KR101305000B1 - 에탄올을 이용하여 인삼으로부터 식용 가능한 조 진토닌의 제조방법 - Google Patents
에탄올을 이용하여 인삼으로부터 식용 가능한 조 진토닌의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인삼으로부터 진토닌을 분리하는데 있어서 에탄올과 이온교환수지법을 이용하여 식용이 가능한 진토닌을 비교적 간단하게 높은 수율로 대량 분리하는 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 종래 인체에 유해한 유기용매를 사용하여 식용이 불가능했던 문제점을 해결하고, 시간과 비용을 절감할 수 있어 가격 경쟁력이 있을 뿐만 아니라 인삼의 뿌리(root)는 물론 인삼 수확 후 버려지는 인삼의 줄기(steam)나 잎(leaf)에서도 진토닌을 분리할 수 있어서 폐자원을 활용할 수 있다.
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Description
본 발명은 에탄올을 이용하여 인삼으로부터 식용 가능한 조 진토닌(crude gintonin)의 제조방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 인삼으로부터 진토닌을 분리하는데 있어서 에탄올과 이온교환수지법을 이용함으로써 식용이 가능한 진토닌을 제조하는 방법에 관한 것이다.
인삼은 일반적으로 강장제(adaptogen) 또는 생명연장을 위한 강장제로서 이용되고 있으며, 스트레스, 피로, 질병, 암, 당뇨병에 대항하여 생체기능을 향상시킨다. 이러한 인삼은 한국뿐만 아니라 중국과 일본에서도 몇 백년 동안 사용해 왔으며, 지금도 세계에서 소비되는 약초로 가장 유명한 것 중 하나이다(Tyler, J. Pharm. Technol. 11, 214-220, 1995).
진세노사이드(Ginsenoside)는 1960년대 초반에 분리되어 특성화되었기 때문에 인삼의 생리학적, 약리학적 연구에서 대표적인 성분으로 많이 이용되었다(Shibata, et al. Tetraheadron Letters 1962, 1239-1245, 1963; Wagner-Jauregg and Roth, Pharm Acta Helv 37, 352-357, 1962). 이외에도 최근 연구에서는 인삼에 다당류(polysaccharides), 폴리아세틸렌류(polyacetylenes), 단백질(proteins) 등 알려지지 않은 다른 성분들이 함유되어 있는 것이 밝혀졌다(Nah, Kor. J. Ginseng Sci. 21, 1-12, 1997).
인삼의 진세노사이드 성분은 양이 적고, 분리과정이 복잡하며, 순수한 진세노사이드의 경우에는 비싸기 때문에 인삼의 뿌리에서 메탄올 및 부탄올 추출방법으로 얻어낸 조총사포닌 분획(crude ginseng total saponin fraction, CGSF)을 사용해 왔다(Kanzaki, et al . Br J Pharmacol. 125(2), 255-262, 1998; Choi, et al. Br J. Pharmacol. 132, 641-648, 2001; Choi, et al., J. Biol. Chem. 276, 48797-48802, 2001; Choi, et al. Eur J Pharmacol 468, 83-92, 2003; Lee, et al, J Biol Chem. 279, 9912-9921, 2004; Jeong, et al, Br J Pharmacol. 142, 585-593, 2004; Reay, et al, J Psychopharmacol. 19, 357-365, 2005; Lee, et al, Arch Pharm Res 28, 413-420, 2005; Wei, et al J Ethnopharmacol. 111, 613-618, 2007; Eriksson, et al J Ethnopharmacol. 119, 17-23, 2008).
조총사포닌 분획(CGSF)은 세포막 신호 경로(signal pathway)를 통해 그 활성이 나타나는 것으로 알려져 있는데, 예를 들면, 최 등은 개구리알(Xenopus oocytes)에 조총사포닌 분획을 처리했을 때 PLCβ-IP3에 연결되어 있는 PTX-insentive Gαq/11 단백질을 통해 칼슘 의존성 염소이온 채널(Ca2+ activated Chloride Channel, CaCC)이 활성화 되는 것을 밝혀냈다(Choi, et al., J. Biol. Chem. 276, 48797-48802, 2001). 또한, 이 등은 개구리알(Xenopus oocytes)에서 조총사포닌 분획을 지속적으로 처리했을 때 조총사포닌 분획에 의해 활성화된 칼슘 의존성 염소이온 채널 전류(CaCC currents)가 자발적으로 감소하는 것을 보고하였다(Lee, et al, J Biol Chem. 279, 9912-9921, 2004).
칼모둘린(Calmodulin)을 개구리알에 직접 주입을 하거나 세포 내 칼슘저장고를 고갈시켰을 때 조총사포닌 분획에 따른 칼슘 의존성 염소이온 채널의 활성이 사라진다(Lee, et al, Arch Pharm Res 28, 413-420, 2005). 게다가 개구리알에서 조총사포닌 처리시 SOCE(stored-operated Ca2+ entry)가 유발되며(Jeong, et al, Br J Pharmacol. 142, 585-593, 2004), 이에 따라 세포 밖에서부터 또는 세포 내 칼슘 저장고에서 칼슘의 농도 증가로 이어져 개구리알 내 CaCC가 활성되는 것으로 알려져 있다(Dascal, CRC Crit Rev Biochem 22, 317-387, 1987).
본 발명자들은 진세노사이드가 CaCC를 활성화시키는 것을 확인하기 위하여 조총사포닌 분획물(CGSF)로부터 순수한 진세노사이드를 분리하는 과정 중 CGSF 보다 진세노사이드가 풍부한 분획물의 경우 CaCC 활성에 대한 그 효과가 급격하게 사라지거나 없어지는 것을 발견하였다. 즉, CGSF로부터 순수하게 분리된 진세노사이드의 경우에는 개구리알 내에서 CaCC 활성 효과가 없는 것을 확인하고, 이는 진세노사이드 뿐만 아니라 알 수 없는 어떤 물질들이 CGSF에 존재하며, 이 물질에 의해 개구리알 내에 존재하는 CaCC의 활성에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.
이에 본 발명자들은 선행 특허에서 CGSF 내에 내인성 CaCC의 활성을 일으키는 특정 성분을 인삼에서 분리 동정하고, 새로운 생리활성 물질을 진토닌이라고 명명하였다(특허등록 제10-0973202호).
또한, 인삼의 메탄올 및 부탄올 추출물로부터 음이온교환수지법을 이용하여 조진토닌(crude gintonin)을 분리하는 간단한 방법을 통하여 수득률을 2배로 높일 수 있으며, 인삼 뿌리(root)만이 아니라, 인삼 수확 후 폐기되는 인삼의 줄기(ginseng stem) 및 인삼잎(ginseng leaf)에 존재하는 진토닌을 분리하는 방법을 개발하여 "인삼에 존재하는 당지질단백질 진토닌의 제조 방법"이란 제목으로 특허를 출원하였다(특허출원 제10-2010-0052913호).
그러나, 상기 발명들에서는 진토닌 분리를 위한 인삼 추출 및 분획 (fractionation) 과정에서 유기용매로서 메탄올과 부탄올을 사용했기 때문에, 그 성분이 실험실적 생리활성이 있음을 검증하더라도 식용이 불가능하다는 문제가 있었다.
이에 본 발명자들은 의약품 및/또는 기능성 식품에 적용이 가능하고, 수율이 높으면서도 빠르고 간편하게, 그리고 저렴하게 인삼으로부터 진토닌을 분리하고자 예의 노력한 결과, 에탄올을 이용하여 식용 가능한 조 진토닌(crude gintonin)을 제조방법을 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 에탄올을 이용하여 인삼으로부터 식용 가능한 조 진토닌을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 인삼으로부터 에탄올 추출물을 제조하는 단계; (2) 상기 에탄올 추출물을 농축, 투석(dialysis) 및 동결 건조하는 단계; (3) 상기 동결 건조한 에탄올 추출물을 에탄올이 함유된 완충액에 용해한 후 음이온 교환수지 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 (4) 음이온 교환수지 컬럼에서 회수한 물질을 투석막에 넣고 투석하여 함유된 염 및 에탄올을 제거하는 단계;를 포함하는 에탄올을 이용하여 인삼으로부터 식용 가능한 조 진토닌(crude gintonin)을 제조하는 방법을 제공한다.
상기와 같은 본 발명은, 인삼으로부터 동물 세포질 내 유리 칼슘(free Ca2+)을 동원(mobilization) 증가시키는 생리활성 작용을 갖는 조 진토닌(crude gintonin)의 제조방법을 제공하는 효과가 있다.
본 발명은 종래 인체에 유해한 유기용매를 사용하여 식용이 불가능했던 문제점을 해결하기 위해 에탄올 추출물로부터 음이온교환수지법을 이용하여 조 진토닌을 분리하기 때문에 식용이 가능하고, 산업폐기물의 문제가 없다.
또한, 본 발명에 따른 방법은 비교적 간단하게 높은 수율로 대량 분리하는 것이 가능하므로 시간과 비용을 절감할 수 있어 가격 경쟁력이 있을 뿐만 아니라 인삼의 뿌리(root)는 물론, 인삼 수확 후 버려지는 인삼의 줄기(steam)나 잎(leaf)에서도 진토닌을 분리할 수 있어서 폐자원을 활용할 수 있다.
도 1의 A는 본 발명에 따른 제조방법을 도식화한 그림이며, B는 각 단계의 분획물의 개구리알(Xenopus oocytes)에서의 CaCC 활성을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조한 조 진토닌(crude gintonin)의 겉보기(aaparent) 분자량 결정을 위한 SDS-PAGE 결과이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조한 조 진토닌의 겔 여과 크로마토그래피 용출 패턴을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조한 조 진토닌의 개구리알에서 내인성 내향성 CaCC 전류흐름을 나타낸 것이다.
도 5a는 본 발명에 따라 제조한 조 진토닌을 HPAED-PAD 크로마토그램으로 분리한 개별 진토닌의 탄수화물 중 표준 중성당(standard neutral sugar) 및 아미노당(Amino sugar)의 성분 분석결과(표준물질: 1. L-과당(furc); 2. L-람로스(Rha); 3. D-갈락토사민(Galactosamin); 4. D-아라비노오스(Ara); 4. D-갈락토오스(Gal); 5. D-글루코사민(Glucosamin); 6. D-갈락토오스(Gal); 7. D-글루코오스(Glc); 8. D-만노스(Man); 9. D-크실로오스(Xyl); 10. D-푸코오스(Fuc))이다.
도 5b는 본 발명에 따라 제조한 조 진토닌의 당성분에 대한 분석 결과이다.
도 5c는 상기 도 5a와 도 5b를 혼합한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조한 조 진토닌의 지질 성분을 GC-MS 스펙트럼으로 분석한 결과이다(Retention Time(RT): 14.825-Phenol; 19.987-Palmitic acid; 21.802-Stearic acid; 22.040-Palmitic acid butyl ester; 23.505-Linoleic acid ethyl ester; 23.762-Stearic acid butyl ester; 25.232-Linoleic acid butyl ester).
도 2는 본 발명에 따라 제조한 조 진토닌(crude gintonin)의 겉보기(aaparent) 분자량 결정을 위한 SDS-PAGE 결과이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조한 조 진토닌의 겔 여과 크로마토그래피 용출 패턴을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조한 조 진토닌의 개구리알에서 내인성 내향성 CaCC 전류흐름을 나타낸 것이다.
도 5a는 본 발명에 따라 제조한 조 진토닌을 HPAED-PAD 크로마토그램으로 분리한 개별 진토닌의 탄수화물 중 표준 중성당(standard neutral sugar) 및 아미노당(Amino sugar)의 성분 분석결과(표준물질: 1. L-과당(furc); 2. L-람로스(Rha); 3. D-갈락토사민(Galactosamin); 4. D-아라비노오스(Ara); 4. D-갈락토오스(Gal); 5. D-글루코사민(Glucosamin); 6. D-갈락토오스(Gal); 7. D-글루코오스(Glc); 8. D-만노스(Man); 9. D-크실로오스(Xyl); 10. D-푸코오스(Fuc))이다.
도 5b는 본 발명에 따라 제조한 조 진토닌의 당성분에 대한 분석 결과이다.
도 5c는 상기 도 5a와 도 5b를 혼합한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조한 조 진토닌의 지질 성분을 GC-MS 스펙트럼으로 분석한 결과이다(Retention Time(RT): 14.825-Phenol; 19.987-Palmitic acid; 21.802-Stearic acid; 22.040-Palmitic acid butyl ester; 23.505-Linoleic acid ethyl ester; 23.762-Stearic acid butyl ester; 25.232-Linoleic acid butyl ester).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 에탄올을 이용하여 인삼으로부터 식용 가능한 조 진토닌(crude gintonin)을 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 (1) 인삼으로부터 에탄올 추출물을 제조하는 단계; (2) 상기 에탄올 추출물을 농축, 투석(dialysis) 및 동결 건조하는 단계; 및 (3) 상기 동결 건조한 에탄올 추출물을 에탄올이 함유된 완충액에 용해한 후 음이온 교환수지 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 (4) 음이온 교환수지 컬럼에서 회수한 물질을 투석막에 넣고 투석하여 함유된 염 및 에탄올을 제거하는 단계;를 포함한다.
또한, 본 발명은, 상기에 더하여, (5) 상기 조 진토닌을 NaCl이 함유된 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해하여 음이온 교환수지 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 2개의 분획으로 분리하는 단계; 및 (6) 상기 2개의 분획물을 각각 NaCl이 함유된 Tris-HCl(pH 8.2)와 NaCl이 함유된 PBS(pH 7.2)를 이용하여 음이온 교환수지 크로마토그래피를 수행하여 개별 진토닌으로 분리하는 단계;를 포함하는 에탄올을 이용하여 인삼으로부터 식용 가능한 진토닌(gintonin)을 제조하는 방법을 제공한다.
인삼은 두릅나무과 약용식물로, 가공방법에 따라 가공하지 아니한 수삼, 수삼을 건조시킨 백삼, 수삼을 쪄서 건조시킨 홍삼 등이 있으며, 재배방법에 따라서는 인삼밭에서 인위적으로 재배한 재배삼, 인삼씨를 산 중에 뿌려서 자연상태에서 재배한 장뇌삼, 자연상태로 자생한 산삼 등이 있는데, 본 발명에서의 인삼은 상기 모든 인삼 종류를 포함한다. 또한, 본 발명에서 인삼은 고려인삼(Panax ginseng C.A. Meyer), 서양삼 및 중국인삼 등을 포함하며, 바람직하게는 고려인삼으로 제조한 4 내지 6년근 백삼을 사용하는 것이 좋으며, 인삼의 뿌리(root)는 물론 인삼의 줄기(steam), 잎(leaf), 열매 또는/및 꽃을 사용하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명에서 "추출물"은 추출액, 정제물, 희석액, 농축액, 및 건조물을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 에탄올을 이용하여 인삼으로부터 식용 가능한 조 진토닌을 제조하기 위해서는, 먼저, 건조된 인삼 분말을 시료 중량의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 1 내지 10배에 달하는 부피의 물, 에탄올 또는 이들의 약 1 : 0.1 내지 1 : 10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 70 내지 120℃에서 약 0.1 내지 48시간, 바람직하게는 5 내지 12시간 동안 교반추출, 열수추출, 냉침추출, 가온추출, 환류냉각추출 또는 초음파추출 등의 추출방법, 바람직하게는 환류냉각추출한 후 여과하여 상층액을 회수하고, 상기 과정을 수회, 바람직하게는 2 내지 5회 반복 수행한 다음 상층액을 모아 감압농축하여 에탄올 추출물을 수득한다. 또한, 상기 에탄올 추출물은 1 내지 7일, 바람직하게는 1 내지 5일 투석막 공극크기(pore size): molecular weight cut off 6,000~8,000)하고, 상기 투석된 에탄올 추출물은 동결 건조한다.
그 다음으로, 상기 동결 건조하여 얻은 에탄올 추출물은 50%(w/v) 에탄올이 함유된 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 8.2)에 용해시킨 후 음이온 교환수지(DEAE sehparose)로 충진된 컬럼에 로딩(loading)한다. 음이온 교환수지에 결합되지 않는 성분(unbound components)은 에탄올이 함유된 완충액으로 세척하여 제거하고, 음이온 교환수지에 결합된 성분(bound components)은 50%(w/v) 에탄올 및 1 M의 NaCl이 함유된 약알카리성을 띠는 완충액(20 mM, Tris-HCl, pH 8.2)으로 용출시킨다.
용출된 성분은 투석(투석막 공극크기(pore size): molecular weight cut off 6,000~8,000) 후 감압농축 또는 동결 건조하여 조 진토닌(crude gintonin) 분획으로 한다.
또한, 상기와 같이 수득된 조 진토닌은, 상기 단계에 더하여, NaCl이 함유된 인산염 완충 식염수(phosphate buffer salin, PBS)에 용해하여 음이온 교환수지 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 2개의 진토닌 분획물을 수득하고, 각각의 진토닌 분획물은 NaCl이 함유된 Tris-HCl(pH 8.2)과 NaCl이 함유된 PBS(pH 7.2)를 사용하여 단계 기울기(step gradient) 음이온 교환수지 크로마토그래피를 수행하면 개별 진토닌을 수득할 수 있다.
그러나, 본 발명에서 음이온 교환수지 크로마토그래피 수행시 사용하는 레진(resin)은 DEAE sehparose로 특별히 한정시킬 필요는 없으며, 통상적으로 사용하는 음이온 교환수지 레진을 사용할 수 있다. 용출용매 종류와 pH 또한 20 mM Tris-HCl과 pH 8.2로 한정하지 않으며, 에탄올을 함유하는 통상적으로 음이온 교환수지에 사용하는 용매와 pH를 사용할 수 있다.
또한, 상기와 같이 수득된 조 진토닌은 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)를 통해 분자량이 약 67 Dka이고, SDS-PAGE에서 겉보기 분자량은 약 13 kDa인 오량체(pentamer)이며, 아미노산조성 성분으로 시스테인과 시스틴(cysteine and cystine), 아스파라긴과 아스파르트산(asparagine and aspartic acid), 글루타민과 글루탐산(glutamine and glutamic acid), 세린(serine), 글리신(glycine), 아르기닌(arginine), 트레오닌(threonine), 알라닌(alanine), 프롤린(proline), 발린(valine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan) 및 리신(lysine)과; 탄수화물 조성 성분으로서 글루코오스(glucose), 아라비노스(arabinose), 갈락토오스(galactose), 푸코오스(fucose), 갈락토사민(galactosamine); 및 지질 조성 성분으로 팔미트산(palmitic acid), 리놀레산(linoleic acid), 스테아르산(stearic acid)과 기타 소량의 다른 화합물을 포함하는 당지질단백질임을 확인할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 에탄올을 이용한 인삼 뿌리에서의 조 진토닌(crude gintonin) 분리
한국인삼공사(대전, 한국)에서 구입한 4년근 백삼(Panax ginseng C.A. Meyer) 분말 500 g을 80~100%(w/v) 에탄올 5ℓ를 가하여 8시간 동안 약 80℃에서 환류냉각추출하여 여과한 다음(상기 과정을 3회 반복), 진공농축기에서 농축한 후 투석(투석막 공극크기(pose size): 6,000~8,000) 및 동결 건조하여 에탄올 추출물 30 g을 얻었다.
상기 에탄올 추출물은 50%(w/v) 에탄올을 포함하고 있는 20 mM Tris-HCl(pH 8.2)에 녹인 후 같은 용매로 미리 충진된 DEAE sepharose 음이온 교환수지 컬럼에 로딩(loading)하여 용출용매를 충분히 통과시켰다. 이때 용출용매로는 50% 에탄올을 포함하고 있는 20 mM Tris-HCl(pH 8.2)를 사용하였으며, 컬럼에 결합되지 않은 물질, 즉 음전하는 띠지 않는 진세노사이드(ginsenoside) 등 또는 기타 저분자 물질은 충분히 제거한 다음 1 M HCl과 50%(w/v) 에탄올을 포함하고 있는 20 mM Tris-HCl(pH 8.2)을 통과시켜 음이온 교환수지 컬럼에 결합된 물질을 회수하였다.
컬럼에서 회수한 물질은 공극크기(pose size) 6,000~8,000의 투석막에 넣고 투석하여 함유된 염과 에탄올을 제거한 후, 동결 건조하여 조 진토닌 분획 1,000 ㎎ 수득하였다(수율: 0.2%).
상기 에탄올 추출물(EtOH ext.)에는 내인성으로 존재하는 CaCC(Ca2+ activated Chloride Channel)를 약하게 활성시키는 성분(CaCC는 100 ㎍/㎖로 측정)이 존재하며(도 1 Ba 참조), 단순한 크로마토그래피를 통하여 에탄올 추출물로부터 CaCC 활성(CaCC는 1 ㎍/㎖로 측정)이 높은 조 진토닌을 쉽게 분리할 수 있음을 보여주고 있다(도 1 Bb 참조). 그러나, 음이온 교환수지에 결합되지 않은 성분(unbound components)는 CaCC 활성이 없는 것으로 나타났다(도 1 Bc 참조.)
실시예 2. 진토닌 분자량 결정
상기 실시예 1에서 수득한 조 진토닌(crude gintonin) 분획을 표준단백질들을 이용하여 SDS-PAGE한 결과, 진토닌이 폭은 넓지만(braod) 단일한 주 밴드(single major band)를 나타내었으며, 이로부터 겉보기 분자량(apparent molecular weight)은 약 13 Dka인 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조).
실시예 3. 진토닌의 아미노산 조성 분석
일반 아미노산(general amino acid) 분석을 위해, 상기 실시예 1에서 수득한 조 진토닌(crude gintonin) 30 ㎍을 진공 하(in vacuo)에서 6 N HCl으로 110℃에서 24시간 동안 가수분해하였다. 또한, 시스테인(cystein)의 분석을 위해서는, 조 진토닌을 과산화(peroxidation) 후 6 N HCl으로 110℃에서 24시간 동안 가수분해하여 포름산과 과산화수소를 10 : 1의 비율(v/v)로 혼합한 용액으로 처리하였으며, 트립토판(tryptophan)의 분석을 위해서는, 조 진토닌을 4 M 메탄설폰산(methanesulfonic acid)로 가수분해하고, 4 M NaOH를 가했다.
또한, 페닐이소티오시아네이트(Phenylisothiocyanate, PITOC) 유도체에 숨겨진 아미노산은 대전에 소재한 한국기초과학지원연구원에 의뢰하여 워터스 노바-팩 18 컬럼(Waters Nove-Pak C18 column; 3.9×300 ㎜)이 장착된 HPLC(Hewlett Packard 1100 Series)로 분석하였다.
단백질 성분은 표준으로 소혈청알부민(BSA)을 사용한 브래드포드(Bradford)법(Bradford, M.M., Anal. Biochem. 72, 248-254, 1976)으로 결정하였다.
그 결과, 조 진토닌(crude gintonin)에는 소수성 아미노산(hydrophobic amino acid)으로 알라민(alanine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine) 및 발린(valine)이 많이 존재하는 것으로 나타났고, 친수성 아미노산(hydrophilic amino acid)으로서는 글리신(glycine), 아르기닌(arginine), 리신(lysine) 등이 확인되었다.
| 아미노산 종류 | 조성비(%) |
| CYA* | 6.39 |
| ASX** | 15.37 |
| GLX** | 11.07 |
| SER | 4.69 |
| GLY | 7.88 |
| HIS | 1.12 |
| ARG | 3.34 |
| THR | 7.19 |
| ALA | 6.49 |
| PRO | 6.84 |
| TYR | 1.89 |
| VAL | 6.37 |
| MET | 1.30 |
| ILE | 3.82 |
| LEU | 7.18 |
| PHE | 4.82 |
| TRP | 0.35 |
| LYS | 3.89 |
| 합계 | 100 |
단, 상기에서 CYA*는 시스테인과 시스틴의 합계이며, ASX**는 아스파라긴과 아스파르트산의 합계이고, GLX***는 글루타민과 글루탐산의 합계이다.
실시예 4. 진토닌의 탄수화물 조성 분석
도 2에서 나타난 바와 같이, SDS-PAGE에서 진토닌 밴드는 단일(single)하지만 원만(broad)하였고, Camassie Brilliant blue straining으로 강하게 염색되지 않았기 때문에 탄수화물을 포함하고 있을 가능성이 있다.
따라서, 진토닌의 탄수화물 조성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 수득한 조 진토닌(crude gintonin)을 2 M 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)으로 100℃에서 4시간 동안 가수분해한 후 중성당(neutral sugar)을 얻었으며, 또한 조 진토닌을 유리 앰플(ample)에서 6 N HCl으로 100℃에서 4시간 동안 가수분해하여 아미노당(amino sugar)와 산성당(acid sugar)을 얻었다.
진토닌의 탄수화물 조성은 서울 소재의 세종대학교 탄수화물 소재 연구소에 의뢰, PAS 염색(periodic acid-schiff based staining)기법을 사용하여 염색한 후 CarboPacTM PA1 컬럼이 장착된 HPAEC-PAD 시스템(high performance anion exchange chromatography-pulsed amphermetric detection system; Dionex, California, USA)을 사용하여 분석하였다.
단당류의 몰중량(molar weight)은 첨두의 면적(peak area)으로부터 계산하였으며, 탄수화물의 함량은 중성당의 경우, 페놀-설폰산 방법(Hounsell, E.F., Davies, M.J., and Smith, K.D., Protein protocol handbood, Humanna press, Totawa, 803-804, 1997)으로 결정하고, 산성당은 Anthrone 방법(Scott, T.A., and Melvin, E.H., Anal. Biochem. 25, 1656-1660, 1953)으로 결정하였다.
그 결과, 조 진토닌(crude gintonin)은 글루코오스(glucose), 갈락토오스(galactose) 등 2개 종류의 중성당(neutral sugar)과, 갈락토사민(galactosamine)과 같은 1개 종류의 아미노당(amino sugar)으로 구성된 것으로 나타났다. 그러나, 90% 이상이 글루코오스로 구성됨을 확인하였다(표 2 및 도 5 참조).
| 탄수화물 종류 | 조성비(%) |
| Glucose | 90.35 |
| Arabinose | 4.32 |
| Galactose | 2.95 |
| Fucose | 1.50 |
| Glucosamine | 0.88 |
| 합계 | 100 |
실시예 5. 진토닌의 지질 성분 분석
선발명(국내 특허등록 제10-0973202호)에서 확인된 진토닌은 부탄올 추출에 의해 진세노사이드와 같은 분획에 있었기 때문에 본 발명의 진토닌 역시 지질 모이어티(lipid mioety)를 함유하고 있을 것으로 예상된다.
이를 확인하기 위하여, 실시예 1에서 수득한 조 진토닌(crude gintinic)을 6 N HCl으로 4시간 동안 100℃에서 가수분해하거나 또는 지질단백질 리파아제(lipoprotein lipase)에 소화시켜 지질(lipid) 및 소수성 모이어티(hydrophobic moiety)를 확인하였다. 이때, GC는 불꽃이온화 검출기(flame ionization detector)와 분리 주입 시스템(split injection system)을 장착하였으며, supelco SPB-1 모세관 컬럼(내경: 15 m×0.32 ㎜; 두께: 0.25 m)을 고정하였다.
그 결과, 하기 표 3 및 도 6에 나타난 바와 같이, 조 진토닌(crude gintonin)은 지질 조성 성분으로 리놀레산(linoleic acid), 팔미트산(palitic acid), 스테아르산(stearic acid)과 기타 소량의 다른 화합물을 함유하는 것으로 확인되었으며, 조성 비율은 팔미트산(palitic acid) > 리놀레산(linoleic acid) > 스테아르산(stearic acid)의 순으로 나타났다.
| 지방산 종류 | 조성비(%) |
| Palmitic acid (C16:0) | 4.8 |
| Palmitic acid methyl ester | 37.0 |
| Stearic acid acid (C18:0) | 3.0 |
| Stearic acid acid butyl ester | 3.5 |
| Linoleic acid (C18:2) | 6.0 |
| Linoleic acid butyl ester | 11.6 |
| Phenol | 11.2 |
| 기타 | 22.9 |
| 합계 | 100 |
측정예.
Xenopus laevis oocytes
에서 CaCC 활성 측정
1-(1). Oocyte 준비
Xenopus Ⅰ(Ann Arbor, MI, USA)로부터 구입한 Xenopus laevis frog는 최상의 규격지침에 따라 보관 및 처리하고, oocytes(난자)를 분리하기 위해 개구리를 3-아미노벤조산에틸에스테르(3-amino benzoic acid ethyl ester)의 통기용액(aerated solution)으로 마취시켜 수술한 후 콜라게나제(collagenase)로 처리한 다음 82.5 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 2.5 mM 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), 100 units/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 Ca2+ 유리 배지에서 2시간 동안 교반하여 분리하였다(Choi, et al., J. Biol. Chem. 276, 48797-48802, 2001).
Ⅴ-Ⅵ 단계의 난자를 수집하여 젠타마이신(gentamicin) 50 ㎍/㎖를 추가한 ND96(96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 및 5 mM HEPES; pH 7.4)에서 보관하였으며, 상기 난자를 포함하는 용액은 연속적으로 가볍게 진탕하면서 18℃로 유지하고, 매일 교환하였다(Choi, et al., J. Biol. Chem. 276, 48797-48802, 2001).
1-(2). CaCC의 측정
2-전극 전압고정(two-electrode voltage clamp) 기록은 소형 플랙시글라스(plexiglass) 네트 챔버(0.5 ㎖)에 놓인 개별적인 난자로부터 얻었으며, 전기생리학 실험(electrophysiological experiments)은 3 M KCl로 채운 마이크로전극(저항: 0.2~0.7 ㏁)과 난자 고정 증폭기(Oocyte Clamp amplifier; OC-725C, Warner Instrument, CT, USA)를 사용하여 실온에서 진행한 후 CaCC를 -80 ㎷ 지지전위(holding potential)에서 기록하였다.
또한, 실시예 1에서 수득한 조 진토닌은 이 등의 방법에 따라 개구리 난자에 처리하였다(Lee, J. H., Jeong, S. M., Lee, B. H., Noh, H. S., Kim, B. K., Kim, J. I., Rhim, H., Kim, H. C., Kim, K. M., and Nah, S. Y. (2004) J Biol Chem 279, 9912-9921).
실험예 1. Xenopus laevis oocytes에 내인성으로 존재하는 CaCC 활성에 대한 진토닌 효과 확인
개구리알(Xenopus laevis oocytes)에 내인성으로 존재하는 CaCC 활성에 대한 조 진토닌(crude gintonin)의 효과를 확인하기 위하여, 상기 참조예 1의 각각의 방법을 사용하여 CaCC의 활성 증가로 기록되는 지지전위를 측정하였다.
본 발명에 따른 조 진토닌(crude gintonin)을 농도 의존적인 방법(concentration-dependent manner)으로 처리한 군에서는 - 80 ㎷ 지지전위(holding potential)에서 처리 농도별로 내향성(inward) Cl- 전류의 증가를 유도하였고, ED50은 1.05±0.3 ㎍/㎖인 것으로 나타났다(도 4 참조).
이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (9)
- (1) 인삼으로부터 에탄올 추출물을 제조하는 단계;
(2) 상기 에탄올 추출물을 농축, 투석 및 동결 건조하는 단계;
(3) 상기 동결 건조한 에탄올 추출물을 에탄올이 함유된 완충액에 용해한 후 음이온 교환수지 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
(4) 음이온 교환수지 컬럼에서 회수한 물질에서 염 및 에탄올을 제거하는 단계;를 포함하는 에탄올을 이용하여 인삼으로부터 식용가능한 분자량이 67kDa이고 오량체(pentamer) 당지질단백질인 조 진토닌(crude gintonin)의 제조방법.
- 상기 제1항에 더하여,
(5) 상기 조 진토닌을 NaCl이 함유된 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해하여 음이온 교환수지 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 2개의 분획으로 분리하는 단계; 및
(6) 상기 2개의 분회물 각각 NaCl이 함유된 pH 8.2의 Tris-HCl과 NaCl이 함유된 pH 7.2의 PBS를 이용하여 음이온 교환수지 크로마토그래피를 수행하여 개별 진토닌으로 분리하는 단계;를 포함하는 에탄올을 이용하여 인삼으로부터 식용가능한 분자량이 67kDa이고 오량체(pentamer) 당지질단백질인 조 진토닌(crude gintonin)의 제조방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 (1)단계에서 인삼은 뿌리, 잎, 줄기, 열매 및 꽃에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 에탄올을 이용하여 인삼으로부터 식용가능한 분자량이 67kDa이고 오량체(pentamer) 당지질단백질인 조 진토닌(crude gintonin)의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 (3)단계의 음이온 교환수지 크로마토그래피는 HCl과 50%(w/v) 에탄올을 포함하고 있는 약알카리성 완충액인 pH 8.2의 20mM Tris-HCl을 이용하는 것을 특징으로 하는 에탄올을 이용하여 인삼으로부터 식용가능한 분자량이 67kDa이고 오량체(pentamer) 당지질단백질인 조 진토닌(crude gintonin)의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 (4)단계의 투석막은 공극크기(pore)가 분획분자량(molecular weight cut off, MWCO) 6000 내지 8000인 것을 특징으로 하는 에탄올을 이용하여 인삼으로부터 식용가능한 분자량이 67kDa이고 오량체(pentamer) 당지질단백질인 조 진토닌(crude gintonin)의 제조방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 당지질단백질은 아미노산조성 성분으로 시스테인과 시스틴(cysteine and cystine), 아스파라긴과 아스파르트산(asparagine and aspartic acid), 글루타민과 글루탐산(glutamine and glutamic acid), 세린(serine), 글리신(glycine), 아르기닌(arginine), 트레오닌(threonine), 알라닌(alanine), 프롤린(proline), 발린(valine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan) 및 리신(lysine)과; 탄수화물 조성 성분으로서 글루코오스(glucose), 아라비노스(arabinose), 갈락토오스(galactose), 푸코오스(fucose), 갈락토사민(galactosamine); 및 지질 조성 성분으로 팔미트산(palmitic acid), 리놀레산(linoleic acid), 스테아르산(stearic acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는 에탄올을 이용하여 인삼으로부터 식용가능한 분자량이 67kDa이고 오량체(pentamer) 당지질단백질인 조 진토닌(crude gintonin)의 제조방법.
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