KR20010050186A

KR20010050186A - 조혈 촉진작용, 골수 방어작용, 암세포 살해 면역세포생성작용 및 방사선 민감작용이 우수한 인삼 다당체

Info

Publication number: KR20010050186A
Application number: KR1020000049173A
Authority: KR
Inventors: 윤연숙; 송지영; 배강규; 정인성
Original assignee: 장인순; 한국원자력연구소
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 2000-08-24
Publication date: 2001-06-15
Also published as: DE60035406D1; DE60035406T2; KR100361187B1; WO2001016347A1; US6555527B1; AU6737900A; JP2003508460A; EP1124982A1; EP1124982B1; JP3797930B2

Abstract

본 발명은 인삼으로부터 분리한 조혈 촉진 작용, 골수방어작용, 암세포 살해면역세포 생성작용 및 방사선 민감 작용이 우수한 인삼 다당체에 관한 것이다. 또한, 상기 다당체의 제조 방법 및 상기 다당체를 이용하는 조혈촉진제, 방사선 부작용억제제, 항암제 부작용억제제, 항암 면역치료제, 암 예방제 및 방사선 민감제에 관한 것이다. 본 발명의 다당체는 인삼 뿌리 분말을 메탄올로 추출하여 메탄올 불용성 잔사를 음건한 후, 증류수로 추출하여 얻은 수 가용성 분획을 동결건조시키고, 상기 수득물에 에탄올을 가해 40% 에탄올 불용성 분획을 수득한 후 이를 셀룰로오스 투석막으로 투석시켜 다당체를 획득한 후, 세파크릴 S-500 컬럼 크로마토그래피하여 6개의 분획을 얻었으며 이들을 각각 DEAE-셀룰로오스 컬럼 크로마토그래피하여 순수히 분리정제한 결과, 1,800,000∼2,200,000, 1,350,000∼1,650,000, 620,000∼780,000, 105,000∼130,000, 23,000∼27,000 및 5,000∼6,000 달톤의 다당체가 각각 11.4∼13.4 : 3.6∼4.2 : 4.5∼5.1 : 0.7∼0.9 : 40.1∼48.1 : 31.0∼37.0 으로 존재하며 글루코피라노오스가 α(1→6)으로 결합한 주사슬에 글루코피라노오스가 α(1→3) 결합한 가지사슬을 가진 구조로 조혈촉진 효과, 골수방어효과, 암 세포 살해 면역세포 생성 효과, 암 예방 효과 및 방사선 민감 효과가 우수한 인삼 다당체이다.

Description

조혈 촉진작용, 골수 방어작용, 암세포 살해 면역세포 생성작용 및 방사선 민감작용이 우수한 인삼 다당체{The hematopoietic, myeloid protecting, antitumor immune cells generating and radiosensitizing polysaccharide isolated from Panax ginseng}

본 발명은 인삼으로부터 조혈 촉진작용, 골수 방어작용, 암세포 살해 면역세포 생성작용 및 방사선 민감작용이 있는 다당체를 분리하여 조혈 촉진제, 골수 방어제, 항암 면역치료제, 암 예방제 및 방사선 민감제로 개발하기 위한 것이다.

본 발명에 의해 분리된 인삼 다당체는 전처리 공정 후 물 추출물로부터 40% 에탄올을 이용하여 침전되는 다당체를 셀룰로오스 투석막으로 투석시켜 세파크릴 S-500 컬럼 크로마토그래피와 DEAE 세파덱스 A-50 컬럼 크로마토그래피로 순수 정제하였으며, 분자량 1,800,000∼2,200,000, 1,350,000∼1,650,000, 620,000∼780,000, 105,000∼130,000, 23,000∼27,000 및 5,000∼6,000 달톤의 다당체가 각각 11.4∼13.4 : 3.6∼4.2 : 4.5∼5.1 : 0.7∼0.9 : 40.1∼48.1 : 31.0∼37.0 으로 존재하며 글루코피라노오스가 α(1→6)으로 결합한 주사슬에 글루코피라노오스가 α(1→3) 결합한 가지사슬을 가진 다당체로, 한편으로는, 상기 다당체의 제조 방법 및 상기 다당체를 이용하는 조혈 촉진제, 방사선 부작용 억제제, 항암제 부작용 억제제, 항암 면역치료제, 암 예방제 및 방사선 민감제에 관한 것이다.

본 발명자들이 인삼으로부터 분리한 다당체의 조혈 촉진작용, 골수 방어작용, 암세포 살해 면역세포 생성작용 및 방사선 민감 작용을 발명하기 이전까지 많은 인삼 분리 다당체들이 보고되었다. 그 중 대표적인 다당체들은 다음과 같다.

인삼에서 분리된 다당체 중, 혈당 강하작용이 있는 D-글루코스로 구성된 글리칸의 일종인 파낙산(panaxan ; 참조 ; Konno C. et al., Isolation and hypoglycemic activity of panaxan A.B.C.D. and E glycans of Panax ginseng roots, Planta Medica 50 pp434-436, 1984)이 공지되어 있었으며, 또한 갈락투론산, 글루코오스, 아라비노오스, 만노오스 및 갈락토오스 등으로 구성된 단당류의 혼합물인 항보체 작용이 있는 인삼 다당체(참조; Gao Q., Kiyohara H. et al., Chemical properties and anticomplementary activities of polysaccharide fractions from roots and leaves of Panax ginseng, Planta Medica 55 pp9-12, 1989)가 보고된 바 있다.

한편, 세망내피계의 기능 촉진에 의한 세균감염 저항능 및 항종양능이 있는 아라비노오스, 갈락토오스, 글루코오스로 구성된 인삼 다당체[일본 공개 특허공보 소61-18722호(1986.1.27)]가 개시되어 있으며, 방사선 방어작용 및 암 예방작용이 있는 글루코오스, 갈락토오스, 갈락투론산 및 단백질로 구성된 인삼 단백다당체[한국 특허등록 제144,130호(1998. 4.18)]등이 보고된 바 있다.

특히 상기 한국 특허등록 제144,130호에 개시된 발명은 본 발명자들이 발명한 선행 발명으로서, 상기 특허의 인삼 다당체의 추출방법은 본 발명의 추출방법과 일부 유사성을 지니고 있으나, 본 발명의 경우 상기 특허에서 인식하지 못했던 글루코오스를 주요 구성당으로 하는 신규 다당체의 발굴 및 이에 의한 조혈 촉진작용, 골수 방어작용, 암세포 살해 면역세포 생성작용 및 방사선 민감작용 등을 추가로 인식 발명한 것이다.

상기의 선행 기술들은 모두 인삼으로부터 다당체를 분리하는 방법에 관한 문헌이기는 하나, 그 다당체를 구성하는 구성성분의 종류와 비율에 있어서는 본 발명에 의해 추출된 다당체와는 상이한 것이고, 그 다당체의 약리활성 효과면에서도 조혈 촉진작용, 골수 방어작용, 암세포 살해 면역세포 생성작용 및 방사선 민감 작용을 나타낸다고 보고된 바는 없다.

일반적으로, 인삼으로부터 분리된 물질 중 약리작용을 나타내는 것은 대부분 사포닌계 물질로서 본 발명의 다당체와는 상이한 구조를 지니며, 암세포를 직접 살해하는 것으로 알려진 폴리아세틸렌계 물질 또한 본 발명의 다당체와는 별개의 성분으로 그 구조상으로 확연히 상이한 것이다.

기타 조혈촉진작용이 있는 물질로는 합성물질인 AS101, 이스트 세포벽으로부터 분리된 글루칸 등이 있다. 이 중 글루칸은 다당체 구조를 지니나, 미생물로부터 얻어진 것으로서 글루코오스가 β위로 결합되어 있으며 주사슬에 대한 가지사슬의 존재 비율이 본 발명에 의해 제공되는 인삼 다당체와는 상이한 구조의 물질인 것이다.

또한 항암 면역증강제로는 독성을 약화시킨 소의 결핵균인 BCG, Streptococcus pyrogenes Su주에 페니실린 G를 첨가하고 열처리하여 얻은 분말인 OK-432, 표고버섯으로부터 추출된 다당체인 렌티난(Lentinan) 등이 보고되어 있다. 그 중 렌티난은 다당체 구조이나, 이 역시 미생물로부터 얻어진 것으로 본 발명에 의해 제공되는 인삼 다당체와는 전혀 상이한 구조의 물질인 것이다.

이에 본 발명자들은 조혈 촉진제, 방사선 부작용 억제제, 항암제 부작용 억제제, 항암 면역치료제, 암 예방제 및 방사선 민감제로 사용될 수 있는 물질을 인삼으로부터 찾아낼 목적으로, 인삼 뿌리 분말로부터 유효 성분의 분리를 시도한 결과, 조혈 촉진작용, 골수 방어작용, 암세포 살해 면역세포 생성작용 및 방사선 민감 작용이 있는 글루코오스를 주요 구성당으로 하는 인삼 다당체를 인삼으로부터 분리 정제하게 된 것이다.

도 1은 인삼으로부터 본 발명의 다당체의 분리 정제과정을 나타낸 도면이다.

도 2는 인삼 다당체의 부분구조를 나타낸 도면이다.

도 3은 겔 여과 크로마토그래피하여 각 분획들을 얻은 도면이다.

도 4는 인삼다당체의 가수분해물의 구성당을 박층 크로마토그래피로 확인한 도면이다.

도 5는 본 발명의 인삼 다당체의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 도면이다.

도 6은 본 발명의 인삼 다당체의 수소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 도면이다.

도 7은 본 발명의 인삼 다당체의 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 도면이다.

도 8은 본 발명의 인삼 다당체의 DQF-COSY 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 도면이다.

도 9는 본 발명의 인삼 다당체의 HMBC 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 도면이다.

도 10은 본 발명의 인삼 다당체의 방사선에 대한 골수방어작용을 나타낸 도면이다.

도 11은 본 발명의 인삼 다당체의 생체내 항암효과를 나타낸 도면이다.

도 12는 본 발명의 인삼 다당체에 의한 싸이토카인 전사 RNA의 발현증가를 나타낸 도면이다.

도 13은 본 발명의 인삼 다당체에 의한 암 세포주에서의 질소산화물 생성을 설명하는 도면이다.

도 14는 본 발명의 인삼 다당체에 의한 암 세포주에서의 방사선 민감작용을 나타낸 도면이다.

도 15는 본 발명의 인삼 다당체의 암 세포주에 대한 생체내 방사선 민감작용을 나타내는 도면이다.

따라서 본 발명은 인삼 뿌리 분말 1중량부에 대해 2∼4 중량부의 메탄올로 추출한 다음, 불용성 잔사를 음건한 후, 3∼5 중량부의 증류수를 가하여 추출하고, 수 가용성 분획을 수득한 후 동결건조시키고, 상기 수득물에 에탄올을 가하여 40% 에탄올 불용성 분획을 수득한 후 이를 셀룰로오스 투석막으로 투석시켜 다당체를 추출한 다음, 세파크릴 S-500 컬럼 크로마토그래피, DEAE 세파덱스 A-50 컬럼 크로마토그래피하여 인삼 다당체들을 순수 정제하였으며 조혈 촉진작용, 골수 방어작용, 암세포 살해 면역세포 생성작용 및 방사선 민감 작용이 우수한 인삼 다당체를 제공하는 것이다.

본 발명의 인삼 다당체의 성분은 당 성분 함량이 98.5% 이상의 중량부를 지닌 것으로, 상기 다당체는 글루코피라노오스가 α(1→6)으로 결합한 주사슬에 글루코피라노오스가 α(1→3) 결합한 가지사슬을 가진 구조로 이루어져 있으며 그 분자량이 1,800,000∼2,200,000, 1,350,000∼1,650,000, 620,000∼780,000, 105,000∼130,000, 23,000∼27,000 및 5,000∼6,000 달톤인 다당체가 각각 11.4∼13.4 : 3.6∼4.2 : 4.5∼5.1 : 0.7∼0.9 : 40.1∼48.1 : 31.0∼37.0 으로 존재한다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 인삼 다당체를 조혈 촉진제, 방사선 부작용 억제제, 항암제 부작용 억제제, 항암 면역치료제, 암 예방제 및 방사선 민감제로 제공하는 것이다.

이하 본 발명의 인삼 다당체의 분리방법과 이화학적 특성을 살펴보면 다음과 같다.

본 발명자들은 인삼으로부터 다당체를 분리하기 위해 6년근 백삼(Panax ginseng C. A. Meyer) 1㎏에 3배량의 메탄올을 가하여 메탄올 분획을 추출하고 남은 잔사를 냉암소에서 건조시킨 후 4배량의 증류수로 4℃에서 24시간씩 3회 추출하여 물 가용성 분획을 얻어 동결 건조하였다. 이를 40% 에탄올을 가하여 에탄올 가용성 분획과 불용성 분획으로 나누었다. 40% 에탄올 불용성 분획을 셀룰로오스 투석막을 사용하여 증류수로 투석시킨 후 투석막 안쪽의 분획만을 모아 동결 건조하였으며 이를 세파크릴 S-500 컬럼 크로마토그래피하여 6개의 분획을 얻었으며 이들을 각각 DEAE-셀룰로오스 컬럼 크로마토그래피하여 인삼 다당체들을 순수히 분리정제하였으며 이에 대한 화학적인 분석을 실시하여 그 구조를 확인하였다(도 1, 2 및 3 참조).

( 인삼 다당체 중 분획 1(GⅠ)의 구조 분석 )

1) 인삼 다당체의 당 함량 측정

인삼으로부터 분리된 인삼 다당체의 당 함량은 페놀-황산법으로 측정하였다. 0.1㎎/㎖의 농도로 인삼 다당체를 증류수에 용해시킨 용액 20㎕에 5% 페놀용액 30㎕와 진한 황산 0.2㎖를 가하고 진탕한 후, 60℃에서 20분간 반응시켜 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 표준품으로는 글루코오스를 사용하여 표준용량곡선을 작성하였다. 인삼 다당체의 당 함량은 98.5%이상 이였다.

2) 인삼 다당체의 단백질 함량 측정

인삼으로부터 분리된 인삼 다당체의 단백질 함량은 브래드포드법을 기본으로 제품화된 단백질 함량 측정 키트(Protein Assay Kit, Bio-Rad사)를 사용하여 측정하였다. 소의 혈청 알부민을 표준품으로 하여 표준용량곡선을 작성하였으며 인삼 다당체의 단백질 함량은 1.0% 미만 이였다.

3) 실리카 박층 크로마토그래피에 의한 인삼 다당체의 구성당 분석

인삼 다당체 20㎎을 2㎖의 1몰 황산용액을 가하고 100℃에서 4시간 가수분해하여 수산화바륨을 가해 중화시킨 후 실리카 박층 크로마토그래피로 분석한 결과 그 구성당이 글루코오스로 이루어졌음을 확인하였다(도 4 참조).

4) 가스 크로마토그래피에 의한 인삼 다당체에 함유된 구성당 분석

검체 20㎎을 취해 디메칠 설폭사이드 2㎖에 녹인후 질소기류하에서 60℃에서 5분간 가열하였다. 이 용액에 0.5㎖의 methylsulfinyl carbanion을 가하고 25℃에서 1.5시간 가열하였다. 메틸화된 인삼 다당체는 물로 투석하고 감압건조한 후, 클로로포름으로 추출하였다. 이 조작은 적외선 분광스펙트럼에서 3400∼3200cm^-1부근의 히드록시기가 관찰되지 않을 때까지 반복하였다. 메틸화된 인삼다당체는 먼저 0.5㎖의 90% 개미산을 가하고 100℃에서 8시간 동안 가수분해시킨 후, 0.5㎖의 2몰-삼플루오르화아세트산을 가하고 100℃에서 3시간 동안 가수분해시켰다. 가수분해된 메틸화된 당들은 붕소수소나트륨으로 환원시키고 생성된 알디톨들을 0.2㎖의 아세트산무수물-피리딘(v/v, 1:1)으로 아세틸화시킨 후 기체 크로마토그래피하여 구성당을 분석하였다. 분석조건은 컬럼은 HP-5 캐필러리 컬럼을 사용하였으며, 주입기 온도는 280℃, 불꽃이온화검출기 온도는 300℃로 하였으며 결과를 표 1에 나타내었다.

기체 크로마토그래피에 의한 인삼 다당체의 구성당 분석

유도체들	머무름 시간(분)	면적비(%)	주요단편들(m/z)
1,5-Ac-2,3,4,6-Me-D-Glucitol	8.31	7.7	43, 45, 71, 88, 101, 115, 129, 145, 161, 205
1,5,6-Ac-2,3,4-Me-D-Glucitol	9.33	76.9	43, 71, 88, 101, 115, 129, 143, 161, 186
1,3,5-Ac-2,4,6-Me-D-Glucitol	9.44	7.8	43, 87, 101, 127, 143, 186
1,3,5,6-Ac-2,4-Me-D-Glucitol	10.74	7.6	43, 71, 88, 101, 115, 129, 143, 161, 186

Ac=아세틸 ; Me=메틸

표 1에 의하면 인삼다당체의 구조는 [→6)-α-D-Glup-(1→]의 반복단위 10개당 α(1→3) 결합이 1개 정도의 비로 결합한 것으로 그 구조를 도 2에 나타내었다.

5) 인삼 다당체의 분자량 확인

인삼 다당체의 분자량확인은 겔 여과 컬럼을 장치한 액체크로마토그래피 (hewrette-packard HP-600S)를 사용하였으며 이동상으로 0.1몰-탄산나트륨 수용액을 사용하였고, 유속은 1.5㎖/분, 검출기는 굴절율 검출기를 사용하였다. 40%에탄올 추출물을 셀룰로오스 투석막으로 투석하여 제조한 인삼 다당체 추출물의 겔 여과 액체크로마토그래피한 결과는 표 2와 같으며 각 분자량 크기별 조성비는 11.4∼13.4 : 3.6∼4.2 : 4.5∼5.1 : 0.7∼0.9 : 40.1∼48.1 : 31.0∼37.0 이었다.

겔 여과 컬럼을 장치한 액체크로마토그래피에 의한 인삼 다당체의 분자량 확인

시료	머무름 시간(분)	분자량(달톤)	면적비(%)
GⅠ	10.012	1,800,000∼2,200,000	11.4∼13.4
GⅡ	10.658	1,350,000∼1,650,000	3.6∼4.2
GⅢ	12.230	620,000∼780,000	4.5∼5.1
GⅣ	14.459	105,000∼130,000	0.7∼0.9
GⅤ	18.693	23,000∼27,000	40.1∼48.1
GⅥ	21.997	5,000∼6,000	31.0∼37.0

6) 인삼 다당체의 적외선흡수 스펙트럼 분석

인삼 다당체를 브롬화칼륨(KBr)을 사용하여 적외선 흡수 스펙트럼 분석용 박편을 만든 다음 푸리에-변환 적외선 분광기(Fourier Transform-Infra Red spectroscopy, Bomem DA8.12, Hartman and Braun사, Canada)를 사용하여 분석하였다. 3400 cm^-1부근의 히드록시기(-OH), 1000∼1100 cm^-1부근의 에스테르기(C-O), 2800∼2900 cm^-1의 탄화수소의 흡수 스펙트럼이 확인되어 전형적인 다당체의 흡수 스펙트럼임을 확인할 수 있었다(도 5 참조).

7) 인삼 다당체의 핵자기 공명 스펙트럼에 의한 분석

인삼 다당체를 D₂O에 녹여¹H,¹³C-핵자기 공명장치(500MHz Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy, Bruker AMX 500, Germany)를 이용하여 측정하였다.¹H-NMR에서 δ3.5∼4.2 ppm 부근의 하이드록실레이티드 메틴 또는 메틸렌 수소 피크와 4.76ppm 및 4.98ppm 부근의 아노메릭 수소 피크를 확인하였다.¹³C-NMR에서는 6개의 메이저 탄소 피크(δ62.6, 66.0, 77.8, 78.9, 82.8 및 106.7 ppm)와 12개의 마이너 탄소 피크(δ63.0, 64.8, 63.6, 65.1, 72.3, 76.9, 77.3, 79.2, 82.1, 83.6, 83.8, 106.1, 106.2 및 106.7 ppm)를 확인하였다(도 6 및 도 7 참조).

HMQC(Heteronuclear Multiple Quantum Correlation)로 탄소와 수소원자 간의 스핀결합을 확인하였으며, DQF-COSY spectrum으로부터 δ3.89의 수소는 δ3.56의 수소와, δ4.10의 수소는 δ4.19의 수소와, δ3.67의 수소는 δ3.79 및 δ4.10의 수소와, 그리고 δ3.69의 수소는 δ3.79의 수소와 스핀결합함을 확인하여 α(1→6) 결합이 존재함을 확인하였다.

HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Coherence) spectrum으로부터 δ4.10의 수소는 δ66.0의 탄소와, δ3.56 및 δ4.10의 수소는 δ82.8의 탄소와, δ4.19의 수소는 δ71.8의 탄소와, δ3.79 및 δ4.10의 수소는 δ78.9의 탄소와, δ4.19의 수소는 δ62.6의 탄소와, 그리고 δ3.79의 수소는 δ106.7의 탄소와 스핀결합함을 확인하여 α(1→6) 결합이 존재함을 재확인하였다(도 9 참조).

이하 상기 수득한 글루코오스로 구성된 인삼 다당체의 활성시험을 수행한 결과, 인삼 다당체가 조혈촉진효과 및 골수방어효과를 나타냄으로서 조혈 촉진제, 방사선 유발 조혈장해 억제제, 항암제 유발 조혈장해 억제제, 암세포 살해 면역세포 생성작용에 의한 항암면역치료제, 암 예방제, 방사선 민감 작용에 의한 방사선 암치료율 증강제로 사용할 수 있음을 발견하였다. 이를 다음의 구체적인 실시예를 통해 설명하고자 한다.

(실시예 1) 조혈 촉진 시험

1) 골수모세포 생성작용(Granulocyte macrophage-colony forming unit, GM-CFU)

35mm 배양 용기(with 2mm grid, Nalge Nunc. International, Corning, NY, USA)에 인삼 다당체를 농도별로 처리한 다음 0.3%의 아가(agar)와 20%의 말의 혈청(horse serum), 10%의 GM-CSF 상등액을 함유한 IMDM배지를 사용하여 골수 세포를 1 x 10⁵세포/㎖로 넣고 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 7일간 배양하였다. 대조군으로는 인삼 다당체를 처리하지 않고 배지만 가하였으며, 7일 후 광학 현미경으로 50개 이상의 세포로 구성된 콜로니만을 세었다. 인삼 다당체가 함유되지 않은 배지에서 배양하였을 때 40.67개의 콜로니를 확인할 수 있었으나 인삼 다당체를 50㎍/㎖ 가하여 배양하였을 때 64.67개의 콜로니를 형성함으로써 1.59배의 증가를 나타냈다(표 3 참조).

인삼 다당체에 의한 골수모세포(GM-CFU) 생성 작용

배 양	GM-CFU 콜로니 수 ±표준편차
골수세포	40.67 ±4.67
골수세포 + 인삼 다당체 (100㎍/㎖)	62.33 ±1.20
골수세포 + 인삼 다당체 (50㎍/㎖)	64.67 ±2.91
골수세포 + 인삼 다당체 (10㎍/㎖)	54.00 ±3.51

(실시예 2) 골수방어시험

1) 방사선 유발 조혈 장해 억제 작용

체중이 18∼22g인 자성 BALB/c마우스를 아크릴 상자에 가둔 후 97.1cGy/분으로코발트 감마선(⁶⁰Co γ-ray)을 전신에 조사하였다. 인삼 다당체는 인산완충용액(PBS, pH7.4)에 적정 농도로 녹여 0.45㎛ 일회용 여과필터(corning, NY)로 여과한 다음 동물에 투여하기 전까지 4℃에서 보관하였다. 대조군은 PBS를 투여하였으며 모두 복강 내 주사로 1회 0.4㎖이 넘지 않도록 조제하였다. 채혈은 마우스의 안구 기저부 정맥총에서 헤파린이 처리된 모세 유리관(Chase instruments corp., Norcross, GA)을 이용하여 신속히 채혈하였으며 K₃-EDTA 처리된 3 ㎖ 채혈관에 모아 자동 혈구 측정기인 cell-DYN 4000으로 말초 혈액을 검사하였다.

① 방사선 조사 후 골수 및 비장 세포수에 대한 영향

준 치사선량인 4.5 Gy를 조사한 후 5일째 마우스를 희생시켜 골수와 비장 세포를 얻은 다음, 트리판 블루 배제법으로 각각의 세포 수를 측정하였다. PBS를 투여한 대조군은 방사선 조사 후 5일째 골수 세포가 정상군 마우스의 62% 수준으로 감소되었으며, 인삼 다당체를 방사선 피폭 24시간 전에 100㎎/㎏로 투여한 군에서는 정상의 78%에 해당하는 수치를 나타냈다. 비장 세포는 방사선에 훨씬 민감한 변화를 보였으며 방사선 단독 조사군이 정상군의 8% 수준으로 감소되었다. 이에 비해 인삼 다당체 100㎎/㎏를 투여한 군에서는 방사선 단독 조사군의 1.8배(P〈0.01)에 해당하는 수치를 나타냈다(도 10 참조).

② 골수모세포 생성 작용 (Granulocyte macrophage-colony forming unit, GM-CFU)

방사선을 조사하기 24시간 전에 PBS 및 인삼 다당체를 100㎎/㎏, 200㎎/㎏로 마우스의 복강내 주사한 다음 준 치사선량의 방사선을 전신 조사하고 5일째 마우스를 희생시켜 GM-CFU를 측정하였다. GM-CFU는 위에서 기술한 방법과 동일하게 실험하였다. 5일째 방사선 단독 조사군은 정상군에 비해 17% 수준으로 증식능이 현저히 떨어졌으며 인삼 다당체 투여군에서는 정상군의 63-80%로 방사선 단독 조사군의 3.7∼4.7배(P〈0.05)에 해당하는 정도로 빠른 회복을 나타냈다(표 4 참조).

인삼 다당체 투여시 방사선 조사 마우스의 GM-CFU 증가 실험

배 양	GM-CFU 콜로니 수 ±표준편차
정상마우스의 골수세포	59.33 ±2.29
방사선조사 마우스의 골수세포	10.00 ±1.14
방사선 조사 전 인삼 다당체 투여(100㎎/㎏) 마우스의 골수세포	47.33 ±3.96**
방사선 조사 전 인삼 다당체 투여(200㎎/㎏) 마우스의 골수세포	37.17 ±2.77*

③ 말초 혈액 수치의 개선 효과

방사선 조사 후 5일째 말초 혈액 세포의 변화를 보면 백혈구가 3.463± 0.236에서 0.476±0.034 x10³/㎕로 86% 감소하였다. 혈소판의 수치도 585.0±39.0에서 354.5±26.0 x10³/㎕로 정상군의 60% 수준으로 줄어들었으며, 과립구수와 임파구수가 정상군의 10%정도로 감소하였다. 100㎎/㎏ 인삼 다당체 투여군은 방사선 단독 조사군에 비해 백혈구수가 2배 정도 증가하였으며(P〈0.001) 특히 과립구수의 증가가 두드러진다(표 5 참조).

준치사량의 방사선 피폭 마우스의 5일째 인삼 다당체의 말초 혈액 개선 효과

혈 구	정상군	방사선 조사군
혈 구	정상군	PBS 대조군	100㎎/㎏인삼다당체	200㎎/㎏인삼다당체
백혈구수×10³/㎕	3.463 ±0.236	0.476 ±0.034	0.948 ±0.111*	0.793 ±0.055*
과립구수×10³/㎕	0.367 ±0.043	0.0404 ±0.005	0.182 ±0.028*	0.271 ±0.037
임파구수×10³/㎕	2.975 ±0.259	0.330 ±0.041	0.680 ±0.099⁺	0.378 ±0.036
적혈구수×10³/㎕	8.565 ±0.121	7.550 ±0.379	7.935 ±0.145	7.663 ±0.131
혈소판수×10³/㎕	585.0 ±39.0	354.5 ±26.0	441.5 ±38.2	360.1 ±20.4

결과는 평균 표준오차로 나타내었으며 방사선 조사 마우스의 경우 군당 12마리를, 정상군의 경우 6마리를 사용하였다.

* PBS대조군에 비해 P〈0.001로 유의적인 증가를 나타내었음 .

⁺PBS대조군에 비해 P〈0.05로 유의적인 증가를 나타내었음.

④ 비장 콜로니 형성 유니트(Colony forming unit-spleen) 증가 작용

4.5 Gy의 방사선을 조사하기 24시간 전에 PBS와 인삼 다당체 100㎎/㎏을 주사하고(5마리/군) 5일째 치사시켜 골수 세포를 얻은 다음 9 Gy의 방사선을 쪼인 마우스(10마리/군)에 골수 이식을 하였다. 8일째 비장에 생긴 콜로니 수를 보면 PBS 대조군은 하나도 생기지 않은 반면 인삼 다당체 투여군은 17.47 ±2.33 (P=0.012)개로 확실한 효과를 나타냈다. 정상적인 마우스의 골수를 이식한 경우 39개 정도의 콜로니를 확인할 수 있었다(표 6 참조).

인삼 다당체의 CFU-s 형성능 측정

시험군	CFU-s/1 x 10⁵골수 세포
정상군	39.25 ±4.26
방사선 조사군	검출되지 않음
방사선 조사 전 인삼 다당체 투여군(100㎎/㎏)	17.47 ±2.33

2) 항암제 유발 조혈 장해 억제 작용

① 싸이클로포스파마이드(cyclophosphamide)와 병용 투여 시 골수 및 비장 세포수, GM-CFU측정

싸이클로포스파마이드 투여(250㎎/㎏)후 24시간째에 인삼 다당체 50㎎/㎏를 복강 내 투여하였으며 9일째 마우스를 희생시켜 골수 세포와 비장 세포를 얻은 다음, 트리판 블루 배제법(trypan blue exclusion)으로 각각의 세포 수를 측정하였다. 싸이클로포스파마이드 투여시 골수 세포의 경우는 정상보다 24% 정도 감소하였으나 유의적인 변화를 볼 수 없었다. 비장 세포수는 싸이클로포스파마이드 투여시 정상의 68% 선으로 세포 수를 유지하였으며, 인삼 다당체를 투여하였을 때는 골수 세포 수에는 유의적인 변화가 없었지만 비장 세포수는 싸이클로포스파마이드 투여군보다 2.1배(P〈0.01) 증가하였음을 확인하였다. GM-CFU는 싸이클로포스파마이드 단독 투여시 19.25 ±1.93으로 정상 수준(46.50 ±6.31)의 40% 정도를 나타내었으며, 골수 세포수의 변화에 비해서 훨씬 감소하는 것을 알 수 있었다(P〈0.001). 인삼 다당체 투여군에서는 37.25 ±4.57로 싸이클로포스파마이드 단독 투여군에 비해 1.94배 증식시키는 것으로 나타났다(표 7 참조).

인삼 다당체와 싸이클로포스파마이드 병용 투여시 골수 세포 및 비장 세포수, GM-CFU의 증가 실험

시험군	골수 세포 수(x 10⁶) ±표준편차	비장 세포 수(x 10⁷) ±표준편차	GM-CFU콜로니 수 ±표준편차
정상군	30.72 ±1.39	17.53 ±0.77	46.50 ±6.31
싸이클로포스파마이드처리군	23.36 ±1.61	11.99 ±2.35	19.25 ±1.93
싸이클로포스파마이드 처리후 인삼 다당체 투여군	25.66 ±2.37	25.65 ±1.55	37.25 ±4.57

(실시예 3) 암세포 살해 면역세포 생성작용

1) 자연살해세포 생성작용

C3H/HeN 마우스 5 마리를 한 그룹으로 하여 인삼 다당체를 10, 50 100, 200㎎/㎏로 복강내 주사한 다음 24시간 후에 비장세포를 꺼내 자연살해세포 생성능을⁵¹Cr 유리법으로 확인하였다. 대조군에는 PBS를 주사하였으며 96웰 배양용기에 작동세포와 표적세포를 100:1, 30:1. 10:1의 비율로 분주한 다음 37℃에서 4시간 배양하였다. 표적세포인 Yac-1 암세포에 대한 살해능 (작동세포:암세포=100:1)을 측정한 결과, 대조군에서는 Yac-1를 12.1% 살해하였으나 인삼 다당체를 100㎎/㎏로 처리한 군에서는 암세포에 대해 42.4%(3.5배)의 높은 살해능을 나타내었다(표 8 참조).

인삼 다당체에 의한 자연살해세포 생성 효과

시 험 군	Yac-1 암세포 살해능(%)(작동세포:암세포=100: 1)
대조군	12.1 ±0.2
인삼 다당체 투여군(10㎎/㎏)	18.4 ±2.4
인삼 다당체 투여군(50㎎/㎏)	25.3 ±0.5
인삼 다당체 투여군(100㎎/㎏)	42.4 ±3.6
인삼 다당체 투여군(200㎎/㎏)	12.4 ±1.2

2) 암세포 살해 임파구 생성 작용

MOPC 315 plasmacytoma 세포주(American Type Culture Collection, Rockville, MD)를 항생제(penicillin, streptomycin)와 10% 태아우혈청(FCS)이 함유된 Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM)에서 배양하였다. Balb/c마우스에 마리당 1×10⁶개의 MOPC315 세포를 피하주사한 다음, 3일 후부터 인삼 다당체를 50, 10, 2㎎/㎏로 격일 4회 복강내 투여하였다. 14일 후에 비장을 떼어내어⁵¹Cr 유리법에 의한 세포독성실험을 수행하였다. 3×10⁶개의 비장세포에⁵¹Cr이 표지된 MOPC 315세포에 대한 살해능(임파구:암세포=100:1)을 측정한 결과, 인삼 다당체를 투여하지 않은 마우스는 암세포를 0.9 % 살해하였으나 인삼 다당체를 50, 10, 2㎎/㎏ 투여한 마우스에서는 각각의 농도에 따라 17.8, 22.4, 18.6 %의 암세포 살해 독성을 나타내었다(표 9 참조).

생체내 인삼 다당체 투여에 의한 세포독성 임파구 생성 효과

시험군	MOPC 315 암세포 살해능(%)(작동세포:암세포=100: 1)
대조군	0.9 ±0.2
인삼 다당체 50㎎/㎏, 4회 투여군	17.8 ±1.2
인삼 다당체 10㎎/㎏, 4회 투여군	22.4 ±1.6
인삼 다당체 2㎎/㎏, 4회 투여군	18.6 ±1.0

3) 암세포에 대한 대식세포의 세포독성 시험

C3H/HeN 마우스에서 복강내 대식세포를 분리하여 96웰 배양용기에 2×10⁶세포/웰로 3시간 부착시킨 다음 인삼 다당체를 가하고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다. 인삼 다당체를 세척하여 제거하고 Yac-1 암세포 1×10⁵개/웰을 2μCi/웰의³H-티미딘을 함께 넣어 24시간 동안 더 배양한 다음 Yac-1의 증식억제정도를 측정하였다. 인삼 다당체가 함유되지 않은 배지에서 대식세포를 배양한 경우 Yac-1 암세포를 16% 살해하였으나 인삼 다당체를 100, 50, 10㎍/㎖의 농도로 처리한 경우에는 각각 60, 69, 53%의 암세포 살해능을 보였다(표 10 참조).

인삼 다당체에 의한 대식세포의 암세포 살해능 증강 효과

배 양	Yac-1 암세포 살해능(%)
대식세포	15.9 ±4.1
대식세포 + 인삼다당체(100㎍/㎖)	52.6 ±5.0
대식세포 + 인삼 다당체(50㎍/㎖)	69.2 ±2.6
대식세포 + 인삼 다당체(10㎍/㎖)	59.8 ±6.9

4) 생체내 항종양성 실험

Balb/c 마우스(10마리/군)에 MOPC 315 세포를 1×10⁶개씩 피하주사한 다음 3일째부터 인삼 다당체를 10, 2, 0.5㎎/㎏로 격일 8회 복강내 투여시 대조군에 비하여 30일째 종양크기가 각각의 용량에서 22%, 46%, 16% 감소하였다(도 11 참조).

5) 인삼 다당체의 암 예방효과

Balb/c 마우스 50마리를 한 군으로 하여 생후 24시간 이내에 화학적 발암물질인 벤조피렌 0.5㎎씩 견갑부에 주사하고 생후 3주부터 이유시켜 인삼 다당체를 식수 1㎖당 10㎎, 2㎎, 1㎎의 농도로 용해하여 마우스에 투여하고 9주 째에 마우스를 치사시켜 폐를 적출하였다. 적출된 폐를 부앙용액(Bouin's fixative)에 고정시켜 폐선종수를 현미경하에서 관찰하였다. 각각의 인삼 다당체 농도에서 폐선종 발생율이 45%, 23%, 31% 감소되었다(표 11 참조).

벤조피렌에 의해 유발된 동종 암세포에 대한 인삼 다당체의 암 예방효과

시험군	폐선종 발생율(%)
벤조피렌	60
벤조피렌 + 인삼다당체(10㎎/㎖)	44
벤조피렌 + 인삼다당체(2㎎/㎖)	22
벤조피렌 + 인삼다당체(0.5㎎/㎖)	30

6) 인삼 다당체에 의한 사이토카인 전사 RNA(mRNA)의 생성

2 ×10⁶세포/㎖의 C3H/HeN 마우스 비장세포를 여러 가지 농도의 인삼 다당체(5㎍/㎖, 50㎍/㎖, 200㎍/㎖)가 함유된 6웰 배양용기에 취하여 1, 3, 6, 24시간 배양한 후 원심분리하여 세포를 세척하고 총 RNA를 분리하여 정량하였다. 이 중 1㎍을 취하여 상보되는 DNA를 합성하고(역전사, reverse transcription), 발현을 보고자 하는 싸이토카인의 시발체(primer)와 함께 DNA 합성효소(polymerase)존재하에 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다. 그 산물을 에티디움 브로마이드(ethidium bromide, 염색제)가 존재하는 1% 아가로즈 젤 상에서 전기영동하여 싸이토카인의 전사 RNA 발현을 측정하였다. T 헬퍼 타입 1세포(Th1 cell)에서 분비되는 IL-2, IFNγ, IL-12의 증가와 T 헬퍼 타입 2세포(Th 2 cell)의 IL-4, IL-5, IL-10, 대식세포에서 분비되는 염증매개 싸이토카인인 TNFα, GM-CSF, IL-1β의 증가를 세포내에서 일정하게 존재하는 β-액틴(actin)을 표준으로 하여 확인하였다(도 12 참조).

(실시예 4) 방사선 민감 작용

1) 질소산화물 생성 시험

NO의 방사선 민감성에 대하여는 잘 알려져 있으므로, 인삼 다당체, IFN 그리고 인삼 다당체와 IFN-γ를 동시에 처리한 마우스 페암세포주 Line 1에서 생성되는 질소산화물의 최종산물인 NO₂ ^-의 양을 측정하였다. 96웰 배양용기에 5×10⁴세포/웰로 분주한 다음 인삼 다당체(50㎍/㎖), IFN-γ(50 U/ml)를 처리하고 24시간 배양한 다음, 100㎕의 세포 상등액을 100㎕의 그리스 시약 (0,1% naphthylethylene diamine dihydrochloride in H₂O : 1 % sulfanilamide in 5% H₃PO₄=1 : 1)과 섞어 상온에서 10분간 반응시킨 후, 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 아질산나트륨(NaNO₂)을 사용하여 표준 용량 곡선을 작성하여 대상 시약 처리에 의한 질소산화물의 양을 측정하였다. IFN-γ를 처리한 경우 NO₂ ^-생성은 16.7μM이고, 인삼 다당체를 100㎍/㎖처리한 경우 NO₂ ^-는 21.6μM 생성되었으며 병용처리하였을 때 상가적인 작용을 나타내었다(도 13 참조).

2) 인삼 다당체의 방사선 민감성 측정

마우스 폐암 세포주인 Line-1을 지름 6cm 배양용기에 분주한 다음 인삼 다당체, IFN-γ, 혹은 인삼 다당체와 IFN-γ를 동시에 처리하여 16시간 동안 배양한 다음 방사선을 조사하였다. 7일 동안 배양한 후 1% 메틸렌블루-메탄올 용액으로 염색하여 콜로니수를 세었다.

방사선 민감도 증가율(Enhancement Ratio, ER)은 생존율(surviving fraction)이 1%일 때의 약물이 처리되지 않은 상태의 방사선 조사용량을 약물이 처리된 상태의 방사선 조사용량으로 나눈 값이다. 인삼 다당체(100㎍/㎖)와 IFN-γ (50 U/ml)를 처리했을 경우, Line1 세포에서의 ER은 각각 1.28과 1.14이고, 두 가지를 동시에 처리해 준 경우의 ER은 1.66이다(도 14 참조).

3) 생체내 방사선 민감 작용

Line1 세포를 Balb/c 마우스에 2×10⁶개 이식한 후 종양의 평균 부피가 1000 mm³에 이르렀을 때, 생리식염수 혹은 인삼 다당체(200 mg/kg)를 복강내로 격일 3회 주사한 다음 20 그레이의 방사선을 조사하였다. 방사선 조사군의 경우 종양이 대조군에 비하여 20%억제되나, 인삼 다당체 투여군에 방사선을 조사한 경우, 종양이 대조군에 비하여 45% 억제되는 것을 보여주었다(도 15 참조).

(실시예 5) 인삼 다당체의 급성 독성 시험

인삼 다당체의 급성독성을 알아보기 위하여, 10마리를 1군으로 하여 BALB/c 웅성 마우스에 인삼 다당체를 2g/㎏, 1g/㎏, 200㎎/㎏ 및 40㎎/㎏의 용량으로 복강내 주사하고, 주사한 다음 날부터 죽은 마우스의 수 및 육안으로의 이상여부를 30일간 관찰하였으며, 그 결과는 다음과 같다(표 12 참조).

독성시험 결과

인삼 다당체의 용량	2 g/㎏	1 g/㎏	200㎎/㎏	40㎎/㎏
죽은 마우스의 수	0	0	0	0

통상적으로 사용되는 담체를 사용하여 각종의 용량 형태, 예를 들어, 정제, 산제, 과립제, 캅셀제, 환제, 액제, 주사제 등의 형태로서, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다.

본 발명의 인삼 다당체의 임상학적 용량은 환자의 상태, 체중, 나이, 성별 등을 고려하여 적절히 결정하되, 일반적으로 100∼1,000 ㎎/일/60㎏(체중)의 용량으로 사용될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기 새로운 조성의 인삼 다당체를 이용하여 조혈 촉진 및 골수방어효과로 항암제나 방사선 치료시 발생하는 임파구, 과립구, 혈소판수의 감소에 의한 부작용을 감소시키고 골수 세포 수를 증가시켜 회복을 촉진함으로써 병용 투여시 치료 효과를 상승시킬 수 있으며 방사선 피폭에 의한 골수장애 방어제로 사용될 수 있다. 또한 자연살해세포와 암 세포 살해 임파구를 생성하고, 대식세포를 활성화함으로써 암 면역 치료제 및 암 예방제로도 유용하다. 또한 질소산화물을 생성함으로써 방사선 민감도를 증대시켜 암세포에 대한 방사선 치료효능을 상승시키므로 방사선 민감제로 사용될 수 있다.

Claims

인삼 뿌리 분말 1중량부에 대해 2∼4 중량부의 메탄올로 추출한 다음, 메탄올 불용성 잔사를 음건한 후, 3∼5 중량부의 증류수를 가하여 추출하고, 수 가용성 분획을 수득한 후 동결건조시키고, 상기 수득물에 에탄올을 가하여 40% 에탄올 불용성 분획을 수득한 후 이를 셀룰로오스 투석막으로 투석시켜 내부 분획을 세파크릴 S-500 크로마토그래피, DEAE-셀룰로오스 컬럼 크로마토그래피하여 분리정제한 다당체로 분자량 1,800,000∼2,200,000, 1,350,000∼1,650,000, 620,000∼780,000, 105,000∼130,000, 23,000∼27,000 및 5,000∼6,000 달톤의 다당체가 각각 11.4∼13.4 : 3.6∼4.2 : 4.5∼5.1 : 0.7∼0.9 : 40.1∼48.1 : 31.0∼37.0 으로 존재하며 글루코피라노오스가 α(1→6)으로 결합한 주사슬에 글루코피라노오스가 α(1→3) 결합한 가지사슬을 가진 구조로 조혈촉진 효과, 골수방어효과, 암 세포 살해 면역세포 생성 효과, 암 예방 효과 및 방사선 민감 효과가 우수한 인삼 다당체
제 1항에 있어서, 상기 다당체는 당 성분 함량 98.5 중량% 이상 및 단백질 함량 1.0 중량% 미만을 지님을 특징으로 하는 인삼 다당체
제 1항의 인삼 다당체를 이용하는 조혈 촉진제, 골수 방어제, 방사선 부작용 억제제, 항암제 부작용 억제제, 항암 면역치료제, 암 예방제 및 방사선 민감제