KR0144130B1

KR0144130B1 - 면역증강 효과가 있는 인삼다당체("진산")

Info

Publication number: KR0144130B1
Application number: KR1019930028166A
Authority: KR
Inventors: 윤연숙; 이윤실; 정인성
Original assignee: 신재인; 한국원자력연구소
Priority date: 1993-12-17
Filing date: 1993-12-17
Publication date: 1998-07-15

Abstract

본 발명은 면역증강 효과를 나타내는 인삼 단백다당체(진산)에 관한 것이다.

본 발명의 진산은 기본적으로 글루코스 및 갈락토스로 구성된 6탄당 40.0 내지 50.0%, 산성당인 갈락투론산 41.0 내지 44.8% 및 리진, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 트레오닌, 세린, 글루탐산, 프롤린, 글리신, 알라닌, 발린, 메티오닌, 이소로이신, 로이신, 티로신, 시스테인 및 페닐알라닌으로 구성된 단백질 3.7 내지 5.2%를 함유하며, 분자량이 50,000 내지 150,000인 물질로서, 면역증강 효과를 나타냄으로써 암예반제 및 방사선 방어제로서 사용될 수 있다.

Description

면역증강 효과를 나타내는 인삼 단백다당체(진산)

제1도는 겔 여과에 의한 진산의 분리를 설명하는 도면.

제2도는 진산의 분자량 측정 크로마토그램.

제3도는 진산의 당 함량 측정 크로마토그램.

제4도는 진산의 산성당 함량 측정 크로마토그램.

제5도는 진산의 단백질 함량 측정 크로마토그램.

제6도는 진산의 당류 분석 크로마토그램.

제7도는 진산의 아미노산 분석 크로마토그램.

제8도는 진산의 나타내는 방사선 방어효과를 설명하는 도면.

본 발명은 면역증강 효과를 나타내는 인삼 단백다당체에 관한 것이다. 구체적으로 말하면, 본 발명은 인삼으로부터 분리된 면역증강 효과를 나타내는 단백다당체에 관한 것으로, 본 발명에 의해 제공되는 단백다당체는 기본적으로 글루코스 및 갈락토스로 구성된 6탄당 40.0 내지 50.0%, 산성당인 갈락투론산 41.0 내지 44.8% 및 리진, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 트레오닌, 세린, 글루탐산, 프롤린, 글리신, 알라닌, 발린, 메티오닌, 이소로이신, 로이신, 티로신, 시스테인 및 페닐알라닌으로 구성된 단백질 3.7 내지 5.2%를 함유하며, 분자량이 50,000 내지 150,000인 물질 이하, 이를 진산(ginsan)이라 칭한다로서 면역증강 효과를 나타낸다.

본 발명자들이 인삼으로부터 진산을 분리, 정제하는데 성공하기 이전까지 알려져 있던 인삼에서 분리된 다당체로는, 혈당강하 작용이 있는 D-글루코스로 구성된 글리칸의 일종인 파낙산(panaxan; 참조: Konno C, Sugiyama K, Kano M, Takahashi M and Hikino H, Isolation and hypoglycemic activity of panaxans A.B.C.D. and E glycans of panax ginseng roots, Planta Medica 50:434-436, 1984.) 및 여러가지의 단당류(갈락투론산, 글루코스, 아라비노스, 만노스 및 갈락토스 등으로 구성되어 있으며, 특히 갈락투론산의 함량이 높다)의 혼합물인 항보체 작용이 있는 인삼 다당체 (참조: Gao Q, Kiyohara H, Cyong J and Yamada H.Chemical properties and anticomplementary activities of polysaccharide fractions from roots and leaves of Panax ginseng, Planta Medica 55: 9-12, 1989.)가 있으나, 이들은 모두 인삼으로부터의 분리방법이나 다당체를 구성하는 구성성분의 종류 및 중량비에 있어서 본 발명에 의해 제공되는 진산과 상이할 뿐 아니라, 효과면에 있어서도 이들이 면역증강 효과를 나타낸다고는 보고된 바 없다.

일반적으로, 인삼으로부터 분리된 물질중 약리작용을 나타내는 것은 대부분 사포닌계 물질로서 본 발명의 진산과는 구조상 상이하며, 암세포를 직접 살해함으로써 항암작용을 나타내는 것으로 알려진 폴리아세틸렌계 물질 또한 면역증강제로서 사용될 수 있는 본 발명의 단백다당체 진산과는 구조상 전혀 다르다.

이 외에도, 본 발명의 진산과 같이 T-임파구 및 B-임파구에 대한 미토겐(mitogen)으로서 면역증강 효과를 갖는 물질이 인삼으로부터 분리되었다는 보고는 없다.

기타, 면역증강제로서 항암작용 또는 항방사선 작용이 있는 물질로는, BCG(독성을 약화시킨 소의 결핵균), BCG에서 부작용을 약화시킨 BCG-CWS, OK-432(Streptococcus pyrogenes Su주에 페니실린 G를 첨가하고 열처리하여 얻은 분말), 레바미솔(Levamisole; 이미다졸계 화합물), 레티난(Lentinan; 표고버섯으로 부터 추출한 고분자 다당체), 쉬조필란(Schizofilan; 치마버섯으로부터 추출한 다당체), 베스타틴(Bestatin; Streptomyces olivoreticuli의 배양에 의해 얻은 디펩티드), 크레스틴(Krestin; 구름버섯으로 부터 추출한 당단백질) 및 글루칸(이스트의 세포벽으로 부터 분리됨)이 있다. 이들 중, 크레스틴, 레틴난, 쉬조필란 및 글루칸은 다당체 구조이나, 이 4종류의 물질을 포함하여 면역증강제로서 언급된 상기 물질들은 모두 미생물로 부터 얻어진 것으로, 본 발명에 의해 제공되는 인삼 단백다당체 진산과는 전혀 상이한 구조의 물질들이다.

또한, 이제까지 식물로부터 수득한 다당체로서 면역증강 효과를 갖는 물질은 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 암예방제 또는 방사선 방어제로서 사용될 수 있는 면역증강 효과가 있는 물질을 인삼으로부터 찾아낼 목적으로, 인삼 뿌리 분말로부터 단백다당체의 분리를 시도한 결과, 마침내 면역증강 효과가 있는 단백다당체를 인삼으로부터 분리, 정제해내는데 성공하였으며, 분리된 단백다당체를 인삼 단백다당체 진산이라고 명명하였다.

상기 언급된 분리과정에 의해 수득된 인삼 단백다당체 진산은, 분자량이 50,000 내지 150,000인 고분자 물질로서, 기본적으로 글루코스 및 갈락토스로 구성된 6탄당 40.0 내지 50.0%, 산성당인 갈락투론산 41.0 내지 44.8% 및 리진, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 트레오닌, 세린, 글루탐산, 프롤린, 글리신, 알라닌, 발린, 메티오닌, 이소로이신, 로이신, 티로신, 시스테인 및 페닐알라닌으로 구성된 단백질 3.7 내지 5.2%를 함유한다.

본 발명의 인삼으로부터 분리된 단백다당체 진산은, 다음에 상세히 기술하게 되는 시험예를 통해 알 수 있는 바와 같이, 면역증강효과를 나타냄으로써 암예방제 또는 방사선 방어제로서 사용될 수 있다.

본 발명에서 인삼으로부터 단백다당체 진산을 분리, 정제하는 과정을 간략히 다음과 같이 나타낼 수 있다:

[실시예]

1. 인삼 단백다당체 진산의 분리

본 발명자들은 인삼으로부터 진산을 분리, 정제하기 위하여 6년근 백삼(Panax ginseng C.A. Meyer)3Kg을 8배량의 물로 8시간씩 3회 추출하여 물 가용성 추출물을 얻어 동결건조시킨 후, 이를 메탄올에 용해시켜 메탄올 가용물과 비가용물로 분리하였다. 메탄올 가용물의 경우 마우스 정상 임파구에 대해 세포독성을 나타내었으므로 본 실험에 사용할 수 없어 제외시켰다. 메탄올 비가용물(수율:10.1%)을 다시 증류수에 용해시키고, 여기에 3배량의 에탄올을 가하여 에탄올 가용물(수율:4.1%)과에탄올 비가용물(수율:6.4%)로 분리한 후, 에탄올 비가용물을 셀룰로스 투석막을 사용하여 증류수로 투석시켰다. 투석은 4℃에서 12시간마다 증류수를 교환하여 1주일간 시행하였고, 투석막 안쪽의 것을 모아 동결건조하였으며 (수율:3.5%), 동결건조된 생성물에 대하여 세파크릴 S200 컬럼 크로마토그래피를 실시 하였다. 컬럼은 (2.5x90㎝)에 충진제를 채운 후, 용출물이 분당 1㎖씩 나오도록 유속을 조절하여 각각 10㎖ 씩 100개의 용출물을 모았다.

각각의 용출물에 대하여 안트론-황산 반응(Anthrone-sulfuric acid reaction), 로우리 반응(Lowry reaction) 및 카바졸 반응(Carbazole reaction)을 실시하여 Fr.1, -2, -3, -4, -5 및 -6의 분획을 얻었다(제1도 참조). 6탄당 분석법인 안트론-황산 반응에 의해 6개의 분획을 각각 분리하였으며, 각각의 수율은 Fr.-1가 0.309%, Fr-2가 2.188%, Fr-3가 0.088%, Fr.-4가 0.236%, Fr.-5가 0.184% 및 Fr-6가 0.332%로 Fr.-2의 수율이 가장 높았다. 카바졸 시험에 의한 산성당 함량에 따른 분획들의 분리는 6탄당 분석법과 비슷한 결과를 나타내었지만 산성당 함량에 따른 분획의 분리가 좀 더 세분화 되는 듯하였다. 로우리 시험에 의한 단백질 함량은 거의 모든 분획에서 검출되지 않았지만 용출 부피가 410㎖일 때 OD 값이 0.2 이하인 딘백질 약간이 검출되었다. Fr.-2분획을 모아 진산으로 명명하고 그에 대한 화학적인 분석을 실시하였다.

2. 인삼 단백다당체 진산의 화학적 분석

1) 진산의 분자량 측정:

인삼으로부터 분리된 진산의 분자량을 측정하기 위하여 겔 여과 분자량 표지(gel filtration molecular weight marker)를 이용하였다. 즉, 분자량이 알려진 알부민 (분자량=66,000), 알콜 데하이드로게나제 (분자량=150,000), β-아밀라제 (분자량=200,000), 탄산탈수효소 (분자량=29,000), 시토크롬 C (분자량=12,400) 및 덱스트란 (분자량=2,000,000)을 함유하는 겔 여과 분자량 표지를 사용하였다.

세파크릴 S200 컬럼 크로마토그래피에 덱스트란을 통과시켜 공 부피 (이하, Vo라함)을 구하고, 각각의 표준물질(덱스트란을 제외한 겔 여과 분자량 표지에 포함되어 있는 5종류의 물질들)을 통과시켜 용출 부피(이하, Ve라함)을 구한후, 분자량대 Ve/Vo에 의한 검량 곡선을 작성하였다. 진산의 Ve를 측정하여 검량곡선으로 부터 Fr.-2분획에 해당되는 Ve/Vo를 계산하여 진산의 분자량을 구하였다(제2도참조).

진산은 50,000내지 150,000사이의 분자량을 갖는 고분자 물질인 것으로 측정되었다.

2) 진산중의 당함량 (6탄당) 측정:

인삼으로부터 분리된 진산의 당(6탄당)함량은 안트론-황산법으로 측정하였다. 즉 500㎍/㎖의 농도로 진산을 증류수에 용해시킨 용액 0.5㎖에 차가운 0.2%의 안트론-황산 시약을 3㎖씩 얼음 수욕상에서 가하고 진탕한 후, 다시 10분간 끓는 물에서 반응시켜 620nm에서 진산의 흡광도를 측정하였다. 이때, 표준품으로는 글루코스(증류수에 글루코스를 500㎍/㎖, 100㎍/㎖ 및 20㎍/㎖의 농도로 용해시킨 용액)를 사용하여 표준 용량곡선을 작성하였다.

제3도로부터 알 수 있는 바와 같이, 글루코스 용량곡선으로부터 계산된 진산의 당(6탄당) 함량은 40.0 내지 50.0%였다(제3도 참조).

3) 진산중의 산성당 함량 측정:

인삼으로부터 분리된 진산의 산성당 함량은 우론산(uronic acid) 함량을 측정하는 카바졸법으로 측정하였다. 즉, 진산 1㎖와 붕산나트륨-농 항산시약 (붕산나트륨 0.95g+ 농 황산 100㎖) 5㎖를 얼음 수욕상에서 처음에는 천천히 나중에는 세게 진탕한후, 끓는 물에서 10분간 반응시켰다. 실온에서 냉각시킨후, 냉각된 반응물에 카바졸/에탄올 시약 (카바졸 12.5㎎+ 무수에탄올 10㎖) 0.2㎖를 가하고 진탕한후 다시 끓는 물에서 반응물을 15분간 가열하였다. 냉각시킨 후, 530nm에서 진산의 흡광도를 측정하였다. 이때, 표준품으로는 갈락투론산(증류수에 갈락투론산을 200㎍/㎖, 40㎍/㎖ 및 8㎍/㎖의 농도로 용해시킨 용액)을 사용하여 표준 용량곡선을 작성하였다.

제4도로부터 알 수 있는 바와 같이, 갈락투론산 용량곡선으로부터 계산된 진산의 산성당(갈락투론산) 함량은 41.0 내지 44.8%였다(제4도 참조).

4) 진산의 단백질 함량 측정:

인삼으로부터 분리된 진산의 단백질 함량은 로우리법으로 측정하였다. 즉 증류수에 진산을 500㎍/㎖의 농도로 용해시킨 용액 1.2㎖에 알칼리성 구리용액 (1% 황산구리 1㎖+2%타르타르산나트륨 1㎖+ 0.1N 수산화나트륨에 포화시킨 2%탄산나트륨 98㎖) 6㎖를 넣고 실온에서 10분간 반응시킨 후 폴린 씨오카투 시약(Folin ciocalteu's reagent) 0.3㎖를 가하여 혼합물을 잘 섞은후, 다시 실온에서 30분간 반응시킨 다음, 500nm에서 진산의 흡광도를 측정하였다. 이대, 표준품으로는 소의 혈청 알루민(증류수에 소의 혈청 알루민을 200㎍/㎖, 40㎍/㎖ 및 8㎍/㎖의 농도로 용해시킨 용액)을 사용하여 표준 용량곡선을 작성하였다.

제5도로부터 알 수 있는 바와 같이, 소의 혈청 알부민 용량곡선으로부터 계산된 진산의 단백질 함량은 3.7 내지 5.2%였다(제5도 참조).

5) 박막 크로마토그래피 및 가스 크로마토그래피에 의한 진산중에 함유된 구성 당 분석:

진산 100㎎에 2N-황산 10㎖를 넣고 100℃에서 6시간동안 반응시켰다. 반응액을 n-부탄올:피리딘:물 (6:4:3)의 혼합용매를 사용하여 셀룰로스 플레이트에 전개시킨 후 p-아니시딘 염산 시약을 분무하여 반점을 확인하였다. Rf값이 0.30 및 0.12인 지점에서 글루코스 반점 및 갈락투론산 반점을 각각 확인하였다. 반응액은 황산바륨을 사용하여 반응액으로부터 황산이온(SO4^-2)을 침전, 제거한 후, 농축하여 그로부터 수분을 제거하고 헥사메틸디실라잔:트리메틸클로실란:피리딘(1:1:10)의 혼합물을 가하여 실온에서 8시간 반응시킨후 반응물에 대해 에탄올:에틸아세테이트:헥산(2:2:0.5)의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 박막 크로마토그래피를 실시하여 Rf값이 0.43인 지점에서 O-메틸실릴화된 글루코스 반점을 확인하였다.

또한, 이 반응물에 대해 가스 크로마토그래피를 실시하였는데, 사용한 컬럼은 DB1701 (80-100 메쉬)이며, 140℃ 내지 280℃(20min)로 분당 20℃씩 온도를 올리면서 질소 가스 (50㎖/min_하에서 가스 크로마토그래피를 수행하였고, 표준품으로는 글루코스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 크실로스, 갈락투론산 및 글루쿠론산을 사용하였다. 지체 시간(retention time) 9.51 및 8.91에서 글루코스 및 갈락토스를 각각 확인하였다.

따라서, 이상 기술한 박막 크로마토그래피 및 가스 크로마토그래피를 수행한 결과, 진산은 글루코스, 갈락토스 및 갈락투론산을 구성원소로 하는 일종의 다당체임을 알 수 있었다(제6도 참조).

6) 아미노산 분석기에 의한 진산중의 구성 아미노산 분석:

진산 10㎎을 2㎖의 6N-염산에 넣고 100℃에서 24시간동안 반응시켰다. 반응액을 n-부탄올:아세틸알콜:물(12:3:5)의 혼합 용매를 사용하여 셀룰로스 플레이트에 전개시킨 후, 닌하이드린 시약을 분무하여 반점을 확인하였다. 다시 반응액을 2.5N 수산화나타륨으로 중화시켜 여과한 여액에 대해 아미노산 분석기를 사용하여 구성 아미노산을 분석하였다. 제7도로 부터 알 수 있는 바와 같이, 진산중에는 리진, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 트레오닌, 세린, 글루탐산, 프롤린, 글리신, 알라닌, 발린, 메티오닌, 이소로이신, 로이신, 티로신, 시스테인 및 페닐알라닌이 함유되어 있었다(제7조 참조).

아미노산 분석기의 기계적 조건 및 아미노산 분석에 사용한 완충액의 조성은 다음과 같다.

*BRJJ-35 25g/물 100ml (50℃로 가열)

[시험예]

이상 기술한 실시예로부터 수득한 인삼 단백다당체 진산의 활성시험을 수행한 결과, 진산이 탁월한 면역증강제로서 암세포에 대한 살해작용 이외에 암예방제 또는 방사선 방어제로 사용될 수 있음을 발견하였다. 이를 다음의 구체적인 시험 실시예를 통해 설명하고자 한다.

1. 비장세포의 증식 및 암세포 살해능 유도 시험

N:GP(S) 마우스의 비장세포(1.0x10⁶세포/㎖ 세포/㎖)를 0.1㎎/㎖, 0.05㎎/㎖, 0.01㎎/㎖의 진산이 포함된 배지를 함유하는 96웰(well)배양 용기에서 48시간 배양한 후³H-티미딘을 2μci/웰씩 배양용기에 첨가하여 4시간동안 표지한 후, 비장세포를 수확하여 세포내에 표지된³H의 베타선 양을 측정하여 비장세포의 성장을 관찰하였다. 진산이 함유되지 않은 배지에서 비장세포만을 배양한 경우의³H베타선 양은 8213 cpm이었으나 진산이 함유된 배지에서 비장세포를 배양한 경우의³H 베타선 양은 158,924cpm(진산 0.1㎎/㎖), 147942cpm(진산 0.05㎎/㎖), 92,376(진산 0.01㎎/㎖으로서 진산 처리에 의해 마우스의 비장세포가 크게 증식함을 알 수 있었다(표 4참조).

또한, 마우스 비장세포(1.5x10⁷세포/㎖)를 0.1㎎/㎖, 0.05㎎/㎖, 0.01㎎/㎖의 진산이 포함된 배지를 함유하는 24웰 배양 용기에서 5일간 배양한 후 자연살해세포에 의해 살해되는 YAC-1 암세포 및 자연살해 세포에 의해 살해되지 않는 P815, EL-4, HFL/b 암세포에 대한 살해능 (임파구:암세포=100:1)을 측정 (⁵¹Cr-유리법)한 결과, 진산이 함유되지 않은 배지에서 비장세포를 배양한 경우 YAC-1, P815, EL-4, HFL/b 암세포를 각각 12.6%, 8.4%, 3.4%, 5.4% 살해였으나, 진산이 각각 0.1㎎/㎖, 0.05㎎/㎖, 0.01㎎/㎖씩 함유된 배지에서 마우스 비장세포를 배양한 경우에는 YAC-1 암세포에 대해서는 각각의 진산 농도에서 52.3%, 51.5%, 38.9%, P815 암세포에 대해서는 각각의 진산 농도에서 47.5%, 47.3%, 33.4%, EL-4 암세포에 대해서는 각각의 진산 농도에소 39.1%, 40.1%, 32.2%, HFL/b 암세포에 대해서는 각각의 진산 농도에서 43.4%, 45.1%, 36.7% 살해하였다(표 5참조).

10회 이상 실험하여 비슷한 실험결과를 얻었으며, 매 실험마다 3중으로 실시하였다.

2. 자연실해세포 및 T 임파구의 암세포 살해능 증강작용

비장세포에는 Thyl⁺T임파구 및 AsGM1⁺인 자연살해세포가 함유되어 있으므로 이중 어느 세포가 진산에 의해 활성화되어 암세포를 살해하였는지 알기 위하여, N:GP(S) 마우스의 비장세포에 항-Thyl.2^-, 항-CD4^-, 항-CD8^-또는 항-AsGM1^-항체 및 보체를 처리하여 Thyl⁺T세포가 제거된 Thyl^-세포, CD4⁺T-헬퍼세포가 제거된 CD4^-세포, CD8⁺T 살해/억제 (cytotoxic/suppressor) 세포가 제거된 CD8^-세포, AsGM1⁺자연살해세포가 제거된 AsGM1^-세포를 만들고 이들 각각의 세포(1.5x10⁷세포/㎖)를 진산(0.05㎎/㎖)이 함유된 배지에서 5일간 배양한 후, 각각의 비장세포의 암세포 살해능(⁵¹Cr^-유리법) 및 배양액중의 IL-2양(CTLL 세포증식법)을 측정하였다. 표 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, Thyl⁺T세포가 제거된 비장세포, CD4⁺T-헬퍼세포가 제거된 비장세포, CD8^+-T 살해세포가 제거된 비장세포, AsGM1⁺인 자연살해세포가 제거된 비장세포에서는 암세포 살해능이 나타나지 않았으며, Thyl⁺T세포가 제거된 비장세포, CD4⁺T^-헬퍼세포가 제거된 비장세포에서는 IL-2가 검출되지 않았다.

따라서, Thyl⁺T세포 또는 CD4⁺T-헬퍼세포가 진산에 의해 활성화되어 IL-2를 분비시키고 분비된 IL-2가 AsGM1⁺인 자연살해세포 및 CD8⁺-T 살해세포를 활성화시켜 암세포를 살해하는 것으로 나타났다(표 6참조).

10회 이상 실험하여 비슷환 실험결과를 얻었으며, 매 실험마다 3중으로 실시하였다.

3. 거식세포의 암세포 살해능 유도 및 질소산화물 생성 시험

거식세포의 경우 자연상태로는 암세포를 살해하지 못하나 면역증강제에 의해 활성화 될경우 암세포를 살해하는 것으로 알려져 있기 때문에, N:GP(S) 마우스의 복강내에 10% 티오글리콜레이트 1㎖를 주입화고 3내지 5일후 복강내 거식세포를 취하여 8x10 6/웰로 조절한 후 96웰 배양용기에 0.1㎖/웰 씩 넣어 3시간 동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하고 부유세포를 제거한 후 배양용기에 부착된 거식 세포에 진산을 가하여 3일동안 배양하여 거식세포의 L929 암세포에 대한 살해능을 측정하였다. 진산이 함유되지 않은 배지에서 거식세포를 배양한 경우 거식세포가 L929 암세포를 5% 살해하였으나, 진산이 각각 0.1㎎/㎖, 0.05㎎/㎖, 0.01㎎/㎖의 농도로 함유된 배지에서 거식세포를 배양한 경우에는 각각의 진산 농도에서 41.3%, 42.8% 및 24.6%의 암세포 살해능을 보였다.

또한, 거식세포가 활성화될 경우 질소 산화물이 생성되는 것으로 알려져 있으므로, 각각의 진산 농도에서 24시간 배양된 거식세포의 배양 상층액중의 질소산화물(NO₂ ^-)의 양을 측정하였다. 진산이 함유되지 않은 배지에서 거식세포를 배양한 경우에는 3.7μM의 질소산화물이 생성된 반면, 각각의 농도의 진산이 함유된 배지에서 거식세포를 배양한 경우에는 13.5μM(진산 0.1㎎/㎖), 13.7μM(진산 0.05㎎/㎖), 6.5μM(진산 0.1㎎/㎖)의 질소산화물이 생성된 것으로 보아 거식세포가 진산에 의해 활성화 됨을 알 수 있었다(표 7참조).

4. 진산에 의한 사이토킨의 생성

1.5x10⁷세포/㎖의 N:GP(S) 마우스 비장세포를 여러가지 농도의 진산이 함유된 24웰 배양용기에 취하여 3일동안 배양한 후 배양상층액중의 IL-2(CTLL세포의 증식정도), INFγ(Vesicular Stomatitis Virus의 L929 암세포에 대한 살해 억제능), IL-1 (Thymocyte 증식정도) 및 TNF(L929 암세포 살해능)를 측정한 결과, 0.01㎎/㎖, 0.05㎎/㎖, 0.1㎎/㎖ 농도의 진산을 첨가하였을 때 각각의 진산 농도에서 IL-2는 0.45u/㎖, 0.69u/㎖, 0.68u/㎖이 생성되었으며, INFγ는 1.2u/㎖, 4.8u/㎖, 3.5u/㎖이 생성되었고, IL-1은 0.79u/㎖, 1.89u/㎖, 2.29u/㎖이 생성되었으며, TNF는 0.24u/㎖, 0.41u/㎖, 0.53u/㎖이 생성되어 IL-2, INFγ, IL-1 및 TNF가 진산의 농도에 의존적으로 생성 됨을 알 수 있었다.(표 8참조)

5. B16 흑생종 암세포, L1210 백혈병암세포 및 사르코마(Sarcoma) 180 복수암세포에 대한 항암실험

이상과 같이 실험관내에서 면역증강작용을 나타내는 진산의 생체내에서의 항암 작용을 관찰하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.

1) B16 흑색종 암세포에 대한 항암실험:

각 군당 50마리의 웅성 C57BL/6 마우스에 B16 흑색종 암세포 1x10⁵세포를 꼬리정맥 주사하고, 주사한 다음날부터 체중 1㎏당 100㎎, 200㎎의 진산을 1주에 3회씩 6회 복강내 주사하였다. B16 흑색종 암세포를 주사한 후 14일째에 마우스를 부검하여 폐에 생성된 B16 흑색종 암세포 집단수를 관찰한 결과, 진산을 주사하지 않은 군에 비하여 진산을 주사한 군에서 B16 흑색종 암세포 집단수가 5.5%(진산 100㎎/㎏), 35.2%(진산 200㎎/㎏)(P0.05) 감소되었다(표 9 참조).

*P0.05로 통계학적으로 유의성이 있음.

2) L1210 백혈병 암세포에 대한 항암실험:

8내지 9주령의 BDF1(C57BL/6xDBA/2( 마우스를 군당 20마리씩 분할하여, L1210 세포를 마우스당 1x10⁵개씩 복강내 주사하고 주사한 다음 날부터 5㎎/㎏의 5-플루오로우라실(5-FU), 100㎎/㎏의 진산 또는 5-FU(5㎎/㎏)와 진산(100㎎/㎏)을 함께 1일 1회로 하여 총 5회 복강내 주사하였다. L1210 세포를 투여한 날부터 마우스의 생존일 수를 측정하였다. 그 결과, L1210 세포를 단독으로 주사한 경우 마우스의 생존일수가 15일인데 반해, 5-플루오로우라실을 투여한 경우에는 생존일수가 18.9일로 26% 증가하였고, 5-플루오로우라실과 진산을 함께 투여한 경우에는 생존일수가 22.3일로 49% 증가하였다. (표 10 참조).

3) 사르코마 180 복수암세포에 대한 항암실험:

8내지 9주령의 웅성 N:GP(S) 마우스를 군당 20마리씩 분할하여, 사르코마 180 세포를 마우스당 1 x10 6개씩 왼쪽 뒷다리에 피하주사하고 주사한 다음날 부터 100㎎/㎏의 진산을 1일 1회로 하여 5회 복강내 주사하였다. 양성대조군에는 5㎎/㎏의 피시바닐(Picivanil^R: OK 432)을 복강내 주사하였다. 사르코마 180 세포를 주사한 후 3주째에 종양부위를 절개한 후 종양의 무게를 측정하였다. 그 결과, 사르코마 180 세포를 단독으로 주사한 경우 7.9g의 종양이 발생하였으나, 피시바닐을 투여한 경우 및 진산을 투여한 경우에는 똑같이 4.1g의 종양이 발생되어 48.1%의 종양억제 효과를 나타내었다(표 11참조).

*P0.05로 통계학적으로 유의성 있음.

6. 자기 암세포에 대한 항암실험(암예방 효과):

각각의 군을 50마리로 하여, 생후 24시간이내의 N:GP(S) 마우스에 화학적 발암물질인 벤조피렌을 0.5㎎씩 견갑부에 피하주사하고 생후 3주부터 이유하여 자성 마우스만을 실험에 사용하였다. 이유한 직후부터 진산을 식수 1㎖당 0.5㎎, 1㎎ 및 2㎎의 농도로 용해한 용액을 마우스에 투여하고, 벤조피렌을 주사한 후 9주째에 마우스를 부검하여 폐를 적출하였다. 적출된 폐를 텔리에스니츠키(Tellyesniczky) 용액에 고정시켜 폐선종수를 육안으로 관찰하였다. 각각의 진산 농도에서 폐선종 발생율이 45%, 64%(P0.05), 64%(P0.05) 감소되었다(표 12참조).

*P0.05로 통계학적으로 유의성 있음.

7. 방사선 방어효과 시험

방사선 피폭후 30일 이내에 사망하는 원인은 주로 조혈기관의 장해에 기인하므로 임파구를 증식시키는 것으로 보여지는 진산이 피폭후 생존일을 연장시킬 수 있는지의 여부를 관찰하기 위하여, 1000 rad의⁶⁰Co γ선이 피폭된 N:GP(S) 마우스에 피폭 1시간 전에 체중 ㎏당 30㎎, 100㎎, 300㎎의 진산을 1회 복강내 주사한 결고, 진산을 투여하지 않은 대조군의 경우 피폭후 20일 이내에 100%가 사망하였으나 진산을 투여한 군에서는 30일이내에 각각의 진산 농도에서 80%, 60% 및 40%만이 사망하였다(제8도 참조).

진산의 급성독성을 알아보기 위하여, 5마리를 1군으로 하여 N:GP(S) 웅성 마우스에 진산을 5g/㎏, 1g/㎏, 200㎎/㎏ 및 40㎎/㎏의 용량으로 복강내 주사하고, 주사한 다음 날 부터 죽은 마우스의 수 및 육안으로의 이상여부를 1주일간 관찰하였으며, 그 결과는 다음과 같다(표 13참조).

리취필드-윌콕슨(Lichfield-Wilcoxon)법에 의해 LD₅₀값을 계산한 결과, 측정된 LD₅₀값은 1g/㎏이었다.

본 발명에 따르는 인삼 다당체 진산은, 이상 기술한 시험예에 의해 입증되는 바와 같이, 마우스에 대해 면역증강 효과, 구체적으로 암세포를 살해하는 효과 이외에 암예방 효과 및 방사선 방어효과를 나타내므로, 본 발명의 진산은 암예방제 또는 방사선 방어제로서 유용한 것으로 생각된다.

본 발명의 인삼 단백다당체 진산이 암예방제 또는 방사선 방어제로서 사용되는 경우, 활성성분으로서 본 발명의 진산은, 진산 단독으로, 또는 약제학에서 통상적으로 사용되는 담체를 사용하여 각종의 용량 형태, 예를 들어, 정제, 산제, 과립제, 캅셀제, 환제, 액제, 주사제 등의 형태로서, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다.

본 발명의 인삼 단백다당체 진산의 임상학적 용량은 환장의 상태, 체중, 나이, 성별 등을 고려하여 적절히 결정하되, 일반적으로 100 내지 1,000㎎/일/60㎏(체중)의 용량으로 사용될 수 있다.

Claims

활성성분으로서, 인삼을 물로 추출하여 물-가용물을 얻은 후, 이를 메탄올에 용해시켜 메탄올-비가용물을 취하고, 여기에 다시 에탄올을 가하여 에탄올-가용물과 에탄올-비가용물로 분리한 후, 에탄올-비가용물을 셀룰로스 투석막을 사용하여 투석시켜 투석막 내부분획을 취하고, 수득된 내부분획에 대해 세파크릴 S200 컬럼 크로마토그래피시켜 제조된, 기본적으로 글루코스 및 갈락토스로 구성된 6탄당 40.0 내지 50.0중량%; 산성당인 갈락투론산 41.0 내지 44.8중량%; 및 리진, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 트레오닌, 세린, 글루탐산, 프롤린, 글리신, 알라닌, 발린, 메티오닌, 이소로이신, 로이신, 티로신, 시스테인 및 페닐알라닌으로 구성된 단백질 3.7 내지 5.2중량%를 포함하고 분자량이 50,000 내지 150,000인 인삼 단백다당체(진산)를 포함하는 방사선 방어제.
활성성분으로서, 인삼을 물로 추출하여 물-가용물을 얻은 후, 이를 메탄올에 용해시켜 메탄올-비가용물을 취하고, 여기에 다시 에탄올을 가하여 에탄올-가용물과 에탄올-비가용물로 분리한 후, 에탄올-비가용물을 셀룰로스 투석막을 사용하여 투석시켜 투석막 내부분획을 취하고, 수득된 내부분획에 대해 세파크릴 S200 컬럼 크로마토그래피시켜 제조된, 기본적으로 글루코스 및 갈락토스로 구성된 6탄당 40.0 내지 50.0중량%; 산성당인 갈락투론산 41.0 내지 44.8중량%; 및 리진, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 트레오닌, 세린, 글루탐산, 프롤린, 글리신, 알라닌, 발린, 메티오닌, 이소로이신, 로이신, 티로신, 시스테인 및 페닐알라닌으로 구성된 단백질 3.7 내지 5.2중량%를 포함하고 분자량이 50,000 내지 150,000인 인삼 단백다당체(진산)를 포함하는 암예방제.