7号碳上连接的是一个葡萄糖。并通过与文献[1.宋纯清，郑志仁，刘涤等，膜荚黄芪中的异黄酮化合物，《植物学报》，1997，39(8)：764-768；2.吴军，屠鹏飞，赵玉英，补阳还五汤中异黄酮和紫檀烷类化合物的分离与结构鉴定，《中草药》，2001，32(7)：583-585；3.窦辉，付铁军，张帆等黄芪注射液的化学成分，《天然产物研究与开发》，2002，14(6)：14-17；4.Markham R K，MarbryT J，Swift T W，New isoflavones from the genus Baptisia(Leguminosae)，phytochemistry，1968，7：803-808]对照，各个谱学数据一致。

ESI-MS谱中，正离子源主要有4个峰，分别归属为：469.07是[M+Na]⁺峰，446.98是[M+H]⁺峰，285.18是[M+H-Glc]⁺峰，914.93是[2M+Na]⁺峰；负离子源主要有2个峰，分别归属为：481.0是[M+Cl]^-峰，283.2是[M-H-Glc]^-峰，证实该化合物的分子量是446，与毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷相符。

通过以上综合分析，确定该化合物为毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，即3′-羟基-4′-甲氧基异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷。

制备实施例2毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷的提取

取黄芪药材饮片3000g，以70％乙醇(v/v)25L回流提取三次，每次3小时，过滤，合并滤液，减压回收溶剂，浓缩至无醇味，得黄芪醇提浸膏I；

向浸膏I中加水15L，混溶过滤，滤液上大孔树脂(AB-8型)，先用水4L洗脱，再用70％乙醇(v/v)8L洗脱，所得的70％乙醇洗脱液减压浓缩得浸膏II；

浸膏II以适量甲醇溶解，拌样，上200-300目硅胶柱，以氯仿-甲醇梯 度洗脱(氯仿-甲醇5∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，各1000ml)，TLC检测(TLC检测所用对照品为毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷)，10％硫酸-乙醇显色，合并含对照品的流分，蒸干，用甲醇热溶，静置，有白色絮状物析出，抽滤，得白色粉末状结晶，再用C₁₈反相柱纯化，而后甲醇重结晶，得无色针状结晶0.99g，熔点为221-222℃。

纯度测定：色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；水-甲醇(62∶38，v/v)为流动相，检测波长为261nm。理论板数按毛蕊异黄酮-7-O-β-D葡萄吡喃糖苷峰计不低于2000。精密称取本品约1mg于1ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。精密吸取供试品溶液10μl，用归一化法计算毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量。结果毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷含量为98.9％。

制备实施例3毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷钠盐的制备

把装有搅拌器和滴液漏斗的250ml三颈瓶安放在已升温至60℃的恒温水浴锅中，加入0.45g毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(纯度为98.9％)(约0.001mol)和50ml 95％乙醇(v/v)和50ml水，搅拌，待与溶媒充分混匀后，边搅拌边滴加0.5wt％氢氧化钠(分析纯)溶液(8ml，0.001mol)，30分钟内滴完，继续搅拌，恒温再反应20分钟，50℃减压回收，浓缩，干燥，得毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷钠盐0.46g。

制备实施例4毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷钾盐的制备

把装有搅拌器和滴液漏斗的250ml三颈瓶安放在已升温至60℃的恒温水浴锅中，加入0.45g毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(纯度为98.9％)(约0.001mol)和50ml 95％乙醇(v/v)和50ml水，搅拌，待与溶媒充分混匀后，边搅拌边滴加0.56wt％氢氧化钾(分析纯)溶液(10ml，0.001mol)， 30分钟内滴完，继续搅拌，恒温再反应20分钟，50℃减压回收，浓缩，干燥，得毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷钾盐0.47g。

试验性实施例

本发明中，毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐体外抗HIV-1活性的检测采用如下材料和方法：

(1)、测定药物和化合物

待测样品为毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷。阳性对照化合物叠氮胸苷(AZT，3’-Azido-3’-deoxythymidine)购自Sigma公司。待测样品溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，分装后4℃保存；AZT溶解于RPMI-1640完全培养基中，0.22μm滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存。

(2)、试剂和溶液培养基

①试剂

HEPES  (4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)、DMF(N，N-二甲基甲酰胺)、青霉素(Penicillin)、硫酸链霉素(Streptomycin sulfate)、谷氨酰胺(Glutamine)均购自Sigma公司；2-巯基乙醇(2-ME，2-Mercaptoethanol)为Bio-Rad公司产品。RPMI-1640和新生小牛血清为Gibco公司产品。

②培养基：RPMI-1640完全培养基，含有10％新生小牛血清，2mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES，50μM 2-巯基乙醇，100,000IU青霉素，100μg/ml链霉素。

(3)、细胞和病毒

人T淋巴细胞系C8166、HIV-1实验株HIV-1_IIIB均由英国MedicalResearch Council，AIDS Reagent Project惠赠。所有细胞和病毒均含10％小牛血清的RPMI-1640完全培养基进行培养。按常规方法制备HIV-1_IIIB，滴定并计算出病毒的TCID₅₀。病毒贮存液分装后，置-70℃保存。细胞和病毒按 常规方法冻存和复苏。

(4)、HIV-1感染性滴定

HIV-1_IIIB按Johnson & Byington(1990)所述方法改良进行滴定，简述如下：将HIV-1贮存液在96孔板上作4倍稀释，10个梯度，每梯度6个重复孔，同时设置对照孔6孔。每孔加入C8166细胞50μl(4×10⁵/ml)，每孔终体积为200μl。37℃，CO₂培养。第三天补加新鲜RPMI-1640完全培养基100μl，第七天在倒置显微镜下观察每孔中HIV-1诱导的细胞病变效应(CytopathicEffect，CPE)，以每孔是否有合胞体(Syncytium)的形成确定。按Reed &Muench方法计算病毒的TCID₅₀(50％Tissue Culture Infection Dose，半数组织培养感染剂量)。

(5)、计算公式

根据实验结果绘制剂量反应曲线，按Reed & Muench法计算出药物抑制病毒的50％有效浓度(EC₅₀)、50％抑制细胞生长浓度(CC₅₀)及抗HIV-1活性指数(Therapeutic index，TI)，TI＝CC₅₀/EC₅₀。

①.细胞生长抑制率(％)＝(1-实验孔OD值/对照孔OD值)×100

②.HIV-1致细胞病变的抑制率(％)

＝(1-实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)×100

③.细胞生长存活率(％)＝实验孔OD值/对照孔OD值×100

试验实施例1毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷对C8166细胞的毒性试验

将4×10⁵/ml C8166细胞悬液100μl与不同的待测药物溶液混合，设三个重复孔。同时设置不含药物的对照孔。37℃，5％CO₂培养3天，采用MTT比色法检测细胞毒性。ELx800酶标仪测定OD值，测定波长为595nm，参考波长为630nm。计算得到CC₅₀值(50％Cytotoxic Concentration)，即对50％的正常T淋巴细胞系C8166产生毒性时的药物浓度。实验结果如表6、 图1和图2所示。

表6毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷对C8166细胞的毒性作用的实验数据

毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷对C8166细胞的毒性作用小，当药物浓度为200μg/ml时，细胞存活率为63.34％，CC₅₀大于200μg/ml。

试验实施例2毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷对HIV-1_IIIB致细胞病变(CPE)的抑制试验

将8×10⁵/ml C8166细胞50μl/孔接种到含有100μl/孔梯度倍比稀释药物的96孔细胞培养板上，然后加入50μl的HIV-1_IIIB稀释上清，1300TCID₅₀/孔。设3个重复孔。同时设置不含药物的正常细胞对照孔。AZT为阳性药物对照。37℃，5％CO₂培养3天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体的形 成。EC₅₀(50％Effective Concentration)为抑制合胞体形成50％时的药物浓度。实验结果如表7、图3和图4所示。

表7毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷对HIV-1_IIIB诱导C8166细胞病变(CPE)的抑制作用

毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷对HIV-1_IIIB诱导C8166细胞病变有良好的抑制作用，抑制作用的EC₅₀为7.02μg/ml。

阳性药AZT(叠氮胸苷)是1987年在临床上最先使用的抗HIV药物，单一或二联治疗HIV感染，由于这种治疗通常在6个月内即出现明显的耐药 性，而且对机体的免疫重建不佳，并且还有骨髓抑制、白细胞下降、总淋巴细胞数减少及巨幼红细胞贫血等毒副反应，因此临床上综合疗效并不理想。毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷对C8166细胞的毒性小，CC₅₀200μg/ml，对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体抑制的EC₅₀为7.02μg/ml，治疗指数(TI值)28.49，表明具有显著的抗HIV-1活性，可在制备治疗艾滋病药物中应用。

Claims (3)

1.毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐在制备治疗艾滋病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷盐为毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷钠盐或钾盐。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述抗艾滋病的药物为一种药物组合物，其包含治疗有效量的毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷或其盐和一种或多种药学上可接受的载体。

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