JP2008506684A

JP2008506684A - 「抗ガン性野生チョウセンニンジンの精製エキス調整法及びそのガン融合製剤」

Info

Publication number: JP2008506684A
Application number: JP2007521387A
Authority: JP
Inventors: ジンパク，ヨン; ソプシム，イン; ヨンソン，ギュ
Original assignee: セオクサンテオメディカルカンパニー，リミテッド
Priority date: 2004-07-15
Filing date: 2004-08-02
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2024-08-02
Also published as: CN100546593C; US7744936B2; US20080050426A1; CA2574022A1; KR100456089B1; CN1988911A; CA2574022C; JP5086805B2; WO2006006750A1

Abstract

本発明はガン細胞付着の抑制、ガン細胞転移の抑制、および免疫刺激効果といった抗ガン性が示される野生チョウセンニンジンを元にした精製エキスの調製方法ならびに該考案方法により調製されるものと同じものが含まれる合成剤に関する。該合成剤は有効な抗ガン性を有するので様々なガン疾病の治療と予防向けの治療薬として使用可能である。
【選択図】無し

Description

本発明は抗ガン性が示される野生チョウセンニンジンを元にした精製エキスの調整方法ならびにそれを含有する合成剤に関する。

ガンは異常分化を生じる細胞循環の障害によって起こる悪性腫瘍であるとともに、3段階すなわち、創始、助長および進行を通じて発展する。ガンの創始の多くは十分な量の発ガン物質によって生じ得るが、少量のイニシエーターにより正常細胞の変異、変異細胞の拡散、そして最終的には腫瘍促進物が細胞に発生して、ガン組織の形成が生ずる異常細胞の分化を促進する。

これまでのガンを治療する様々な抗ガン薬を開発する数多くの試行あるいは方法、例えば、ガン細胞に直接作用する細胞毒性物質のスクリーニング方法、体内免疫性の調整物質のスクリーニング方法、ガン細胞転移抑制物質のスクリーニング方法、最近集中的に研究されてきている血管形成抑制物質のスクリーニング方法等が行われてきた。

従来から使用されている抗ガン薬は３つのグループ、すなわち、遺伝子あるいは酵素の配合といった生物学的薬品ワクチン等、タクソール、ビンブラスチーン等といったワクチン等の化学療法剤（純粋合成抗ガン薬）、および天然資源から由来する天然生成薬品に分類され得る。しかしながら、生物学的薬品はまだ臨床上使用されるまでに至っていない。その上、化学療法剤は、その有効な抗ガン性にも係わらず、特定の抗ガン剤に対する不耐性、骨髄の機能不全、嘔吐、吐き気といった胃の異常、毛髪喪失の発生といった様々な逆効果のため使用の限界を有する。（ギルマン他によるマックウェルマクミラン誌1986年18号1202頁、チャン他によるWonkwang大学メディカルサイエンス誌1987年3号13〜34頁）多くの抗ガン薬はその分子量が小さいので、抗ガン薬は正常細胞の損傷を生ずるガン細胞と同様に正常細胞特に活性的な分化細胞に浸透可能であるとともに、尿素から容易に排出され、これには比較的薬の量が必要とされることが報告された。（山崎他によるBiosci. Biotech. Biochem誌1992年56(1)号149頁、トムソン他によるExp. Cell Res誌1966年41号411〜427頁、エレム他によるDevel.Biol誌1968年118号311〜330頁）

最近では、生薬あるいは天然生成物を元にしたガン疾病予防あるいは治療の抗ガン剤を開発する多くの試みがあった。

従って、天然資源から毒性が低いかあるいは最小限である検証された有効性を備えた効果的な物質を見いだす緊急の必要があった。最近では、代替医療、特に、免疫増進機構に基づく中国医療が化学療法の逆効果を回避する従来の西洋医薬の代替方法として脚光を浴びてきた。中国医療の中では、免疫増進性と少ない毒性を示す中国薬から抽出された植物エキスの使用と共に、効果的なエキスを利用する鍼治療の利用が韓国では脚光を浴びるようになってきており、これには、個々の疾病に最大の効能を有する植物あるいはその他の天然資源の選定、最大の効力および最小の毒性が備わったエキスからの有効成分の抽出、該成分の身体の鍼に適切な局所あるいは痛みのある場所への接種あるいは注射からなる段階が含まれる結果、鍼効果と成分の薬理学上の効果によるシナジー効果が与えられ得る。しかしながら、発熱、苦痛、浮腫等といった注射あるいは鍼に調剤するにはその有害性が示される可能性のある生の形態よりもより毒性の低いさらに精製されたエキスの入手の必要があった。

上記で引用された文献のいずれにも抗ガン性を示す野生チョウセンニンジンを元にした精製エキスの調製方法ならびにこれを含む合成剤については報告あるいは公開されておらず、その公開内容はここに参照され一体化される。

本発明の方法によって調製される野生チョウセンニンジンを元にした精製エキスのガンおよび腫瘍細胞に関する効果に関して調査を行うために、本発明の発明者等は集中的に試験管内かつ生体内モデル実験を実施するとともに、精製エキスが抗ガン性ならびに免疫刺激効果を示すことを裏付けることによって最終的に本発明を完成したものである。

本発明によるこれらとその他の目的は以降に提供される本発明内容の詳細にわたる公開より明らかになろう。
（非特許文献１）ギルマン他によるマックウェルマクミラン誌1986年18号1202頁（非特許文献２）チャン他によるWonkwang大学メディカルサイエンス誌1987年3号13〜34頁（非特許文献３）山崎他によるBiosci. Biotech. Biochem誌1992年56(1)号149頁（非特許文献４）トムン他によるExp. Cell Res誌1966年41号411〜427頁（非特許文献５）エレム他によるDevel.Biol誌1968年118号311〜330頁（非特許文献６）「レミントン薬品科学」（マック出版社ペンシルバニア州イーストン市）

本発明はガン疾病の治療性および防止性を有する野生チョウセンニンジンを元にした精製エキスの調製方法を提供するものである。

本発明は抗ガン性によってガン疾病を治療しかつ予防する有効な量の活性成分として上述の方法を元に調製される野生チョウセンニンジン精製エキスが含まれる薬用合成剤を提供するものである。

本発明はまた哺乳動物あるいはヒトにおけるガン疾病が抗ガン性によって治療されかつ防止される薬用合成剤の調製向けエキスの利用をもたらすものである。

従って、本発明の目的は野生チョウセンニンジン材料の抽出溶剤による繰り返し蒸留抽出方法の適用、凍結精製エキスを得るための蒸留エキスの凍結、該エキスの解凍ならびに精製エキスを得るための濾過からなる段階が含まれる野生チョウセンニンジンを元にした精製エキスの調製方法の提供である。

本発明の目的はガン疾病の治療と防止に有効な量の活性成分として上述の方法によって調製される野生チョウセンニンジンの精製エキスが含まれる薬用合成剤の提供である。

本発明の目的はほ乳動物あるいはヒトにおけるガン疾病の治療と予防向けの上述の治療剤調製方法によって調製される野生チョウセンニンジンの精製エキスの利用がもたらされることでもある。

本発明の目的は薬用上受入れ可能なその媒介体を使用して上述の方法によって調製される野生チョウセンニンジン精製エキスの有効量が哺乳動物あるいはヒトに投与されることが含まれる前記哺乳動物あるいはヒトにおけるガン疾病の治療あるいは防止方法の提供である。

ここに公開される用語「抽出溶剤」には、水、メタノール、エタノールといった低級アルコール、好ましくは水が含まれる。

ここで公開される用語「野生チョウセンニンジン材料」には、例えば、韓国、日本、ロシア、中国、欧州、米国等世界中で栽培されるかあるいは天然に成長する野生チョウセンニンジンのすべての野生チョウセンニンジンが含まれる。

本発明の薬用合成剤には合成剤の全重量に基づいた重量で上記エキスが約０．０１〜５０％含まれる。

考案された野生チョウセンニンジンの精製エキスは次の好ましい実施例により調製可能である。

これ以降、本発明が詳細に説明される。

考案された野生チョウセンニンジンの精製エキスは次の詳細な手順により調製可能である。

野生チョウセンニンジンの考案された精製エキスは次のように調製可能である。

具体的には、本発明の目的は、野生チョウセンニンジン材料に第1段階における第１蒸留物を得るための抽出溶剤による第１蒸留抽出方法の適用、該第１蒸留物に第2段階における第２蒸留物を得るための抽出溶剤による第２蒸留抽出方法の適用、第3段階における凍結精製エキスを得るための第２蒸留物の凍結、第4段階における該エキスの解凍ならびに濾過済みエキスを得るための濾過、第5段階における該濾過物の二重ボイラーによる加熱ならびに再凍結、第6段階における本発明の精製エキスを得るための該エキスの解凍と殺菌からなる段階が含まれる野生チョウセンニンジンを元にした精製エキス調製方法の提供である。

詳細には、第1段階では、野生チョウセンニンジン材料は水、メタノール、エタノール、プロパノールといった低級アルコールおよびその溶剤混合物から選定される極性溶剤、好ましくは水さらに好ましくは水１リットル当たりの材料が1.0キログラムから3.0キログラムまでの変動幅の割合の水に投入されるとともに、1時間から4時間の変動幅の時間の間、好ましくは3時間、室温で放置されるのが好ましい。引き続いて、これが６０℃から１２０℃の変動幅の温度で、好ましくは８０℃から１００℃で、さらに好ましくは１００℃で６時間から２４時間の変動幅の時間の間、好ましくは８時間から１０時間まで徐々に蒸留装置により加熱されて第１蒸留物が得られる。

第２段階では、該蒸留物は蒸留装置が装備された沸騰片含有フラスコに添加されるとともに６０℃から１２０℃、好ましくは８０℃から１００℃の、さらに好ましくは１００℃の変動幅の温度で、７時間から２４時間の変動幅の時間の間、好ましくは８時間から１２時間徐々に加熱されると同時に、該加熱処理が第２蒸留物を得るため濃縮体積が７０％から９０％（容積比）の変動幅で減少する程度にまで継続されるのが好ましい。

第３段階においては、第２蒸留物がー５℃からー１５℃の変動幅、好ましくはー８℃からー１２℃の温度で凍結処理を受けると同時に、該処理は凍結片の体積が全体積５％未満まで減少する程度にまで継続されるのが好ましい。非凍結片は除去されると同時に残留蒸留物は解凍処理を受ける。これらの非凍結片の凍結および除去処理は本発明の精製エキスを得るためにその繰り返しが好ましくは３回から６回まで可能である。該第３段階を通じて、第１段階の野生チョウセンニンジン材料の毒性物質はこの段階によって調製される精製エキス中で殆どあるいは完全に除去される。

第４段階では、第３段階の凍結精製エキスが室温での解凍処理を受けるとともに、濾過物を得るために０．１〜０．６マイクロメーター、好ましくは０．４マイクロメーターの変動幅の孔の大きさをもつ濾過紙による濾過処理が継続されるのが好ましい。

第５段階では、上の段階で調製された濾過物が６０℃から１２０℃までの変動幅、好ましくは８０℃から１００℃までの温度で、２０分から４０分までの変動幅の時間、好ましくは３０分の間、二重ボイラーにより加熱されるとともに、凍結精製エキスを得るため―３０℃からー１０℃の変動幅、好ましくはー１５℃の温度で完全に再凍結される。

第６段階では、凍結濾過物が本発明の最終精製エキスを得るため解凍されると同時に殺菌される。

上述の第１段階で、第１蒸留物の濃度は本発明の目的に応じて材料の割合を変化させることによって制御可能である。

上述の精製処理では、エキスは個別の成分差に応じて２つの部分、すなわち、凍結部分と非凍結部分に分離可能である。エキスに含まれるより毒性の強い成分はその低凍結点のために毒性のよりより弱い成分より凍結が遅れるので、多くの毒性成分を含む非凍結部分は上の凍結処理が繰り返されることによって除去可能である。

従って、本発明の目的は、抗ガン性によってガン疾病が治療されかつ予防されるのに有効な量の活性成分として上述方法により調製される野生チョウセンニンジン精製エキスの含有可能な薬用合成剤の提供にある。

本発明の目的は、ヒトあるいは哺乳動物のガン疾病の治療と予防向けの治療剤の上述の調製方法により調製される野生チョウセンニンジン精製エキスの利用をもたらすことにある。

本発明の目的は、その薬用上受入れられる媒介体と一緒に上述の方法によって調製される野生チョウセンニンジン精製エキスの有効量の哺乳動物あるいはヒトへの投与が含まれる前記哺乳動物あるいはヒトのガン疾病の治療あるいは予防方法の提供にある。

ガンおよび腫瘍細胞に関する本発明の精製エキスの効果が裏付けられる試験管内かつ生体内モデル実験を通じて、本発明者等は精製エキスが抗ガン性ならびに免疫刺激効果を示すことを裏付けたものである。

従って、本発明の精製エキスはガン疾病の治療と予防に有用であり得る。

効能に加えて、本発明の精製エキスは遙か昔から商用生薬として利用されてきたので長期間の投与で安全な利用が可能である。

ガン疾病の治療と予防向けに考案された合成剤には上のエキスが合成剤の全重量に基づく重量で０．０１％〜５０％含まれ得る。

考案された合成剤にはさらに、当技術でよく知られた利用方法による従来の媒介体、添加剤、あるいは希釈剤が含まれて良い。前記媒介体は用法と適用方法に応じた適当な物質として利用されることが好ましいが限定はされない。適切な希釈剤は「レミントン薬品科学」（マック出版社ペンシルバニア州イーストン市）に書かれた原文に掲載されている。

これ以降に続く処方方法および賦形剤は単なる例示に過ぎないと同時に本発明を制約するものではない。

考案された本合成剤は薬用に受入れ可能な媒介体あるいは希釈剤、例えば、ラクトース、デキシトロース、スクロース、ソルビトール、マニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉質、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムリン酸塩、カルシウム珪酸塩、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチル水酸基安息香酸塩、タルク、マグネシウム、ステアリン酸塩、および鉱物油が含まれる薬用合成剤として提供され得る。本処方にはさらに濾過剤、抗膠着剤、潤滑剤、湿潤剤、芳香剤、乳化剤、防腐剤、等々が含まれても良い。本発明の合成剤は本技術でよく知られた任意の処置が採用されることによってこれらの患者への投与後に活性成分の迅速な、持続した、あるいは遅れた放出がもたらされるように処方されても良い。

例えば、本発明の合成剤は油、プロピレングリコール、あるいは注射薬の製造に一般的に利用されるその他の溶剤に溶解可能である。媒介体の適当な例には生理学的塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物油、イソプロピルミリスチン酸塩等が含まれるがこれらに限定はされない。局部投与に関しては、本発明のエキスは軟膏およびクリームの形態で処方可能である。

本合成剤が含まれる薬用処方は経口服用形態（粉末、錠剤、カプセル、ソフトカプセル、水溶性薬、シロップ、エリクシールピル、粉末、香袋、顆粒）あるいは局部調製（クリーム、軟膏、ローション、ゲル、香油、膏薬、ペースト、スプレー溶液、エーロゾルその他）、注射可能な調製（溶液、懸濁体、乳液）あるいは鍼注入可能な調製といった任意の形態で調製可能である。

薬用服用形態の本発明の合成剤はこれらの薬用上受入れ得る塩の形態で利用され得ると同時に、単独あるいはその他の薬用活性合成剤との組合せと同様に適切な組合わせでの利用も可能である。

考案された本エキスあるいは合成剤の望ましい服用は状況および患者の体重、深刻度、薬物形態、経路および投与期間に応じて変化すると同時に、本技術の専門家達によって選定されて良い。しかしながら、望ましい効果が得られるためには、一般的に本発明の考案エキスあるいは合成物の一日当たりの重量で10グラム/キログラム好ましくは1グラム/キログラムから3グラム/キログラムで変動する量が投与されることが勧められる。該服用量は一日当たり１回あるいは数回に分けて投与されても良い。合成剤に関して、考案されたエキスの量は合成剤の全重量に基づいた重量で０．０１から５０％、好ましくは０．５から４０％までの間の重量でなくてはならない。

本発明の薬用合成剤は様々な経路を通じて哺乳動物（ネズミ、マウス、家畜あるいはヒト）といった対象動物に投与可能である。あらゆる投与形態が考えられ、例えば、投与は、経口的に、直腸経由で、あるいは静脈内、筋肉内、皮下、皮膚内、髄膜下、硬膜外、あるいは大脳室内の注射あるいは鍼に適当な場所の鍼注射によって行われ得る。

本発明の考案によるエキスは毒性および逆効果が全く無いので安全に利用可能である。

専門家等には様々な修正および変型が本発明の精神あるいは範囲から逸脱せずに本発明の合成剤、利用および調製に行われ得ることは明らかであろう。

本発明の精神あるいは範囲から逸脱せずに本発明の合成剤、利用および調製において様々な修正と変形が行われ得ることは本技術の専門家等にとっては明らかであろう。

本発明が以下の例によってさらに詳細に説明される。しかしながら、本発明はどうような方法でもこれらの例に限定はされないことが理解されなくてはならない。

以下の「参考例」および「実験例」はその範囲を限定することなく本発明をさらに例示することが意図されるものである。

「比較例１」：非天然成長野生チョウセンニンジンの精製エキスの調製

天然成長野生チョウセンニンジンを元にした「Sanyang」の2.5キログラムが塩水で洗浄されると同時に幅３ミリで薄片に切られ、１リットルの水が含まれるフラスコに移されるとともに、１００℃で８時間加熱された。蒸留物は孔の大きさが0.10から0.6マイクロメーターの変動幅である濾過紙により濾過された。濾過物は室温で冷却されるとともに、殺菌されると同時に４℃未満の温度に維持される殺菌済みの瓶に貯蔵され、次の実験の試料として利用された。

「比較例２」：栽培野生チョウセンニンジンの精製エキスの精製

天然成長野生チョウセンニンジンを元にした栽培野生チョウセンニンジンの2キログラムが塩水で洗浄されると同時に幅３ミリで薄片に切られ、１リットルの水が含まれるフラスコに移されるとともに、１００℃で８時間加熱された。蒸留物は孔の大きさが0.10から0.6マイクロメーターの変動幅である濾過紙により濾過された。濾過物は室温で冷却されるとともに、殺菌されると同時に４℃未満の温度に維持される殺菌済みの瓶に貯蔵され、次の実験の試料として利用された。

「例１」：天然成長野生チョウセンニンジンの精製エキスの調製

天然成長野生チョウセンニンジンを元にした「Sanyang」の2.5キログラムが塩水で洗浄されると同時に幅３ミリで薄片に切られ、１リットルの水が含まれるフラスコに移されるとともに、２０℃で３時間放置された。

フラスコには蒸留装置が装備されるとともに、第１蒸留物5グラムの沸騰片を得るため１００℃で８時間加熱されると同時に該第１蒸留物は蒸留装置が装備されたフラスコに移され、かつさらに第２蒸留物を得るため１００℃で１０時間加熱された。第２蒸留物は非凍結部分の体積が全体積の５％未満になるまでー１０℃で凍結されるとともに、非凍結部分は廃棄された。残りの凍結部分は室温で解凍された。この上の凍結ならびに解凍段階はさらに２回繰り返された。凍結部分が解凍された後、0.1から0.6マイクロメーターの孔の大きさの濾過紙により濾過されるとともに、該濾過物は９０℃の二重ボイラーで３０分間加熱された。該濾過物は冷却されるとともにー１５℃で完全に凍結された。該凍結精製エキスは室温で解凍され、殺菌されるとともに４℃未満の温度が維持される殺菌済の瓶に貯蔵され次の実験の試料として利用された。

「例２」栽培野生チョウセンニンジンの精製エキスの調製

2キログラムのKyunghee大学（韓国ソウル市）に供給された栽培野生チョウセンニンジンが塩水により洗浄されるとともに、幅３ミリの薄片に切られ、１リットルの水が含まれるフラスコに移され、２０℃で３時間放置された。

さらに追加の段階は栽培野生チョウセンニンジンの精製エキスを得るために「例１」のものと類似の方法により行われるとともに、次の実験の試料として利用された。

「例３」上の「比較例１」および「例１」の内容物分析

上の「比較例１」および「例１」のサポニンの内容物は「高性能液体クロマトグラフィー」（コラム、Phenomenex Nuna C18(150x2.0ミリ、5マイクロメーター)、流れ速度：0.3ミリリットル/分、検出器：203ナノメーターＵＶ検出器、現像溶剤：開始溶剤CH₃CN:H₂0=15:85 および0%から30%までのCH₃CN:H₂ 0=80:20、７０分以上、室温）を利用して測定された。

図１および図２に示されるように、上の内容物分析の結果は上の「比較例１」および「例１」中のサポニンの内容物が２つの試料間で著しい差が示されることが検出された。

「比較例１」細胞培養
Ｕ９３７（ヒト白血病細胞株）、Ａ５４９（ヒト肺ガン細胞株）、およびＭＤＡ-ＭＢ-２３１（ヒト胸部ガン細胞株）細胞は加湿培養器の５％ＣＯ_２と９５％空気の状態で３７℃で活性化された１０％のウシ胎仔血清を補足して、ＲＰＭＩ１６４０（米国Gibco BRL社）の直径１００ｍｍ（スイスＴＰＰ社）の培養皿で成長させた。

「実験例１」細胞毒性測定
Ｕ９３７（ヒト白血病細胞株）、Ａ５４９（ヒト肺癌細胞株）、およびＭＤＡ-ＭＢ-２３１（ヒト胸部ガン細胞株）の野生チョウセンニンジンの細胞毒性は（３−[４、５-ジメチルチアゾール−２−イル]−２、５−臭化ディフェニール・テトラゾリウム（ＭＴＴ）検定法により測定される。

１０ｍｍ培養皿上の細胞は培養皿から分離するため５００マイクロリットルのトリプシン−ＥＤＴＡ（米国Gibco BRL社）で処理し、トリプシン-ＥＤＡ溶液を中和し、細胞浮遊を得るように１０ミリリットルの新しい媒体をそれに加えた。

１Ｘ１０^４細胞/ウェルは９６枚のウェルプレートに２４時間の培養後蒔かれた。細胞は比較例１，２及び例１，２即ち夫々０、１２５、２５０、５００及び１０００マイクログラム/ミリリットルに調整された１００マイクロリットル/ウェルの色々な濃度のエキスで処理され、そして更に４８時間培養された。４８時間後に、媒体は廃棄されそしてその濃度を５ミリグラム/ミリリットルに調整されたＰＢＳ緩衝液で希釈された１０マイクロリットルのＭＴＴ溶液（媒体に浮遊した５マイクログラム/ミリリットル、米国シグマ社）を３７℃で４時間培養するため各細胞に添加した。媒体は残留ＭＴＴ試薬を除去するためＰＢＳで洗浄し、そして１００マイクロリットルのＤＭＳＯ（ジメチル・スルフォキシド）を各ウェルに滴下した。ウェルプレートは室温で２０分間培養され次に５７０ナノメーターで細胞生存率を計算するためサンプルのＵＶ吸収率をマイクロプレートリーダ（ＥＬＩＳＡリーダ、日本デンリ社）により測定した。

媒体だけで処理された逆調整グループの細胞生存率は１００％と計算されそして他のサンプルと正調整のそれらを計算した。

正調整グループとして１００マイクロリットル/ウェルの色々な濃度のアドリアマイシン、即ち０、３．１２５、６．２５、１２．５、２５を９６枚のウェルプレート上に蒔き、４８時間培養しそして濃度５ミリグラム/ミリリットルの希釈ＭＴＴで処理した。

ＭＴＴ中に存在する細胞酵素の量の減少を示す測定された吸収率は生き残り細胞の密度に比例した。５０％のガン細胞生き残りを抑制するために必要なサンプル濃度はＩＣ_５０値と表現される。

結果として、比較例１，２と例１，２処理グループ（ＩＣ_５０、>３００マイクロリットル/ミリリットル）は低い細胞毒性効果を示した一方、アドリアマイシン処理グループはＵ９３７、Ａ５４９７及びＭＤＡ-ＭＢ-２３１ガン細胞（表１，２及び３参照）に対し比較的強い細胞毒性効果を示した。

「実験例２」細胞質への付着に関する抗ガン細胞の抑制

ガン細胞が第１発生領域から別の器官に移動する場合、該ガン細胞は細胞質において個別の物質への細胞付着能力、すなわち、コラーゲン、ラミニン、ゼラチン等あるいは転移のための血液内覆組織を必要とする。

本発明のエキスの細胞付着能力の抑制効果を測定するために、MDA-MB -231細胞（1 x 10⁶セル/ウェル)）が０．１％ゼラチンおよび様々な濃度の「比較例１」によって塗布された９６枚のウェルプレート中に着床されるとともに、「例１、２」（0、62.5、125、 250および500マイクログラム/ミリリットル)がそれぞれ100マイクロリットル/ウェルの濃度にまで処理された。細胞は３７℃の培養器のプレート底に張り付くまで培養されると同時に該プレートはPBS緩衝剤により丁寧に洗浄された。張り付いた細胞は結晶紫着色剤により着色されるとともに、ＯＤ値がマクロプレートリーダー（エリザリーダー、日本、デンレイ社）によって620ナノメーターにて測定された。

結果として、比較例１、２および例１、２処理グループが服用量に応じてMDA-MB-231細胞のゼラチンへの付着を抑制することを示すことが裏付けされた。（表１参照）

「実験例3」：MDA-MB-231細胞の転移に関する抑制効果

ガン細胞転移に関する本発明のエキスの抑制効果を測定するために、孔の大きさが８マイクロメーターのポリカーボネート膜が５０マイクロメーターのマトリゲルが１時間たっぷり塗布されるとともに、空気中で２４時間乾燥された。０．１％のＢＳＡで追加された条件付けられた各３０マイクロリットルの媒体がボイデン室のより低い区画に移された。「比較例１、２」および「例１、例２」によって調製されたエキスの５０マイクロリットルにより処理された０．１％のＢＳＡを含むRPMI1640 (FBSフリー)により追加されたMDA-MB-231細胞(1 x 10⁶ セル/ウェル)の５０マイクロリットルがボイデン室の上部区画にそれぞれ移された。湿気が含まれた培養器中でＣＯ₂５％および９５％空気の条件中で３７℃１６時間培養した後、膜がMeOHによって固定されると同時にQuic溶液（Diffco株式会社）により着色された。上部区画から低部区画まで侵入した細胞数が光学分光器によって計数された。

結果として、「例１および２」のエキスにより処理されたグループが「比較例１および２」のエキスにより処理されたグループと比較して服用量に応じてMDA-MB-231細胞の転移のより強力な抑制が示されることが裏付けられた。（表２参照）

「実験例３」ルイス肺悪性腫瘍細胞による使用ガン細胞の堆積増加量の抑制効果

ガン細胞の体積増加量に関する抑制効果を測定するため、次の実験が文献で公開された手順が修正されて実施された。（テルヒロ他、「Cancer Res」誌1996年14号2809〜2814頁）

実験用マウスの生体内で第２培養されると同時に、濃度を1 x 10⁶ セル/ウェルに調整されたルイス肺悪性腫瘍細胞（1 x 10⁶セル/ウェル）が、BDF-I雄マウス（生後６週間）の左脇の下に注射された。２４時間後、０．５および１ミリグラム／マウスの濃度のアドリアマイシンならびに50および100 マイクロリットル/マウスの濃度の「比較例１、２」および「例１、２」で調製されたエキスがマウスに腹腔内を通じて注射された。試料の注射は照合グループとして使用された非処理グループのマウスの腫瘍体積が２立方センチになるまで２週間継続された。２週間後、腫瘍体積は腫瘍体積の抑制速度が測定されるために次の算式１および２を利用して計算された。

算式１

（数１）腫瘍体積（cm³）=LxW²/2
L cm:腫瘍の長さ
W² cm²：W:腫瘍の幅

算式２

（数２）腫瘍体積の抑制率（％）＝（Ａ−Ｂ）／ＡＸ１００
Ａ：照合グループの腫瘍体積（cm³）

Ｂ：試料処理グループの腫瘍体積（cm³）

結果として、「例１、２」のエキスにより処理されたグループは「比較例１、および２」のエキスによる処理グループと比較して服用量に応じてルイス肺悪性腫瘍細胞の体積成長の抑制がより強く示されることが裏付けられた。（表３参照）

「実験例５」：体重測定

上の「実験例３」で用意されたマウスの体重が実験期間中に自動体重測定設備（Jenix韓国Dongsintonsang社）により測定された。

結果として、「例１および２」処理グループは従来の入手可能な抗ガン薬の多くがその有害作用のため体重減少を示すのに対し体重の相当な増加を示した。

「実験例６」：B16-F10黒色腫細胞の転移に関する抑制効果

ガン細胞の転移に関する抑制効果が測定されるため、B16-F10黒色腫細胞(2.5 x 10⁵セル/ウェル)がC57BL/6マウスの外尻静脈に注射された。２４時間後、100 マイクロリットル/マウス/日の濃度の「比較例１、２」で調製されたエキスがそれぞれ注射された。注射から１４日後、上の実験マウスは殺害されるとともに、マウスから引き渡された肺転移腫瘍細胞の群棲が肉眼検査によって観察された。

結果として、「例１および２」で調製されたエキスが「比較例１および２」で調製されたエキスと比較してB16-F10黒色腫細胞の転移に関する抑制効果をより強く示すことが裏付けられた。（表４参照）

「実験例７」：BALB-cマウスの脾臓の白血球が利用される免疫刺激効果

本発明のエキスの免疫刺激効果を測定するため、BALB-cマウスの脾臓白血球(1 x 10⁶セル/ミリリットル)が100 マイクログラム/ミリリットルのストレプトマイシン、100 マイクロメーターのペニシリンおよび10%の牛胎児血清が追加されるとともに、200 マイクロリットル/ミリリットルの「比較例１、２」および「例１、２」のエキスにより処理されたRPMI 1640媒体(Gibco 米国BRL社)に浮遊された。溶液は５％炭酸ガスおよび９５％空気の条件の湿潤化された培養器中において３７℃で３日間培養されるとともに、発現解析によって白血球の形成が測定され、200 マイクログラム/ミリリットルのアドリアマイシン処理グループが照合グループとして使用された。

結果として、アドリアマイシン処理グループは免疫性を２６．１％だけ減少し、「例１および２」処理グループは「比較例１および２処理」グループと比較してリンパ球の合成増加率がより高いことが裏付けられた。

「実験例８」：毒性試験

「方法１」

ICRマウス（平均体重25 ± 5グラム）およびSprague- Dawleyラット（235 ±1Oグラム、Jung-Ang Lab Animal Inc）に関する急性毒性試験が「例１」のエキスを使用して実施された。１０匹のマウスあるいはラットからなる４つのグループが250ミリグラム/キログラム、500ミリグラム/キログラム、 lOOOミリグラム/キログラムおよび5000ミリグラム/キログラムの試験試料あるいは溶剤(0.2 ミリリットル、i.p.)がそれぞれ経口で腹腔内を通じて投与されるとともに、２週間観察された。

「方法２」

ICRマウスおよびSprague-Dawleyラットに関して急性毒性試験が「例２」のエキスを使用して実施された。１０匹のマウスあるいはラットからなる４つのグループが25ミリグラム/キログラム、250ミリグラム/キログラム、500ミリグラム/キログラムおよび725ミリグラム/キログラムの試験試料あるいは溶剤(0.2 ミリリットル、i.p.)により腹腔内を通じて投与されるとともに２４時間観察された。

「結果」

いずれのグループあるいは性別間での死亡率、臨床兆候、体重変化および見かけ上の発見に関して非処理に関連した効果は全く無かった。これらの結果は本発明により調製されたエキスは有効かつ安全であることを示唆している。

以降では配合方法および賦形剤の種類が説明されるが本発明はこれらに限定されるわけではない。代表的な調製例は以下の通り説明される。

「粉末の調製」
例１の乾燥粉末：５０ミリグラム
ラクトース：１００ミリグラム
タルク：１０ミリグラム
粉末の調製は上記成分の混合ならびに密閉包装への充填によって調製された。

「錠剤の調製」
例１の乾燥粉末：５０ミリグラム
コーンスターチ：１００ミリグラム
ラクトース：１００ミリグラム
マグネシウムステアリン酸塩：２ミリグラム

錠剤の調製は上記成分の混合と錠剤化によって調製された。

「カプセルの調製」
例１の乾燥粉末：５０ミリグラム
コーンスターチ：１００ミリグラム
ラクトース：１００ミリグラム
マグネシウムステアリン酸塩：２ミリグラム

錠剤調製は上記成分の混合ならびにゼラチンカプセルの従来のゼラチン調製方法による充填によって調製された。

「注射液の調製」
例２の乾燥粉末：５０ミリグラム
注射液用蒸留水：適量
ｐＨ調整剤：適量
注射液の調製は活性成分の溶解、ｐＨ約７．５への調整およびその後のすべての成分の２ミリリットルアンプル中への充填、ならびに従来の注射液調製方法による殺菌によって調製された。

「液体の調製」
例２の乾燥粉末：０．１〜８０グラム
砂糖：５〜１０グラム
クエン酸：０．０５〜０．３％
キャラメル：０．００５〜０．０２％
ビタミンＣ：０．１〜１％
蒸留水：７９〜９４％
炭酸ガス：０．５〜０．８２％

液体の調製は、従来の液体調製方法による活性成分の溶解、全成分の充填および殺菌によって調製された。

このように説明された発明は、同じものが多くの方法において変化し得ることが明らかである。このような変化の範囲は本発明の精神と範囲からの逸脱とは見なされないと同時に、本技術の専門家にとってはすべて自明であるこのような修正は以降の請求項の範囲内に含まれるものと意図される。

本発明で説明されたように、考案方法によって調製された野生チョウセンニンジンの精製エキスはガン細胞付着の抑制、ガン細胞転移の抑制および免疫刺激効果といった有効な抗ガン性を有するので、様々なガン疾病の治療と予防向けの治療薬として利用可能である。

本発明に関する上記およびその他の目的、特徴およびその他の利点は付随する図面と関連が取られる以下の詳細説明によりさらに明瞭に理解されよう。すなわち、

天然成長野生チョウセンニンジンの精製エキスのＨＰＣ分析が示される。天然成長野生チョウセンニンジンの精製エキスのＨＰＣ分析が示される。

Claims

野生チョウセンニンジン材料の抽出溶剤による繰り返し蒸留抽出方法の適用、凍結精製エキス入手用の蒸留エキスの凍結、該エキスの解凍および精製エキス入手用の濾過からなる段階が含まれる野生チョウセンニンジン精製エキスの調製方法
前記抽出溶剤が水、Ｃ−Ｃ低級アルコールあるいはこれらの混合物から選定される請求項１による方法
前記抽出溶剤が水である請求項２による方法
前記野生チョウセンニンジンに栽培チョウセンニンジンおよび天然成長野生チョウセンニンジンが含まれる請求項１による方法
第１段階の野生チョウセンニンジン材料への第１蒸留物入手用の抽出溶剤による第１蒸留抽出方法の適用、第２段階の該第１蒸留物への第２蒸留物入手用の抽出溶剤による第２蒸留物抽出方法の適用、第３段階の該第２蒸留物の凍結精製エキス入手向けの凍結、第４段階の該エキスの解凍および濾過済みエキス入手向けの濾過、第５段階の該濾過物の二重ボイラーによる加熱および再凍結、第６段階の本発明の精製エキス入手向けのエキスの解凍および殺菌からなる段階が含まれる野生チョウセンニンジン精製エキスの調製方法
前記第１段階が水１リットル当たりの材料が1.0キログラムから3.0キログラムまで変動する割合の前記材料への水の注入、１時間から４時間まで変動する時間の間の室温での放置、その後引き続く第１蒸留物入手向けの６時間から２４時間まで変動する時間の間の１００℃未満での蒸留装置による加熱からなる請求項５による方法
前記第２段階が蒸留装置の備わった沸騰片を含むフラスコへの第１蒸留物への付加、第２蒸留物の入手向けた７０％から９０％（容積比）まで変動する濃縮容積の減少量までの７時間から２４時間まで変動する時間の間の１００℃での緩慢な加熱からなる請求項５による方法
前記第３段階が、本発明の凍結精製エキスの入手向けの、非凍結片の体積が全体積の５％未満にまで減少するー５からー１５℃まで変動する温度での第２蒸留物の凍結、非凍結片の除去、残留蒸留物の解凍、これら非凍結片の凍結および除去処理の1回から６回までの繰り返しからなる請求項５による方法
前記第４段階が室温における第3段階の凍結精製エキスの解凍、および濾過物の入手向けの0．1マイクロメーターから０．６マイクロメーターまで変動する大きさの孔を有する濾過紙による濾過からなる請求項５による方法
前記第５段階が冷凍精製エキス入手向けの２０分から４０分まで変動する時間の間の１００℃の二重ボイラーによる加熱および再凍結からなる請求項５による方法
抗ガン性によるガン疾病の治療および予防に有効な量の活性成分として請求項１に規定される方法により調製される野生チョウセンニンジン精製エキスが含まれる薬用合成剤
前記合成剤に粉末、錠剤、カプセル、ソフトカプセル、水薬、シロップ、エリクシールピル、粉末、香袋、顆粒あるいはエーロゾルといった経口服用形態が含まれる請求項１１による薬用合成剤
前記合成剤にクリーム、軟膏、ローション、ゲル、香油、膏薬、ペースト、吹き付け溶液、エーロゾルといった局部調製および鍼注射可能な調製といった注射可能な調製が含まれる請求項１１による薬用合成剤
前記合成剤が経口で、直腸経由であるいは静脈内、筋肉内、皮下、皮膚内、髄膜下、硬膜外あるいは大脳室内の注射あるいは鍼に適当な場所の鍼注射によって局所経由で投与される請求項１３による薬用合成剤
前記合成剤が鍼に適切な場所の鍼注射により投与される請求項１４による薬用合成剤
ヒトあるいはほ乳類における抗ガン性によるガン疾病の治療および防止用治療剤の調製向けの請求項１に規定される方法により調製される野生チョウセンニンジン精製エキスの利用
請求項１に規定される方法によって前記ほ乳類あるいはヒトにその薬用上受入れられる媒体と一緒に調製される野生チョウセンニンジン精製抽出エキスの有効量の投与が含まれるほ乳類あるいはヒトにおける抗ガン性によるガン疾病の治療および予防方法