CN105012289A - 甘草利酮或其衍生物在抗艾滋病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种中药活性成分在抗HIV潜伏治疗上的应用。具体地，本发明采用独创的活性筛选方法发现具有抗艾滋病中药甘草，并用溶剂提取法、梯度萃取、硅胶柱色谱等工艺，结合活性筛选确定和制备甘草利酮或其衍生物，制成抗艾滋病的活性成分。本发明的活性成分具有干预HIV潜伏的作用，可与抗逆传录病毒药物联合使用，加速潜伏病毒储藏库的清除，将为艾滋病的彻底治愈提供新的途径。

Description

甘草利酮或其衍生物在抗艾滋病中的应用
技术领域
本发明属医药领域，涉及治疗艾滋病的药物，具体涉及一种具有抗HIV潜伏作用的药物及其用途，尤其涉及甘草利酮或其衍生物的抗HIV潜伏作用及其在制备治疗艾滋病药物中的应用。
背景技术
获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是由HIV感染引起的一种严重危害人们生命健康的传染性疾病。据WHO统计全球艾滋病患者已超过4000万，每年新增患者500万，而每年死亡约为300万。目前，艾滋病临床治疗方法主要采用高效抗逆传录病毒疗法(Highly active antiretroviral therapy,HAART)，该疗法不仅有效控制HIV复制，并且能重建AIDS患者的免疫功能，为AIDS的治疗打开了希望之门。
人们曾寄希望于凭借HAART完全清除体内的HIV，从而达到彻底治愈AIDS的目的。但随后的实践证明，虽然HAART可以最大限度地抑制患者体内病毒复制，使血浆病毒载量(virus load)降低至现有常规检测方法测不出的水平，但感染者体内仍有病毒持续存在，一旦停止药物治疗，病毒载量又会反弹到治疗前水平(Ho,D.D.Toward HIV eradication or remission:the tasks ahead.Science，1998.280:1866–1867.)。研究显示，HIV难以在体内被完全清除的一个重要原因是HIV-1能够潜伏在静息的记忆CD4+T细胞中，该潜伏感染细胞是由一小部分HIV感染的活化CD4+T细胞转化而产生的，其整合的前病毒缺乏转录活性，因而,不会被免疫系统和抗逆转录酶病毒的药物攻击。尽管感染个体携带潜伏感染细胞数量较少,但衰减率是如此之慢，以至于欲在个体生存期内仅靠HAART治疗将其彻底清除是不可能的。因此,HIV潜伏感染的静息CD4+T细胞是构成机体内病毒储藏库(reservoir)的主要部分，同时也是目前临床治疗不能彻底清除HIV的巨大障碍[Finzi,D.et al.Latent infectionof CD4+T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1,even in patients on effective combination therapy.Nature Med.1999,5,512–517]。一般认为HIV-1潜伏感染细胞形成的分子机制与整合位点处的染色质状态,抑制性核小体nuc-1的存在,以乙酰化为代表的表观遗传修饰,宿主转录因子如NF-κB以及病毒转录活化因子Tat等因素有关[Coiras,M.,M.R.et al.Understanding HIV-1latency provides clues for the eradicationof long-term reservoirs.Nat.Rev.Microbiol..2009.,7:798-812.]。据此机制，有研究提出了清除潜伏病毒储存库的治疗策略，即试图通过药物诱导HIV潜伏感染细胞的前病毒表达，使其潜伏病毒再次激活，同时结合高效抗逆传录病毒疗法及在人免疫系统作用下，来杀死激活的潜伏感染的细胞，以此加速病毒库的清除(Richman et al.The Challenge of Finding a Cure for HIVInfection,Science，2009，1304，323)。尽管，该策略已在临床上已有几个治疗方案，但其结果仍未尽人意，不是激活剂无效，就是虽有效但其毒副作用大，因而，研发安全有效于一体的能消除病毒储藏库的免疫激活剂及相应的治疗方案已是当务之急。中药作为我国所特有的医药资源，中药来源的化合物以其种类繁多、临床应用广泛、疗效确切、作用温和、副作用少等优点而越来越受到现代医药学的关注。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗HIV潜伏作用的药物，尤其涉及甘草利酮或其衍生物抗HIV潜伏作用及其在制备治疗艾滋病药物中的应用。
本发明第一方面，提供了一种甘草利酮或其衍生物的用途，(a)用于制备干预HIV病毒潜伏的组合物；(b)用于制备治疗艾滋病的药物；或(c)用于制备与抗逆传录病毒药物联合使用从而治疗艾滋病的药物，
其中，所述的甘草利酮或其衍生物具有式I所示的通式：
R1选自H、OH、OCH3，R2选自H、CH2CH＝C(CH3)2，R3选自OCH3或OH，R4选自H、OH、CH2CH＝C(CH3)2或其与R3的OH成环，R5选自H、OH或OCH3，R6选自H或OH。
在另一优选例中，所述甘草利酮或其衍生物包括甘草利酮、甘草异黄酮乙、甘草瑞酮、甘草异黄酮甲、或毛蕊异黄酮。
在另一优选例中，所述的甘草利酮的化学式如式Ia所示：
在另一优选例中，所述的甘草异黄酮乙的化学式如式Ib所示：
在另一优选例中，所述的甘草瑞酮的化学式如式Ic所示：
在另一优选例中，所述的甘草异黄酮甲的化学式如式Id所示：
在另一优选例中，所述的毛蕊异黄酮的化学式如式Ie所示：
在另一优选例中，所述的干预HIV病毒潜伏包括：诱导HIV病毒潜伏感染细胞中HIV前病毒表达、和/或激活潜伏的HIV病毒；和/或
所述的治疗艾滋病包括抗HIV潜伏治疗。
在另一优选例中，所述的甘草利酮或其衍生物通过溶剂提取法、萃取法、和色谱法制备获得。
在另一优选例中，所述的甘草利酮或其衍生物提取自甘草属植物。
在另一优选例中，所述甘草属植物包括甘草(Glycyrrhiza uralensisFisch)、胀果甘草(G.inflata Batal)或洋甘草(又叫光果甘草，G.glabraLinn)。
在另一优选例中，组合物包括药物组合物、食品组合物或保健品组合物。
在另一优选例中，所述的药物还包括选自下组的额外组分：抗逆传录病毒的药物或增强免疫力的药物。
在另一优选例中，所述的组合物或药物包括：口服制剂和非口服制剂。
在另一优选例中，所述的制剂包括：粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、片剂或含片。
本发明第二方面，提供了一种用于治疗艾滋病的活性成分，所述的活性成分具备以下特征：
(a)该活性成分是提取自甘草属植物的枝、叶、根、和/或茎的水溶性的和/或脂溶性的提取物；或提取自甘草属植物的枝、叶、根、和/或茎的醇提取物；
(b)该活性成分含有一种或多种选自下组的组分：甘草利酮、甘草异黄酮乙、甘草瑞酮；和
(c)该活性成分具有诱导HIV病毒潜伏感染细胞中HIV前病毒表达、和/或激活潜伏的HIV病毒的功能。
在另一优选例中，该活性成分是通过溶剂提取法、萃取法、和色谱法而获得的。
在另一优选例中，所述的活性成分通过以下步骤制备：
(1)提取：使用提取溶剂对药材提取，得到提取液；
(2)萃取：将步骤(2)得到的提取液浓缩，加水溶解，再分别用极性由小到大的萃取溶剂进行萃取，得到萃取液，萃取液经浓缩后上正相柱用洗脱溶剂进行洗脱；收集洗脱液，干燥，得到甘草提取物；
在另一优选例中，所述的提取溶剂选自水、醇中的一种或两种。
在另一优选例中，所述的提取溶剂为含乙醇质量百分数50～95％的乙醇水溶液。
在另一优选例中，步骤(1)中所述的药材包括甘草植物的根茎或其他含该化合物的植物部位或人工合成。
在另一优选例中，步骤(1)所述提取溶剂与所述药材的质量比为6～10。
在另一优选例中，所述的提取为加热提取，温度为90℃～100℃。
在另一优选例中，所述提取为提取2～3次，每次2-3小时。
在另一优选例中，所述的药材为甘草植物的全草、根茎、叶子或花中的至少一种。
在另一优选例中，所述的萃取溶剂包括石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇，萃取时按极性大小依次使用单一溶剂等体积进行萃取。
在另一优选例中，所述的萃取溶剂至少包括二氯甲烷。
在另一优选例中，步骤2)中，将经过二氯甲烷萃取的萃取液经浓缩后得到的浓缩物上正相柱。
在另一优选例中，所述的洗脱溶剂至少包括由体积比为100：0～10：1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂。
在另一优选例中，所述的洗脱溶剂包括由体积比为100：0的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、由体积比为100：1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、由体积比为50：1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、由体积比为30:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、由体积比为25:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、由体积比为10:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、由体积比为5:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、由体积比为2:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂和由体积比为1:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂，并进行梯度洗脱。
本发明第三方面，提供了一种药物组合物，含有安全有效量的本发明第二方面所述的活性成分和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物剂型为口服给药或非口服给药剂型。
在另一优选例中，所述的口服给药剂型是片剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂，或乳剂或糖浆剂。
在另一优选例中，所述的非口服给药剂型是注射剂或针剂。
在另一优选例中，所述的甘草利酮或其衍生物的浓度为0.01-2000微克/ml，较佳地为0.1-100微克/ml。
本发明第四方面，提供了一种体外非治疗性诱导HIV病毒潜伏感染细胞中HIV前病毒表达的方法，包括步骤：在甘草利酮或其衍生物的存在下，培养所述的HIV病毒潜伏感染细胞中，使得潜伏的HIV前病毒表达，从而激活潜伏的HIV病毒。
在另一优选例中，所述的方法还包括：对被激活的HIV病毒进行杀灭或抑制。
本发明第五方面，提供了一种非治疗性的激活潜伏的HIV病毒的方法，包括步骤：将HIV病毒潜伏感染细胞与甘草利酮或其衍生物接触，给需要的对象施用本发明第二方面所述的活性成分或本发明第三方面所述的药物组合物，从而激活潜伏的HIV病毒。
本发明第六方面，提供了一种制备用于治疗艾滋病的药物组合物的方法，包括步骤：将本发明第二反面所述的活性成分与药学上可接受的载体混合，从而形成药物组合物。
在另一优选例中，本发明还提供了一种激活潜伏的HIV病毒的方法；和/或治疗艾滋病的方法，向需要的对象施用安全有效量的本发明第二方面的活性成分或本发明第三方面的药物组合物。
在另一优选例中，所述需要的对象为哺乳动物，例如人。
在另一优选例中，所述施用的剂量为成人每日0.1～2000mg，优选1～300mg/天。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为A10.6潜伏细胞未加甘草利酮或其衍生物(溶剂对照组)的荧光照片暗场及同一视野明场照片，几乎看不到荧光细胞。为了便于在打印文本上识别，荧光照片经去色处理后，其荧光细胞为白色(下同)。
图2为A10.6潜伏细胞用甘草利酮处理后荧光照片暗场及同一视野明场照片，可见较多荧光细胞。
图3为A10.6潜伏细胞用甘草异黄酮乙处理后荧光照片及同一视野白光照片，可见较多荧光细胞。
图4为A10.6潜伏细胞用甘草瑞酮处理后荧光照片及同一视野白光照片，可见较多荧光细胞。
图5为A10.6潜伏细胞未加甘草利酮或其衍生物(溶剂对照组)的流式细胞图，仅背景激活效率1％。
图6为A10.6潜伏细胞用甘草利酮处理后流式细胞图，激活效率91.11％。
图7为甘草提取流程。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外发现甘草利酮或其衍生物物具有抗HIV潜伏的作用。具体地，本发明人采用独创的活性筛选方法发现具有抗艾滋病中药甘草属植物，并用溶剂提取法、溶剂萃取法、色谱法等工艺，结合活性筛选确定和制备含有甘草利酮或其衍生物的活性成分，可作为抗艾滋病的治疗药物。本发明的活性成分具有干预HIV潜伏的作用，与抗逆传录病毒药物联合使用，可清除被激活的潜伏感染的细胞，以此加速潜伏病毒储藏库的清除，将为艾滋病的彻底治愈提供新的途径。在此基础上完成了本发明。
甘草利酮或其衍生物
本文所用，术语“本发明的活性成分”、“本发明的甘草利酮或其衍生物”和“本发明的抗HIV潜伏的活性成分”可互换使用，都指提取自甘草属植物的、具有诱导HIV潜伏感染细胞的前病毒表达从而使潜伏病毒激活的作用的提取自甘草的活性成分。
在本发明中，抗HIV潜伏的活性成分可用甘草属植物为原料进行提取。
此外，虽然抗HIV潜伏的活性成分可来自于甘草属植物的全草，优选非果部分，其中包括根、茎等部位，但是也可从甘草属植物的地上部分如枝、叶等部位提取。
如本文所用，术语“甘草利酮或其衍生物”、“提取物”或“活性成分”包括水溶性的和/或脂溶性的活性成分。该术语还包括醇提物、或水提物。此外，还包括活性成分群，即含有脂溶性活性成分和水溶性活性成分的萃取物或其混合物。
经分析，本发明活性成分所含的化学成分至少包括一种或多种选自下组的物质：甘草利酮、甘草异黄酮乙、甘草瑞酮、甘草异黄酮甲、毛蕊异黄酮。
在本发明中，所述的甘草利酮或其衍生物具有式I所示的通式：
R1选自H、OH、OCH3，R2选自H、CH2CH＝C(CH3)2，R3选自OCH3或OH，R4选自H、OH、CH2CH＝C(CH3)2或其与R3的OH成环，R5选自H、OH或OCH3，R6选自H或OH。
其中，所述的甘草利酮的化学式如式Ia所示：
所述的甘草异黄酮乙的化学式如式Ib所示：
所述的甘草瑞酮的化学式如式Ic所示：
所述的甘草异黄酮甲的化学式如式Id所示：
所述的毛蕊异黄酮的化学式如式Ie所示：
活性成分的制备方法
可用于制备本发明的甘草利酮或其衍生物的方法没有特别限制。可以用常规方法，以甘草属植物为原料，例如甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)、胀果甘草(G.inflata Batal)或洋甘草(又叫光果甘草，G.glabra Linn)，从而获得水溶性的和/或脂溶性的提取物。
在本发明的一个优选例中，活性成分的制备通过溶剂提取法、萃取法、和/或色谱法进行。
在本发明中，对于溶剂提取法，其所用的溶剂没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种或几种溶剂的混合溶剂。提取次数可以是一次或多次。
在本发明中，对于溶剂萃取法，其所用的溶剂没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、环己烷、石油醚中的一种或几种溶剂的混合溶剂。萃取次数可以是一次或多次；
在本发明中，对于柱色谱法，其柱色谱没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：活性碳、硅胶、反相硅胶、大孔树脂、葡聚糖凝胶中的一种或几种的组合。
在本发明的一个优选例中，以甘草属植物甘草为原料，以2-10倍的药材重的70-99％乙醇(或乙醇水溶液)提取1-5次，回收乙醇，得到乙醇提取物。乙醇提取物溶于0.5-2倍重量的水(优选50-99℃的热水)，冷却后以二氯甲烷萃取，经过活性筛选，表明该提取物可有效干扰或干预HIV病毒潜伏。
对提取物经硅胶柱色谱，以石油醚：乙酸乙酯为洗脱溶剂，除去油脂等化学成分，再以二氯甲烷：甲醇为洗脱剂得到脂溶性的部位，筛选发现具有最强活性，即为活性成分。
在另一优选例中，所述的洗脱溶剂至少包括由体积比为100：0～10：1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂。
在另一优选例中，所述的洗脱溶剂包括由体积比为100：0的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、由体积比为100：1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、由体积比为50：1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、由体积比为30:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、由体积比为25:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、由体积比为10:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、由体积比为5:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、由体积比为2:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂和由体积比为1:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂，并进行梯度洗脱。
在本发明的另一个优选例中，以甘草属植物胀果甘草为原料，以6-10倍药材重的水提取1-5次，浓缩得到水提取物。水提取物溶于0.5-2倍重量的水(优选50-99℃的热水)，冷却后水提取物经大孔吸附柱色谱，以乙醇水溶液为洗脱溶剂，以水除去无机盐的水溶性部分，以乙醇洗脱得到乙醇洗脱部位，筛选发现具有最强活性，即为活性成分。
活性筛选试验
本发明采用HIV潜伏细胞模型进行活性筛选试验，结果显示了具有抗HIV潜伏作用的甘草利酮或其衍生物，并用相应的赋型剂，按照常规的方法制成适用剂型，进行抗HIV潜伏作用试验，结果证实，所述的甘草利酮或其衍生物使感染细胞内潜伏的HIV表达，具有干预HIV潜伏的作用，与抗逆传录病毒药物联合使用，可清除被激活的潜伏感染的细胞，以此加速潜伏病毒储藏库的清除。
本发明涉及的HIV潜伏细胞模型，包括：一个携带绿色荧光蛋白基因的人T细胞10.6克隆株(J-Lat Full Length Clone10.6),由美国国家健康卫生研究院AIDS参考试剂计划部提供，由加洲大学Eric Verdin博士建立。该细胞小，球形细胞被悬浮培养。由携带绿色荧光蛋白基因HIV-R7/E-/GFP反转录病毒载体转染人T细胞Jurkat精细胞分选而来(Jordan A,Bisgrove D,VerdinE.HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infectionof T cells in vitro.EMBO J22:1868-1877,2003)；另一个建立的HIV潜伏筛选模型C11克隆，由HIV慢病毒感染T细胞经2次分选和激活而获得(中国专利：200810038851.X)。
组合物和施用方法
如本文所用，术语“组合物”包括(a)治疗和/或预防艾滋病的组合物，(b)激活潜伏的HIV病毒的组合物。此外，所述的组合物包括药物组合物、食品组合物或保健品组合物。
本发明的抗HIV潜伏的活性成分具有干预HIV潜伏的作用。因此，当在治疗上施用或给予本发明的抗HIV潜伏的活性成分时，可促进潜伏的HIV病毒的表达，进而激活潜伏的HIV病毒。通常，可将本发明的活性成分配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重，优选地，甘草利酮或其衍生物的用量可以为：成年人每日0.1～2000mg，优选1～300mg/天。
作为预防和抗艾滋病药物，可以制成口服和非口服制剂。口服给药可制成片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等常用剂型，所用的赋型剂可以为淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羟甲基纤维素等中的一种或几种。崩解剂可以为马铃薯淀粉、羟甲基纤维素等中的一种或几种。粘合剂可以为阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、糊精等中的一种或几种。口服制剂除上述剂型外，还可以制成乳剂、糖浆剂等。
非口服制剂可以制成注射剂，可以与注射用水、生理盐水、葡萄糖水制成注射剂，也可以在其中加入一定比例的乙醇、丙醇、乙二醇等。
此外，本发明的活性成分还特别适合与其他抗HIV的药物联用。尤其是本发明的活性成分可与抗逆传录病毒药物联合使用，清除潜伏感染的细胞，从而用于艾滋病的治疗。
本发明的进一步目的是提供一种治疗艾滋病药物的制备方法，采用所述的甘草利酮或其衍生物为药物原料，用相应的赋型剂，按照常规的方法制成口服和非口服制剂，其中的甘草利酮或其衍生物的用量可以为：成年人每日0.1～2000mg，优选1～300mg/天，每日服用1～5次；儿童的用量和次数需在成人的基础上酌情递减。
本发明的主要优点包括：
1.提出了甘草利酮或其衍生物的新用途，所述的甘草利酮或其衍生物在低浓度时即能明显使感染细胞内潜伏的HIV表达。
2.所述的甘草利酮或其衍生物可作为活性成分，制备抗HIV潜伏作用的药物，且制备工艺简单实用。
3.可进一步制备治疗艾滋病药物，将为艾滋病的彻底治愈提供新的途径。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1甘草利酮的制备
甘草(G.uralensis)根及根茎，生产日期为2008年12月，产地新疆，厂家为杭州市中药饮片厂，生产批号为081207，由浙江大学马忠俊教授鉴定。
甘草根及根茎5Kg,分别用8倍量的95％乙醇回流提取一次，75％的乙醇提取两次，每次两小时，将所得提取物回收至无醇味，得浸膏。加水稀释至3000mL,分别用等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取三次，回收二氯甲烷溶剂，得二氯甲烷萃取物101.2g.。具体操作流程如图7所示。
将二氯甲烷层(101.2g)以适量二氯甲烷溶解至流体状态，加入101g100-200目层析硅胶拌样，研磨至均匀状态，置通风橱过夜。以200-300目干法装柱，湿法上样，用纯石油醚冲洗柱子，直至柱子里充满液体后换上石油醚：乙酸乙酯(100：1)流动相洗脱。分别以石油醚：乙酸乙酯100:1,100:5,100:10,100:15,100:20,100:25,100:30,100:35,100:40,100:45,100:50,100:55,100:60,100:65,100:70,100:75,100:80,100:85,100:90,100:95,1:1,1:5,1:10,1:15,1:20,1:25,1:35；二氯甲烷：甲醇100:20,100:30,100:35,100:45进行洗脱，每个梯度洗脱溶剂为2L,分成4瓶，每瓶500mL。将所得溶液浓缩，浓缩液转移至10mL青霉素瓶，点板分析后将相同样品进行合并。编号9-11为9C，12,13为12D，15-18为15F，22-26为22H，27为27I，28-32为28J，33-40为33K，65-92为65Q。其中对22H、33K、65Q再次以石油醚：乙酸乙酯、二氯甲烷：甲醇为流动相进行硅胶柱层析。22H流分编号：4为22Hd，6为22He，8-9为22Hf；33K流分编号：1-4为33Ka，5-6为33Kb，7-8为33Kc，9-10为33Kd，11-15为33Ke；65Q流分编号：1-16为65Qa，17-26为65Qb，27-42为65Qc，43-53为65Qd，54-56为65Qe。分别对各个成分进行分离，主要分离方法为反相制备液相。27I以梯度甲醇/水70min内从55％-65％进行梯度洗脱，65分钟得化合物甘草利酮(17.9mg)。
1H NMR(DMSO-d6,500MHz)δ:8.02(1H,s,H-2)、3.40(2H,d,J＝8.0Hz,H-1′′)、5.11(1H,t,J＝8.0Hz,H-2′′)、1.62(3H,s,H-5′′)和δ1.69(3H,s,H-4′′)、6.32(1H,s,H-3′)、6.86(1H,d,J＝2.0Hz,H-8)、6.93(1H,dd,J＝2.0,9.0Hz,H-6)、7.91(1H,d,J＝9.0Hz,H-5)、3.403H,s,2′-OCH3)、3.73(3H,s,4′-OCH3)。
13C NMR(DMSO-d6,125MHz)δ:、175.7(C-4)、154.98(C-2)、18.08(C-5′′)、25.95(C-4′′)、22.75(C-1′′)、124.46(C-2′′)、132.21(C-3′′)、55.94(2′-OCH3)、61.05(4′-OCH3)、95.69(C-5′)、127.58(C-5)、115.42(C-6)、102.63(C-8)。
实施例2甘草异黄酮乙的制备
胀果甘草(G.inflata Batal)根及根茎5Kg,分别用8倍量的95％乙醇回流提取一次，75％的乙醇提取两次，每次两小时，将所得提取物回收至无醇味，得浸膏。加水稀释至3000mL,分别用等体积的二氯甲烷萃取三次，回收二氯甲烷溶剂，得二氯甲烷萃取物78.7g.。
将二氯甲烷层(78g)以适量二氯甲烷溶解至流体状态，加入80g200-300目层析硅胶拌样，研磨至均匀状态，置通风橱过夜。以200-300目干法装柱，湿法上样，用纯石油醚：乙酸乙酯(50：1)冲洗柱子，直至柱子里充满液体后换上石油醚：乙酸乙酯(25：1)流动相洗脱，得流分重结晶，得化合物甘草异黄酮乙(7mg)。
1H NMR(DMSO-d6,600MHz)δ:8.17(1H,s,H-2)、5.69(1H,d,J＝10.0Hz,H-3′′)、6.67(1H,d,J＝10.0Hz,H-4′′)、1.37(6H,s,H-5′′,6′′)、6.33(1H,d,J＝10.0Hz,H-5′)、6.89(1H,d,J＝10.0Hz,H-6′)、6.22(1H,d,J＝2.0Hz,H-6)、6.38(1H,d,J＝2.0Hz,H-8)、12.83(1H,s,5-OH)。
13C NMR(DMSO-d6,125MHz)δ:156.12(C-2)、181.04(C-4)、94.19(C-6)、99.46(C-8)、107.91(C-5′)、129.35(C-6′)、161.21(C-7)、156.43(C-5)、155.32(C-2′)、62.46(C-2′′)、117.44(C-3′′)、131.84(C-4′′)、25.98(C-5′′)、28.35(C-6′′)。
实施例3甘草瑞酮的制备
光果甘草(G.glabra Linn)根及根茎5Kg,用6倍量的95％乙醇回流提取一次两小时，将所得提取物回收至无醇味，得浸膏。加水稀释至3000mL,分别用等体积的二氯甲烷萃取三次，回收二氯甲烷溶剂，得二氯甲烷萃取物63g.。
将二氯甲烷层(60g)以适量二氯甲烷溶解至流体状态，加入60g200-300目层析硅胶拌样，研磨至均匀状态，置通风橱过夜。以200-300目干法装柱，湿法上样，用纯石油醚：乙酸乙酯(30：1)冲洗柱子，直至柱子里充满液体后换上石油醚：乙酸乙酯(20：1)流动相洗脱，得流分重结晶，得化合物甘草瑞酮(23mg)。
1H NMR(DMSO-d6,600MHz)δ:8.02(1H,s,H-2)、δ5.13(1H,m,H-2′′)、3.17(2H,d,J＝8.5Hz,H-1′′)、1.62(3H,s,H-4′′)、1.67(3H,s,H-5′′)、7.93(1H,d,J＝9Hz,H-5)、6.94(1H,dd,J＝2.5,9Hz,H-6)、6.87(1H,d,J＝2.5Hz,H-8)、6.33(1H,s,H-5′)。
13C NMR(DMSO-d6,125MHz)δ:154.99(C-2)、175.68(C-4)、22.76(C-1′′)、18.06(C-4′′)、25.93(C-5′′)、124.47(C-2′′)和δ130.06(C-3′′)、95.74(C-5′)、102.64(C-8)、127.60(C-5)、115.37(C-6)、155.28(C-4′)、158.38(C-6′)、162.86(C-7)。
实施例4甘草异黄酮甲的制备
前期过程如实施例1，实施例1中的28J，以梯度甲醇/水60min内从55％-60％进行梯度洗脱，47分钟得化合物甘草异黄酮甲(19.3mg)。
1H NMR(DMSO-d6,500MHz)δ：8.23(1H,s,H-2)、3.25(2H,d,J＝7.5Hz,H-1′′)、5.29(1H,t,J＝7.5Hz,H-2′′)、1.67(6H,s,CH3-4′′,5′′)、6.21(1H,d,J＝2.0Hz,H-6)、6.36(1H,d,J＝2.0Hz,H-8)、6.68(1H,d,J＝8.0Hz,H-5′)、6.88(1H,d,J＝8.0Hz,H-6′)。
13C NMR(DMSO-d6,125MHz)δ：180.74(C-4)、154.25(C-2)、28.74(C-1′′)、124.46(C-2′′)、132.11(C-3′′)、18.14(C-4′′)、25.98(C-5′′)、94.11(C-8)、99.43(C-6)、114.46(C-5′)、158.03(C-4′)、162.50(C-5)、164.81(C-7)、120.95(C-6′)。
实施例5毛蕊异黄酮的制备
前期过程如实施例1，实施例1中的28J，以梯度甲醇/水60min内从55％-60％进行梯度洗脱，27分钟得化合物毛蕊异黄酮(30.3mg)。
1H NMR(DMSO-d6,500MHz)δ：8.30(1H,s,H-2)、7.97(1H,d,J＝9.0Hz,H-5)、6.93(1H,dd,J＝2.1,9.0Hz,H-6)、6.86(1H,d,J＝2.1Hz,H-8)、7.04(1H,d,J＝2.5Hz,H-2′)、7.32(1H,dd,J＝2.5,8.5Hz,H-6′)、6.95(2H,d,J＝8.5Hz,H-5′)、3.79(3H,s,4′-OCH3)、9.04(1H,s,3′-OH)、10.81(1H,s,7-OH)。
13C NMR(DMSO-d6,125MHz)δ：174.62(C-4)、123.41(C-3)、127.33(C-5)、115.23(C-6)、162.65(C-7)、102.15(C-8)、157.44(C-9)、116.63(C-10)、116.41(C-2′)、146.02(C-3′)、147.53(C-4′)、112.03(C-5′)、119.75(C-6′)、55.74(4′-OCH3)。
实施例6甘草利酮或其衍生物对HIV潜伏诱导激活的影响
6.1按每孔2×104个细胞将A10.6细胞种植于96孔板，每孔加入100μl含10％FBS(Gibco)的1640培养基(Gibco)。24小时后，加甘草利酮或其衍生物(甘草利酮、甘草异黄酮乙、甘草瑞酮)至终浓度1μg/mL。每个浓度至少3个复孔，每个实验重复3次。药物处理细胞72小时后，在荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况，并收集细胞进行流式细胞术检测，分析荧光细胞所占比例。
6.2本实施例以终浓度为10μg/mL的甘草利酮或其衍生物处理HIV潜伏感染细胞模型(A10.6潜伏细胞)，在甘草利酮或其衍生物处理后的3天，通过对报告基因绿色荧光蛋白的荧光显微镜观察和流式细胞术检测，分析HIV潜伏感染细胞的激活效率，从而获得药物作用的剂量效应关系。
结果显示,图2为A10.6潜伏细胞用甘草利酮处理后荧光照片暗场及同一视野明场照片，可见较多荧光细胞。图3为A10.6潜伏细胞用甘草异黄酮乙处理后荧光照片及同一视野白光照片，可见较多荧光细胞。图4为A10.6潜伏细胞用甘草瑞酮处理后荧光照片及同一视野白光照片，可见较多荧光细胞。HIV潜伏感染细胞经甘草利酮处理后绿色荧光阳性的细胞比例达高达91.11％(图6)；未加甘草利酮或其衍生物处理的HIV潜伏感染细胞，其荧光阳性的细胞比例仅有不到1％背景激活(图5)。
结果提示，甘草利酮或其衍生物具有对HIV潜伏感染细胞的干预作用。
实施例7不同浓度的甘草利酮对HIV潜伏诱导激活的影响
重复实施例6，不同点仅在于，用终浓度为1μM，2.5μM,5μM mL、10μM,20μM的甘草利酮。结果显示，在上述浓度下，HIV潜伏感染细胞经不同浓度甘草利酮处理后绿色荧光阳性的细胞比例为20-92％，远高于对照不到1％的背景激活。这表明，本发明的甘草利酮对HIV潜伏感染细胞有显著的干预作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种甘草利酮或其衍生物的用途，其特征在于，(a)用于制备干预HIV病毒潜伏的组合物；(b)用于制备治疗艾滋病的药物；或(c)用于制备与抗逆传录病毒药物联合使用从而治疗艾滋病的药物，
其中，所述的甘草利酮或其衍生物具有式I所示的通式：
R1选自H、OH、OCH3，R2选自H、CH2CH＝C(CH3)2，R3选自OCH3或OH，R4选自H、OH、CH2CH＝C(CH3)2或其与R3的OH成环，R5选自H、OH或OCH3，R6选自H或OH。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述甘草利酮或其衍生物包括甘草利酮、甘草异黄酮乙、甘草瑞酮、甘草异黄酮甲、或毛蕊异黄酮。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的干预HIV病毒潜伏包括：诱导HIV病毒潜伏感染细胞中HIV前病毒表达、和/或激活潜伏的HIV病毒；和/或
所述的治疗艾滋病包括抗HIV潜伏治疗。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的甘草利酮或其衍生物通过溶剂提取法、萃取法、和色谱法制备获得。
5.如权利要求1-4所述的用途，其特征在于，组合物包括药物组合物、食品组合物或保健品组合物。
6.一种用于治疗艾滋病的活性成分，其特征在于，所述的活性成分具备以下特征：
(a)该活性成分是提取自甘草属植物的枝、叶、根、和/或茎的水溶性的和/或脂溶性的提取物；或提取自甘草属植物的枝、叶、根、和/或茎的醇提取物；
(b)该活性成分含有一种或多种选自下组的组分：甘草利酮、甘草异黄酮乙、甘草瑞酮；和
(c)该活性成分具有诱导HIV病毒潜伏感染细胞中HIV前病毒表达、和/或激活潜伏的HIV病毒的功能。
7.一种药物组合物，其特征在于，含有安全有效量的权利要求6所述的活性成分和药学上可接受的载体。
8.一种体外非治疗性诱导HIV病毒潜伏感染细胞中HIV前病毒表达的方法，其特征在于，包括步骤：在甘草利酮或其衍生物的存在下，培养所述的HIV病毒潜伏感染细胞中，使得潜伏的HIV前病毒表达，从而激活潜伏的HIV病毒。
9.一种非治疗性的激活潜伏的HIV病毒的方法，其特征在于，包括步骤：将HIV病毒潜伏感染细胞与甘草利酮或其衍生物接触，给需要的对象施用权利要求6所述的活性成分或权利要求7所述的药物组合物，从而激活潜伏的HIV病毒。
10.一种制备用于治疗艾滋病的药物组合物的方法，其特征在于，包括步骤：将权利要求6所述的活性成分与药学上可接受的载体混合，从而形成药物组合物。
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