DE60035406T2 - Hämatopoietisches, das mark schützende, antitumor-immunzellen erzeugendes und radiosensibilisierendes polysaccharid aus panax ginseng - Google Patents

Hämatopoietisches, das mark schützende, antitumor-immunzellen erzeugendes und radiosensibilisierendes polysaccharid aus panax ginseng Download PDF

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, aus Panax ginseng isoliertes Polysaccharid mit hämatopoetischen, myeloprotektiven, Antitumor-Immunzellen-erzeugenden und radiosensibilisierenden Wirkungen. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Herstellung des Polysaccharids aus Panax ginseng und eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Verstärken der hämatopoetischen, myeloprotektiven, Antitumor-Immunzellen-erzeugenden und radiosensibilisierenden Wirkungen.
  • Genauer gesagt wird das aus Panax ginseng isolierte Polysaccharid der vorliegenden Erfindung durch ein Herstellungsverfahren erhalten, welches die folgenden Stufen umfaßt: i) Erhalten eines Rückstands unter Verwendung von Methanol, ii) Extrahieren und erhalten der wasserlöslichen Fraktion unter Verwendung von destilliertem Wasser, iii) Erhalten eines Präzipitats unter Verwendung von 40%-igem Ethanol und iv) Erhalten des Polysaccharids unter Verwendung einer Dialysemembran, v) Erhalten von 6 Fraktionen mittels Sephacryl S-500-Gelchromatographie, vi) Reinigen des Polysaccharids mittels DEAE-Sephadex A-50-Chromatographie, bestehend aus 6 Polysaccharidarten mit Molekulargewichten von 1.800.000-2.200.000, 1.350.000-1.650.000, 620.000-780.000, 105.000-130.000, 23.000-27.000, 5.000-6.000 Dalton, in Verhältnissen von 11,4-13,4:3,6-4,2:4,5-5,1:0,7-0,9:40,1-48,1:31,0-37,0, hauptsächlich bestehend aus α(1→6)-verknüpften D-Glucopyranoseeinheiten mit Verzweigungen, die zum Teil an der C-3-Position verknüpft sind.
  • STAND DER TECHNIK
  • Vor der Ausarbeitung der vorliegenden Erfindung wurde über viele aus Panax ginseng extrahierte Polysaccharide berichtet. Das Folgende sind gut bekannte Berichte in diesem Bereich.
  • Panaxan, eines der aus D-Glucose bestehenden Glycane, wurde als aktiver Inhaltsstoff zum Absenken des Blutzuckerspiegels offenbart [Konno, C. et al., Isolation and hypoglycemic activity of Panaxan A.B.C.D. and E glycans of Panax ginseng roots, Planta Medica 50 S. 434-436, 1984]. Die Polysaccharide, umfassend Galacturonsäure, Glucose, Arabinose, Mannose und Galactose, wurden als Material mit antikomplementärer Wirkung offenbart [Gao, Q., Kiyohara, H. et al., Chemical properties and anti-complementary activities of polysaccharide fractions from roots and leaves of Panax ginseng, Planta Medica 55 S. 9-12, 1989]. Darüber hinaus wurde berichtet, daß das Polysaccharid aus Panax ginseng Antitumor- oder Bakterienresistenzwirkungen besitzt [offengelegtes japanisches Patent Nr. 1986-18722A1 ].
  • Die JP61109732 beschreibt ein aus einer Ginsengpflanze isoliertes Polysaccharid, welches die Expression von Tumorabtötungsfaktor (TKF) durch Makrophagenzellen fördern kann.
  • Dieses Dokument zeigt auch, daß das isolierte Polysaccharid zur Behandlung von Krebs in Säugern verwendet werden kann.
  • Die JP06239759 beschreibt ein aus einer Ginsengwurzel isoliertes Polysaccharid, welches das Zellwachstum von Säugern, Kaninchen und Mäusen in vivo fördern kann. Dieses Dokument zeigt auch, daß das isolierte Polysaccharid zur Behandlung von Hornhaut- oder Hautwunden verwendet werden kann.
  • Die JP02045499 beschreibt eine aus einer Ginsengpflanze isolierte Polysaccharidverbindung, die Saccharideinheiten, ausgewählt unter Arabinose, Xylose, Rhamnose, Fucose, Glucose, Galactose und Galacturonsäure, als diese bildende Verbindungen enthält. Das Polysaccharid kann als die Biophylaxefähigkeit förderndes Mittel verwendet werden, welches durch eine geringe Toxizität gekennzeichnet ist.
  • Die JP02045499 beschreibt ein aus einer Ginsengwurzel isoliertes Polysaccharid, welches Saccharide, ausgewählt unter Arabinose, Rhamnose, Mannose, Galactose, Glucose, Glucuronsäure, Galacturonsäure und anderen, enthält. Das Polysaccharid kann als sthenisches Mittel mit Biophylaxeeigenschaften verwendet werden.
  • Alle oben beschriebenen Polysaccharide wurden aus Panax ginseng extrahiert. Die Komponenten solcher Polysaccharide unterscheiden sich von denen der vorliegenden Erfindung. Des weiteren wurden aus Panax ginseng extrahierte Polysaccharide noch nie als Material zum Verstärken der hämatopoetischen, myeloprotektiven, Antitumor-Immunzellen-erzeugenden und radiosensibilisierenden Wirkungen offenbart.
  • Ansonsten gehören die wirksamen Materialien aus Panax ginseng zu den Saponinderivaten, die eine andere molekulare Struktur aufweisen als das Polysaccharid der vorliegenden Erfindung.
  • Von β-Glucan, das aus der Zellwand von Hefe abgetrennt wurde, ist bekannt, daß es eine hämatopoetische Wirkung besitzt, es hat jedoch eine andere molekulare Struktur als das Polysaccharid der vorliegenden Erfindung. Des weiteren wurde ein Pulver aus OK-432, hergestellt durch Hitzebehandlung der Zellinie Streptococcus pyrogenes Su, zusammen mit Lentinan, extrahiert aus Lentinus edodes, als biologische Antwortmodifizierer (BRM) offenbart, sie haben jedoch auch eine β-Glucan-Struktur.
  • Die vorliegende Erfindung wurde durch Reinigung und Isolierung eines Polysaccharids, welches das Wachstum hämatopoetischer Zellen fördert, myeloprotektive Wirkung, Antitumor-Immunzellen-erzeugende und radiosensibilisierende Wirkung zeigt, aus den Wurzeln von Panax ginseng ausgearbeitet.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Polysaccharidzusammensetzung mit hämatopoetischen, myeloprotektiven, Antitumor-Immunzellen-erzeugenden und radiosensibi lisierenden Wirkungen bereitzustellen, die aus den Wurzeln von Panax ginseng gereinigt wird, hergestellt durch die Stufen, in denen man:
    • i) einen Rückstand erhält, indem man 1 Gewichtsteil Ginsengwurzel mit 2-4 Gewichtsteilen Methanol extrahiert,
    • ii) eine wasserlösliche Fraktion aus dem Rückstand von Stufe i) extrahiert und erhält, wobei man 3-5 Gewichtsteile destilliertes Wasser verwendet,
    • iii) die in Stufe ii) erhaltene wasserlösliche Fraktion gefriertrocknet,
    • iv) nach Erhalten der unlöslichen Fraktion mit 40%-igem Ethanol aus der Stufe des Gefriertrocknens der Fraktion in Stufe iii) unter Verwendung einer Dialysemembran eine innere Fraktion erhält,
    • v) sechs Fraktionen durch Sephacryl-S-500-Gelchromatographie erhält und
    • vi) das Polysaccharid mittels DEAE-Sephadex-A-50-Chromatographie reinigt.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Polysaccharid bereitzustellen, welches aus sechs Polysaccharidarten besteht, die jeweils Molekulargewichte von 1.800.000-2.200.000, 1.350.000-1.650.000, 620.000-780.000, 105.000-130.000, 23.000-27.000 und 5.000-6.000 Dalton in Gewichtsverhältnissen von 11,4-13,4:3,6-4,2:4,5-5,1:0,7-0,9:40,1-48,1:31,0-37,0 haben, bestehend aus α(1→6)-verknüpften D-Glucopyranoseeinheiten mit teilweise α(1→3)-verknüpften Verzweigungen.
  • Ein Polysaccharid umfaßt auch eine Menge von mehr als 98,5% an Kohlehydraten und eine Menge von weniger als 1,0% an Protein nach quantitativer Bestimmung.
  • Das weitere Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine das Polysaccharid umfassende pharmazeutische Zusammensetzung zum Verstärken der hämatopoetischen, myeloprotektiven, Antitumor-Immunzellen-erzeugenden und radiosensibilisierenden Wirkungen bereitzustellen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt den Isolationsvorgang zum Erhalten des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung aus Panax ginseng.
  • 2 zeigt die teilweise Struktur des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung aus Panax ginseng.
  • 3 zeigt den Isolationsvorgang der sechs Arten von Polysaccharid der vorliegenden Erfindung mittels Sephacryl S-500-Gelchromatographie.
  • 4 zeigt das TLC-Muster des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung nach Säurehydrolyse.
  • 5 zeigt das IR-Spektrum des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung.
  • 6 zeigt das 1H-NMR-Spektrum des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung.
  • 7 zeigt das 13C-NMR-Spektrum des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung.
  • 8 zeigt das DQF-COSY-Spektrum des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung.
  • 9 zeigt das HMBC-Spektrum des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung.
  • 10 zeigt die Schutzwirkung des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung auf Myeloidzellen nach Bestrahlung mit 60Co-γ-Strahlen.
  • 11 zeigt die Anti-Tumor-Wirkung des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung in vivo.
  • 12 zeigt die verstärkende Wirkung des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung auf die Zytokin-mRNA-Expression.
  • 13 zeigt die Wirkung der Erzeugung von Stickstoffoxid in einer Krebszellinie durch das Polysaccharid der vorliegenden Erfindung.
  • 14 zeigt die radiosensibilisierende Wirkung des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung in einer Krebszellinie.
  • 15 zeigt die verstärkende Wirkung des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung auf die radiotherapeutische Effizienz.
  • BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
  • Das Isolationsverfahren der vorliegenden Erfindung ist in 1 veranschaulicht. Es folgt eine detaillierte Beschreibung des Extraktionsprozesses.
  • 1 Gew.-Teil Panax ginseng wurde mit 3 Gew.-Teilen Methanol extrahiert. Nach der Extraktion wurde ein Rückstand erhalten und im Dunkeln getrocknet. Dann wurde durch dreimalige Extraktion des Rückstands unter Verwendung von 4 Gew.-Teilen destilliertem Wasser bei 4°C für 24 Stunden und Gefriertrocknen eine wasserlösliche Fraktion erhalten. Die erhaltene wasserlösliche Fraktion wird in einer geringen Menge an destilliertem Wasser gelöst und dann mit 40%-igem Ethanol präzipitiert, wodurch eine unlösliche Fraktion erhalten wird. Dann wurde die Polysaccharidfraktion durch Dialyse gegen destilliertes Wasser unter Verwendung einer Zellulosemembran erhalten und gefriergetrocknet. Schließlich wurden die sechs Polysaccharidfraktionen mittels Sephacryl S-500-Gelchromatographie erhalten und mittels DEAE-Sephadex A-50-Chromatographie gereinigt (1-3).
  • 1) Bestimmung des Kohlehydratgehalts des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung
  • Der gesamte Kohlehydratgehalt des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung wurde durch das Phenol-Schwefelsäure-Verfahren mit D-Glucose als Standard bestimmt. Das Polysaccharid wurde in einer Konzentration von 0,1 mg/ml in destilliertem Wasser gelöst. Dann wurden 30 μl einer 5%-igen Phenollösung und 0,2 ml Schwefelsäurereagens unter Schütteln zu 20 μl Polysaccharidlösung zugegeben und bei 60°C für 20 Minuten umgesetzt. Die Absorption wurde bei 490 nm gemessen, und der Kohlehydratgehalt des Polysaccharids beträgt 98,5% im Vergleich zum Glucosestandard.
  • 2) Bestimmung des Proteingehalts des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung
  • Der Gesamtproteingehalt des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung wurde mit dem Bradford-Verfahren unter Verwendung eines Protein Assay Kits, Bio-Rad, Co. gemäß den Anlei tungen des Herstellers bestimmt. Der Proteingehalt des Polysaccharids betrug weniger als 1,0% im Vergleich zum Standard Rinderserumalbumin.
  • 3) Identifizierung von Zuckerkomponenten des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung mittels Dünnschichtchromatographie
  • 20 mg des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung wurden mit 2 ml 1M H2SO4 bei 100°C für 4 Stunden umgesetzt und mit Bariumhydroxid neutralisiert. Das Polysaccharid der vorliegenden Erfindung bestand hauptsächlich aus Glucose, ermittelt durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines gemischten Lösungsmittelsystems aus n-Propanol und Wasser (85:15, v/v) und detektiert mit Schwefelsäure. 4 zeigt, daß das Polysaccharid aus Glucose bestand.
  • 4) Bestimmung der Zuckeranalyse zum Messen der Komponenten des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung mittels Gaschromatographie
  • 20 mg des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung wurden in DMSO (2 ml) gelöst und für 5 Minuten bei 60°C unter N2-Gas umgesetzt. Methylsulfinylcarbanion (0,5 ml) wurde zu der Polysaccharidlösung zugegeben und bei 25°C für 1,5 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser dialysiert und mit Chloroform extrahiert, und die Methylierung wurde wiederholt, bis kein IR-Absorptionsband für die Hydroxylgruppe mehr erfaßt wurde. Das methylierte Polysaccharid wurde zuerst mit 90%-iger Ameisensäure (0,5 ml) für 8 Stunden bei 100°C und dann mit 2M Trifluoressigsäure (0,5 ml) für 3 Stunden bei 100°C hydrolysiert. Nach Reduktion mit Natriumborhydrid wurden die Alditiole durch Erhitzen mit 0,2 ml Essigsäure-Pyridin (1:1, v/v) für 2 Stunden bei 100°C acetyliert. Das Produkt wurde mit GS-MS untersucht, die unter Bedingungen unter Verwendung einer HP-5-Kapillarsäule bei 280°C durchgeführt wurde. Die Temperaturbedingungen des Injektors betrugen 280°C, und die Temperatur des Flammenionisationsdetektors betrug 300°C. Auf Basis dieser Ergebnisse besteht das Polysaccharid aus α(1→6)-verknüpften D-Glucopyranoseeinheiten mit teilweise in der 3-Position verknüpften Verzweigungen in einem Verhältnis von 10:1 (Tabelle 1). Tabelle 1. Bestimmung von Komponenten des Polysaccharids mittels GC-MS
    Derivate Retentionszeit (Min.) Fläche (%) Hauptfragmente (m/z)
    1,5-Ac-2,3,4,6-Me-D-Glucitol 8,31 7,7 43, 45, 71, 88, 101, 115, 129, 145, 161, 205
    1,5,6-Ac-2,3,4-Me-D-Glucitol 9,33 76,9 43, 71, 88, 101, 115, 129, 143, 161, 186
    1,3,5-Ac-2,4,6-Me-D-Glucitol 9,44 7,8 43, 87, 101, 127, 143, 186
    1,3,5,6-Ac-2,4-Me-D-Glucitol 10,74 7,6 43, 71, 88, 101, 115, 129, 143, 161, 186
    • Ac = Acetyl, Me = Methyl
  • 5) Bestimmung des Molekulargewichts des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung
  • Gelpermeationschromatographie des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung wurde mit einem Hewlett-Packard HP-600S durchgeführt. Die mobile Phase war 0,1 M Natriumcarbonatlösung mit einer Flußrate von 1,5 ml/Min., und die Zucker wurden mit einem Brechungsindexdetektor überwacht. Das Molekulargewicht wurde durch Vergleichen der Elutionszeit und der Fläche mit Standard-Polysacchariden, wie Dextran T2000 (MW 2.000.000 Dalton), T500 (MW 500.000 Dalton), T70 (MW 70.000 Dalton, T40 (MW 40.000 Dalton) und T10 (MW 10.000 Dalton, erworben von Amersham Pharmacia Biotech., bestimmt. Tabelle 2 zeigt, daß das Polysaccharid der vorliegenden Erfindung Molekulargewichte von 1,8-2,2 × 106, 1,35-1,65 × 106, 6,2-7,8 × 105, 1,05-1,3 × 105, 2,3-2,7 × 104, 5,0-6,0 × 103 Dalton in Verhältnissen von 11,4-13,4:3,6-4,2:4,5-5,1:0,7-0,9:40,1-48,1:31,0-37,0 hatte. Tabelle 2. Bestimmung des Molekulargewichts des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung mittels Gelpermeationschromatographie
    Fraktion Retentionszeit (Min.) Molekulargewicht (Dalton) Fläche (%)
    G I 10,012 1,8-2,2 × 106 11,4-13,4
    G II 10,658 1,35-1,65 × 106 3,6-4,2
    G III 12,230 6,2-7,8 × 105 4,5-5,1
    G IV 14,459 1,05-1,3 × 106 0,7-0,9
    G V 18,693 2,3-2,7 × 104 40,1-48,1
    G VI 21,997 5,0-6,0 × 103 31,0-37,0
  • 6) Anwendung von Fourier-Transformations-Infrarot-(FT-IR-)Spektroskopie zur Charakterisierung des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung
  • Das IR-Spektrum des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung eines Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskops, Bomem DA8.12, Hartman and Braun, Co., Kanada, unter Verwendung von KBr gemessen. Das IR-Spektrum (5) zeigt ein breites Absorptionsband bei 3400 cm-1, was eine Hydroxylgruppe (-OH) anzeigt, ein Absorptionsband bei 1000-1100 cm-1, was eine Estergruppe (C-O) anzeigt, und ein Absorptionsband bei 2800-2900 cm-1, was Kohlenwasserstoffe anzeigt.
  • 7) Anwendung von NMR-Spektroskopie zur Erläuterung der Struktur des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung
  • Das NMR-Spektrum des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung wurde für ein D2O-Lösungsmittel mit 500 MHz-Kernmagnetresonanzspektroskopie, Bruker AMX 500, Deutschland, erhalten. Das Protonenkernmagnetresonanz-(1H-NMR-)Spektrum zeigte ein typisches Spektrum von Glucose, welches sich aufgrund von hydroxylierten Methin- oder Methylenprotonen bei δ 3,5-4,2 und aufgrund der anomeren Wasserstoffprotonensignale bei δ 4,76 (Dublett, J = 2,6 Hz) und 4,98 (Dublett, J = 3,0 Hz) (6) zeigte. Das Verhältnis der Wechselwirkung betrug 10:1. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, daß D-Glucoseeinheiten α-verknüpft sind. Das 13C-NMR- Spektrum (7) zeigte 6 starke Kohlenstoffsignale (δ 62,6, 66,0, 77,8, 78,9, 82,8 und 106,7) und 12 schwache Kohlenstoffsignale (δ 63,0, 64,8, 63,6, 65,1, 72,3, 76,9, 77,3, 79,2, 82,1, 83,6, 83,8, 106,1, 106,2 und 106,7). Von diesen Signalen absorbierten C-6-Kohlenstoffsignale bei δ 62,6, 64,8 und 65,1, C-3-Kohlenstoffsignale absorbierten bei δ 82,9, 83,6 und 83,8. Die C1-Kohlenstoffsignale zeigten sich bei δ 106,7, 106,1 und 106,2. Diese spektralen Eigenschaften des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung zeigten, daß α-D-Glucoseeinheiten an den 1-, 3- und 6-Positionen verknüpft sind. Dieses Ergebnis deutete darauf hin, daß dieses Polysaccharid aus einer großen Hauptkette mit wenig Verzweigung besteht.
  • Alle Kohlenstoffe und Protonen wurden durch Heteronuclear Multiple Quantum Correlation-(HMQC-)Experimente angepaßt. Die Protonen und die Protonenkorrelation wurden mittels 1H-1H-COSY-Experimenten bestimmt (8). Das Protonensignal bei δ 3,89 war mit δ 3,56 spin-gekoppelt, δ 4,10 war mit δ 4,19 spin-gekoppelt, δ 3,67 war mit δ 3,79 und δ 4,10 spin-gekoppelt, und δ 3,69 war mit δ 3,79 spin-gekoppelt. So wurde herausgefunden, daß das Polysaccharid α(1→6)-Glucopyranoseverknüpfungen aufweist. Die Long-Range-C-H-Kopplungen wurden in Heteronuclear Multiple Bond Coherence-(HMBC-)Experimenten beobachtet, wie in 9 gezeigt. Das Kohlenstoffsignal bei δ 66,0 zeigte eine Korrelation mit dem Methinproton bei δ 4,10, das Kohlenstoffsignal bei δ 82,8 zeigte eine Korrelation mit dem Proton bei δ 3,56 und 4,10, das Kohlenstoffsignal bei δ 71,8 zeigte Korrelationen mit Protonen bei δ 4,19, das Kohlenstoffsignal bei δ 78,9 zeigte Korrelationen mit Protonen bei δ 3,79 und 4,10, das Kohlenstoffsignal bei δ 62,6 zeigte Korrelationen mit Protonen bei δ 4,19, und das Kohlenstoffsignal bei δ 106,7 zeigte eine Korrelation mit Protonen bei δ 3,79. Aus diesen Ergebnissen wurde eine α(1→6)-Glucopyranoseverknüpfung identifiziert.
  • Bei Untersuchung der physikochemischen und spektroskopischen Eigenschaften der vorliegenden Erfindung wurde die Struktur als α(1→6)-verknüpfte D-Glucopyranoseeinheit mit teilweisen Verzweigungen in der 3-Position in einem Verhältnis von 10:1 identifiziert (2).
  • Das aus Panax ginseng isolierte Polysaccharid kann in verschiedenen Mitteln verwendet werden, beispielsweise in einem Mittel zum Fördern des Wachstums hämatopoetischer Zellen, einem das Myeloid schützenden Mittel, einem Hemmstoff gegenüber Unterdrückung von hämatopoetischen Zellen, induziert durch Radio- oder Chemotherapie, einem Mittel für die Anti-Tumor-Immuntherapie, einem Mittel zur Prävention gegen Krebs und einem Mittel zum Verstärken der therapeutischen Wirksamkeit von Radiotherapie.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele ausführlicher erläutert. Es versteht sich jedoch, daß die Beispiele die Erfindung veranschaulichen, ihren Schutzumfang jedoch in keinster Weise beschränken sollen.
  • BEISPIELE
  • (Beispiel 1) Test zum Fördern des Wachstums hämatopoetischer Zellen
  • 1) Erzeugen der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-bildenden Einheit, GM-CFU
  • Knochenmarkzellen (1 × 105/Schale) wurden in 35 mm-Gewebekulturschalen (mit 2 mm-Raster, Nalge Nunc. International, Corning, NY, USA), die Iscoves modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM), ergänzt mit 0,3% Agar, 20% Pferdeserum und 10% rekombinantem GM-CSF, enthielten, ausplattiert. Polysaccharide der vorliegenden Erfindung wurden entsprechend der Konzentration behandelt, und die Kulturen wurden für 7 Tage bei 37°C in 5% CO2 in Luft gehalten. Kolonien von mehr als 50 Zellen wurden gewertet. Tabelle 3 zeigt, daß die Anzahl an GM-CFU von 40,67 in der Kontrolle auf 64,67 Kolonien in der Kultur mit Ginseng-Polysaccharid in einer Menge von 50 μg/ml anstieg. Tabelle 3. Steigerung der Anzahl an GM-CFU in Knochenmarkzellen durch Kultivieren mit dem Polysaccharid der vorliegenden Erfindung
    Behandlung Anzahl an GM-CFU-Kolonien ± SD
    Knochenmarkzellen 40,67 ± 4,67
    Knochenmarkzellen + Ginseng-Polysaccharid (100 μg/ml) 62,33 ± 1,20
    Knochenmarkzellen + Ginseng-Polysaccharid (50 μg/ml) 64,67 ± 2,91
    Knochenmarkzellen + Ginseng-Polysaccharid (10 μg/ml) 54,00 ± 3,51
  • (Beispiel 2) Test auf myeloprotektive Wirkung
  • 1) Eigenschaft der Hemmung der Unterdrückung von hämatopoetischen Zellen, induziert durch Bestrahlung
  • Weibliche BALB/c-Mäuse mit einem Gewicht von 18-22 g wurden in eine Acrylbox gesetzt und 60Co-γ-Bestrahlung in einer Dosierungsrate von 97,1 cGy/Min. ausgesetzt. Das Polysaccharid der vorliegenden Erfindung wurde in Phosphatpufferlösung (PBS, pH 7,4) gelöst, unter Verwendung von 0,45 μm-Millipore-Membranen (Corning, NY) filtriert und bei 4°C bis zur Verabreichung an die Mäuse gelagert. Die geeigneten Konzentrationen von Polysaccharid in einem Volumen von 0,2 ml wurden mittels intraperitonealer Injektion an normale Mäuse verabreicht. Kontrolltiere erhielten zur gleichen Zeit 0,2 ml PBS. Blut wurde mit einem heparinisierten Kapillarröhrchen (Chase Instruments Corp., Norcross, GA) aus den Augenlidern der Mäuse entnommen. Eine Blutzellanalyse wurde unter Verwendung eines automatischen Blutzellanalysators, Zell-DYN 4000, durchgeführt.
  • ➀ Auswirkung auf Knochenmark- und Milzzellstruktur nach Bestrahlung
  • Fünf Tage nach Bestrahlung mit 4,5 Gy wurde die Anzahl an Knochenmark- und Milzzellen in den Mäusen gemessen. Die Anzahl aller Zellen wurde jeweils durch das Trypan-Blau-Ausschlußverfahren bestimmt.
  • Die Anzahl an Milzzellen und Knochenmarkzellen in den bestrahlten Kontrollmäusen, denen nur PBS verabreicht worden war, betrug weniger als 10% bzw. 62% in den nicht-bestrahlten normalen Mäusen. Diese Werte erhöhten sich in der Milz um das 1,8-fache und in der Knochenmarkzellstruktur um das 1,3-fache im Vergleich zu Mäusen, denen 24 Stunden vor der Bestrahlung das Polysaccharid in einer Menge von 100 mg/kg injiziert worden war. 10 zeigt die Ergebnisse.
  • ➁ Frühe Erholung der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-bildenden Einheit (GM-CFU) nach subletaler Bestrahlung
  • Das Polysaccharid der vorliegenden Erfindung wurde in PBS gelöst und mittels intraperi tonealer Injektion 24 Stunden vor der Bestrahlung in einer Menge von 100 mg/kg oder 200 mg/kg verabreicht. Dann wurden die Mäuse mit einer subletalen Dosis von 4,5 Gy bestrahlt. Die Anzahl an GM-CFU wurde am fünften Tag nach der Bestrahlung gemessen.
  • Tabelle 4 zeigt, daß die Anzahl an GM-CFU in den bestrahlten PBS-Kontrollmäusen mit 17% des normalen Werts ohne Bestrahlung sehr niedrig war, wohingegen es zu einer deutlichen Zunahme von GM-CFU in der Gruppe mit Verabreichung von Polysaccharid von bis zu 63-80% des Normalwerts kam. Dies zeigt, daß sich die Gruppe mit Verabreichung von Polysaccharid im Vergleich zur Kontrollgruppe 3,7- bis 4,7-mal früher erholt. Tabelle 4. Auswirkung des Polysaccharids auf die Anzahl an GM-CFU in Knochenmarkzellen nach Bestrahlung
    Gruppe Anzahl an GM-CFU-Kolonien ± SD
    KM-Zellen von nicht-bestrahlten normalen Mäusen 59,33 ± 2,29
    KM-Zellen von bestrahlten PBS-Kontrollmäusen 10,00 ± 1,14
    KM-Zellen von bestrahlten Mäusen mit Verabreichung von Polysaccharid (100 mg/kg) 47,33 ± 3,96
    KM-Zellen von bestrahlten Mäusen mit Verabreichung von Polysaccharid (200 mg/kg) 37,17 ± 2,77
  • ➂ Verbessernde Auswirkung auf Peripherblutzellen
  • Fünf Tage nach Bestrahlung mit einer subletalen Dosis von 4,5 Gy nahm die Anzahl weißer Blutzellen von 3,463 ± 0,236 auf 0,476 ± 0,034 × 103/μl ab. Die Anzahl der Blutplättchen verringerte sich von 585,0 ± 39,0 auf 354,5 ± 26,0 × 103/μl, und die Anzahl der Neutrophilen und der Lymphozyten zeigte ebenfalls eine deutliche Abnahme. Wie in Tabelle 5 zu sehen ist, erfolgte die hämatopoetische Erholung in den mit Polysaccharid behandelten Mäusen 2-mal schneller als bei der bestrahlten Kontrollgruppe, insbesondere hinsichtlich der Anzahl von Neutrophilen. Tabelle 5. Verbessernde Auswirkung des Polysaccharids auf die hämatopoetische Erholung nach subletaler Bestrahlung
    Blutzellen Nicht-bestrahlt, normal ± SD Bestrahlt
    PBS-Kontrolle ± SD Verabreichung von Polysaccharid (100 mg/kg) ± SD Verabreichung von Polysaccharid (200 mg/kg) ± SD
    Anzahl an WBZ × 103/μl 3,463 ± 0,236 0,476 ± 0,034 0,948 ± 0,111 0,793 ± 0,055
    Anzahl an Neutrophilen × 103/μl 0,367 ± 0,043 0,0404 ± 0,005 0,182 ± 0,028 0,271 ± 0,037
    Anzahl an Lymphozyten × 103/μl 2,975 ± 0,259 0,330 ± 0,041 0,680 ± 0,099 0,378 ± 0,036
    Anzahl an RBZ × 103/μl 8,565 ± 0,121 7,550 ± 0,379 7,935 ± 0,145 7,663 ± 0,131
    Anzahl an Blutplättchen × 103/μl 585,0 ± 39,0 354,5 ± 26,0 441,5 ± 38,2 360,1 ± 20,4
  • ➃ Verstärkende Wirkung von koloniebildender Einheit – Milz
  • Knochenmarkzellen wurden am fünften Tag aus den mit einer subletalen Dosis bestrahl ten Mäusen (5 Mäuse/Gruppe), denen 24 Stunden vor der Bestrahlung PBS oder das Polysaccharid in einer Menge von 100 mg/kg verabreicht worden war, entnommen. Die Empfängermäuse (10 Mäuse/Gruppe) erhielten eine Bestrahlung bei einer letalen Dosis von 9 Gy. Knochenmarkzellen (105) wurden intravenös in die Schwanzvenen der Empfängermäuse injiziert. Die Anzahl an Kolonien in den Milzen wurde 8 Tage später nach Fixierung mit Bouin-Lösung mikroskopisch gezählt.
  • In den bestrahlten PBS-Kontrollmäusen ist keine Kolonie zu detektieren, wohingegen eine Behandlung der Mäuse mit Polysaccharid in einer Menge von 100 mg/kg 17,47 ± 2,33 CFU-S erzeugte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6. Auswirkung des Polysaccharids auf die Bildung von CFU-S
    Gruppe CFU-S/1 × 105 Knochenmark ± SD
    Nicht-bestrahlte normale Mäuse 39,25 ± 4,26
    Bestrahlte PBS-Kontrollmäuse keine Detektion
    Bestrahlte Mäuse mit Verabreichung von Polysaccharid (100 mg/kg) 17,47 ± 2,33
  • 2) Hemmende Wirkung auf die Unterdrückung der hämatopoetischen Eigenschaft, induziert durch Anti-Krebsmittel
  • ➀ Frühe Erholung der Knochenmark- und Milzzellstruktur und der Anzahl von GM-CFU nach Behandlung mit Cyclophosphamid
  • 50 mg/kg des Polysaccharids wurden 24 Stunden nach Verabreichung von 250 mg/kg Cyclophosphamid verabreicht. Die Knochenmark- und Milzzellen wurden am neunten Tag aus den Mäusen gesammelt, und die Lebensfähigkeit aller Zellen wurde unter Verwendung des Trypan-Blau-Ausschlußverfahrens bestimmt.
  • Bei der Gruppe mit Verabreichung von Cyclophosphamid wurde die Anzahl an Knochenmarkzellen auf 76% der normalen Menge, jedoch statistisch nicht signifikant reduziert. In der Gruppe, der das Polysaccharid zusammen mit Cyclophosphamid verabreicht wurde, kam es zu keiner signifikanten Veränderung der Anzahl an Knochenmarkzellen.
  • Die Milzzellstruktur dagegen erwies sich als empfindlicher für die Behandlung mit Cyclophosphamid. In Mäusen, denen eine Kombination aus Polysaccharid (100 mg/kg) und Cyclophosphamid verabreicht wurde, nahm die Anzahl an Milzzellen um das 2,1-fache zu im Vergleich zu Kontrollmäusen, die mit Cyclophosphamid behandelt wurden und 68% des normalen Werts zeigten.
  • Des weiteren wurde die Anzahl an GM-CFU der mit Cyclophosphamid behandelten Mäuse um 40% der normalen Menge signifikant reduziert, wohingegen die Anzahl an GM-CFU der Mäuse, denen Polysaccharid in Kombination mit Cyclophosphamid verabreicht wurde, um das 1,94-fache größer war als in den mit Cyclophosphamid behandelten Kontrollmäusen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7. Steigerung der Anzahl an Knochenmark- und Milzzellen und GM-CFU durch das Polysaccharid in Kombination mit Cyclophosphamid
    Figure 00110001
  • (Beispiel 3) Test zur Aktivierung von Antitumor-Immunzellen
  • 1) Test zur Aktivierung von natürlichen Killer-(NK-)Zellen
  • C3H/HeN-Mäuse wurden in Gruppen mit je fünf Mäusen aufgeteilt und erhielten PBS oder Polysaccharid in einer Menge von 10, 50, 100, 200 mg/kg mittels intraperitonealer Injektion. Ein vierstündiger [51Cr]-Freisetzungstest wurde verwendet, um die Erzeugung von natürlichen Killer zellen zu bestimmen. Kurz gefaßt wurden Milzzellen (1,5 × 106 Zellen/ml) 24 Stunden nach Verabreichung des Polysaccharids hergestellt und mit [51Cr]-markierten Zielzellen, YAC-1 (Effektorzellen:Zielzellen = 100:1) für 4 Stunden in 96-Well-Mikroplatten mit U-förmigem Boden kultiviert. Die Platten wurden geerntet und die in den Überständen freigesetzte Radioaktivität wurde unter Verwendung eines γ-Zählers (Reckmann Inst., Palo Alto, CA, USA) bestimmt. Der Prozentsatz der spezifischen Freisetzung wurde als % der spezifischen Freisetzung = (ER-SR)/(MR-SR) × 100 berechnet, wobei ER die mittlere Zahl aus der experimentellen Gruppe ist, SR die mittlere Zahl der in Medium alleine inkubierten Zielzellen ist und MR die mittlere Zahl der mit 0,5% Triton X-100 behandelten Zielzellen ist. Die mit Polysaccharid in einer Menge von 100 mg/kg behandelte Gruppe zeigte eine Zytotoxizität von 42,4% gegenüber der YAC-1-Tumorzelle, was um das 3,5-fache höher ist als die 12,1% der Kontrolle. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8. Test zur Aktivierung natürlicher Killer-(NK-)Zellen
    Gruppe % Zytotoxizität bei E:T = 100:1 (Mittelwert ± SD)
    Kontrollgruppe 12,1 ± 0,2
    Verabreichung von Polysaccharid (10 mg/kg) 18,4 ± 2,4
    Verabreichung von Polysaccharid (50 mg/kg) 25,3 ± 0,5
    Verabreichung von Polysaccharid (100 mg/kg) 42,4 ± 3,6
    Verabreichung von Polysaccharid (200 mg/kg) 12,4 ± 1,2
  • 2) Test zur Aktivierung von zytotoxischen T-Lymphozyten
  • Die Plasmazytom-Zellinie MOPC 315 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), enthaltend Penicillin, Streptomycin und 10% fötales Kälberserum (FCS), kultiviert. MOPC 315-Zellen wurden in einer Menge von 1 × 106 subkutan (s.c.) Balb/c-Mäusen injiziert. Nach 3 Tagen wurde das Polysaccharid den Mäusen jeden zweiten Tag viermal in Konzentrationen von 50, 10, 2 mg/kg intraperitoneal injiziert. Nach 14 Tagen wurden Milzzellen geerntet, und die CTL-Aktivität wurde gegen 51Cr-markierte Zielzellen getestet. Variable Anzahlen von Effektorzellen wurden mit 104 51Cr-markierten MOPC315-Tumorzellen dreifach gemischt und in 96-Well-Gewebekulturplatten mit U-förmigem Boden kultiviert. Nach 4 Stunden wurden die Platten bei 400 g für 5 Min. zentrifugiert, und 0,1 ml Überstand wurde gesammelt und in einem Gammazähler ausgezählt. Die Gruppe, der das Polysaccharid in einer Menge von 2, 10, 50 mg/kg verabreicht worden war, zeigte 18,6, 22,4 bzw. 17,8% Zytotoxizität gegen MOPC 315-Zellen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9. Test zur Aktivierung von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) durch das Polysaccharid
    Gruppe % Zytotoxizität bei E:T = 100:1 (Mittelwert ± SD)
    Kontrollmäuse 0,9 ± 0,2
    Mäuse mit Verabreichung von Polysaccharid (2 mg/kg) 18,6 ± 1,0
    Mäuse mit Verabreichung von Polysaccharid (10 mg/kg) 22,4 ± 1,6
    Mäuse mit Verabreichung von Polysaccharid (50 mg/kg) 17,8 ± 1,2
  • 3) Test auf tumorizide Wirkung der peritonealen Makrophagen, kultiviert mit dem Polysaccharid
  • Peritoneale Makrophagen von C3H/HeN-Mäusen wurden isoliert und in einer Menge von 2 × 105 Zellen/Well in 96-Well-Mikroplatten mit U-förmigem Boden ausgesät und mit oder ohne Polysaccharid für 24 Stunden bei 37°C, 5% CO2 inkubiert. Die peritonealen Makrophagen wurden mit PBS gewaschen, um das Polysaccharid zu entfernen, und mit YAC-1-Zellen in einer Menge von 1 × 104 Zellen/Well in der Gegenwart von 3H-Thymidin in einer Menge von 2 μCi/Well inkubiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen unter Verwendung einer automatischen Mehrfachwell-Erntevorrichtung geerntet, und die Menge an Radioaktivität in den Zielzellen wurde in einem Flüssigszintillationszähler gemessen. Die peritonealen Makrophagen, die mit 10, 50, 100 μg/ml Polysaccharid kultiviert wurden, hemmten das Wachstum von YAC-1-Krebszellen um 52,6, 69,2 bzw. 59,8%. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10. Tumorizide Wirkung der mit dem Polysaccharid kultivierten Makrophagen
    Behandlung % Inhibition
    Peritoneale Makrophagen (PM) 15,9 ± 4,1
    PM + Polysaccharid (10 μg/ml) 59,8 ± 6,9
    PM + Polysaccharid (50 μg/ml) 69,2 ± 2,6
    PM + Polysaccharid (100 μg/ml) 52,6 ± 5,0
  • 4) Test auf Antitumorigenizität in vivo
  • MOPC 315-Tumorzellen (1 × 106 Zellen/Maus) wurden Balb/c-Mäusen subkutan injiziert. 10, 2, 0,5 mg/kg Polysaccharid und PBS wurden ab dem dritten Tag nach der Implantation des Tumors jeden zweiten Tag 8-mal intraperitoneal injiziert. 11 zeigt, daß in Mäusen, denen 10, 2, 0,5 mg/kg des Polysaccharids verabreicht wurden, die Tumorgröße im Vergleich zu den Kontrollmäusen nach 30 Tagen um 22%, 46%, 16% reduziert war.
  • 5) Test auf Krebsprophylaxewirkung
  • Balb/c-Mäuse wurden in vier Gruppen unterteilt, und jede Gruppe enthielt 50 Mäuse. 0,5 mg Benzo[α]pyren in 1% wäßriger Gelatine wurde 24 Stunden nach der Geburt subkutan in den Schulterblattbereich injiziert, und das Polysaccharid, das in Mengen von 0,5, 2, 10 mg/ml in Trinkwasser gelöst war, wurde für 9 Wochen nach Entwöhnen nach Belieben verabreicht. Die Mäuse wurden getötet, die Lungen wurden entnommen und dann in Bouin-Lösung fixiert. Die Anzahl an Knötchen in den Lungen wurde unter dem Mikroskop gezählt. Wie in Tabelle 11 zu sehen ist, betrug die Häufigkeit des Auftretens von Lungentumoren in der Gruppe mit BP alleine 62%, und sie wurde durch Behandlung mit Polysaccharid signifikant reduziert, nämlich auf 31%, 23% bzw. 45%. Tabelle 11. Hemmung der Tumorhäufigkeit durch das Polysaccharid
    Gruppe % Häufigkeit von Lungentumor
    Benzo[α]pyren (BP) 60
    BP + Polysaccharid (0,5 mg/ml) 30
    BP + Polysaccharid (2 mg/ml) 22
    BP + Polysaccharid (10 mg/ml) 44
  • 6) Test auf Zytokin-mRNA-Expression
  • Milzzellen (2 × 106 Zellen/ml) von C3H/HeN-Mäusen wurden mit verschiedenen Konzentrationen des Polysaccharids (5 μg/ml, 50 μg/ml, 200 μg/ml) auf 6-Well-Platten ausgesät und für 1, 3, 6, 24 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen und die gesamte RNA wurde isoliert. Ein Mikrogramm der gesamten RNA wurde bei 37°C für 60 Min. revers transkribiert. Die reverse Transkriptase wurde bei 95°C für 5 Minuten inaktiviert, und cDNA wurde mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) unter den Bedingungen von 2,5 U Taq-Polymerase, je 10 μM dNTPs, 40 pmol Zytokinprimer und 1,5 mM Magnesiumchlorid vervielfältigt. Das PCR-Produkt wurde auf 2% Agarosegel, gefärbt mit Ethidiumbromid, Elektroforese unterzogen und mit DNA-Größenmarker, λDNA-BstEII-Verdau, verglichen. Jede Zytokin-mRNA-Expression wurde unter Verwendung eines Bildanalysierers mit MCID-Softwareprogramm quantifiziert und mit β-Actin verglichen. Die Expression von IL-2, IFNγ, IL-12-mRNA aus Th1-Zellen, IL-4, IL-5, IL-10 aus Th2-Zellen und TNFα, GM-CSF, IL-1β aus Makrophagen wurde induziert. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt.
  • (Beispiel 4) Test der verstärkenden Auswirkung auf die Radiosensitivität von Tumorzellen
  • 1) Test der Erzeugung von Stickstoffoxid
  • Da die radiosensibilisierende Wirkung von NO gut dokumentiert ist, schätzten wir die NO-Produktion und die radiosensibilisierende Wirkung von Polysaccharid in Line1-Zellinien ab. Die Ansammlung von NO2 -, einem stabilen Endprodukt der NO-Bildung, in Tumorzellkulturüberständen wurde als relative Messung der NO-Produktion verwendet. Zellen wurden auf eine 96-Well-Platte in einer Menge von 5 × 104 Zellen/Well mit dem Polysaccharid (100 μg/ml) oder IFN-y (50 U/ml) ausgesät. Nach Inkubation für 24 Stunden wurden 100 μl zellfreier Überstand mit 100 μl Griess-Reagens (0,1% Naphthylethylendiamindihydrochlorid in H2O:1% Sulfanylamid in 5% H3PO4 = 1:1) für 10 Min. bei Raumtemperatur inkubiert, und die Absorption wurde bei 550 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesers gemessen. Die Konzentration von NO2 - wurde aus einer linearen Regressionsanalyse unter Anwendung der Methode der kleinsten Quadrate eines Natriumnitritstandards, der mit jedem Experiment erzeugt wurde, bestimmt. Wie es in 13 zu sehen ist, erzeugten Zellen, die mit dem Polysaccharid (100 μg/ml) behandelt wurden, 21,6 μM NO2 -, und IFNγ erzeugte 16,7 μM NO2 -. Wenn Zellen mit Polysaccharid (100 μg/ml) in Kombination mit IFN-γ (50 U/ml) behandelt wurden, kam es zu einer synergistischen Wirkung.
  • 2) Schätzung der radiosensibilisierenden Wirkung
  • Line1-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden geerntet und auf 6 mm2-Kulturschalen mit dem Polysaccharid, IFN-γ oder Polysaccharid in Kombination mit IFN-γ für 16 Stunden ausgesät und bestrahlt. Die Anzahl an Zellen pro Schale wurde so manipuliert, daß unter jeder Bedingung 50-200 Kolonien überlebten. Nach 7 Tagen Inkubation wurden die Kolonien mit 1% Methylen-Blau in absolutem Methanol gefärbt und gezählt. Kolonien, die >50 Zellen enthielten, wurden gewertet. Das Verstärkungsverhältnis (ER) wird berechnet durch Teilen der Bestrahlungsdosis unter Kontrollbedingungen durch die Bestrahlungsdosis unter Bedingungen mit Behandlung mit verschiedenen Mitteln auf dem Niveau 1% an überlebender Fraktion. 14 zeigt die Bestrahlungs-Überlebenskurven für Line1-Zellen, die mit dem Polysaccharid (100 μg/ml) und IFN-γ (50 U/ml) behandelt wurden. Das ER für das Polysaccharid betrug 1,28, für IFN-γ betrug es 1,14. Das ER der kombinierten Wirkung von Polysaccharid und IFN-γ betrug 1,66.
  • 3) Test der radiosensibilisierenden Wirkung in vivo
  • Um die radiosensibilisierende Wirkung des Polysaccharids in vivo zu untersuchen, wurden Line1-Zellen in weibliche Balb/c-Mäuse transplantiert. Die Behandlung wurde begonnen, sobald die Tumore ein mittleres Volumen von 1000 mm3 erreicht hatten. Das Tumorvolumen wurde durch direkte Messung einer Schieblehre bestimmt, anhand der Formel (Länge × Breite × Tiefe/2) berechnet und als mittleres Volumen ± SE aufgezeichnet. Mäusen wurde PBS oder das Polysaccharid (200 mg/kg) jeden zweiten Tag intraperitoneal injiziert. Nach der Behandlung wurden die Mäuse einer Bestrahlung mit 20 Gy in einer Dosisrate von 65,8 cGy/Min. unterworfen. Wenn die Verabreichung von Polysaccharid und die Bestrahlung kombiniert wurden, gingen die Tumore tatsächlich um 45% im Vergleich zu den Kontrollmäusen im gleichen Zeitraum zurück (15).
  • (Beispiel 5) Test auf akute Toxizität
  • Um die akute Toxizität des Polysaccharids zu messen, wurden 2 g/kg, 1 g/kg, 200 mg/kg oder 40 mg/kg des Polysaccharids intraperitoneal injiziert. Die Anzahl der Todesfälle während des 30-tägigen Zeitraums wurde bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt. Tabelle 12. Test der akuten Toxizität
    Dosis des Polysaccharids 2 g/kg 1 g/kg 200 mg/kg 40 mg/kg
    Anzahl toter Mäuse 0 0 0 0
  • Das Polysaccharid der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung herkömmlicher Träger als ein pharmazeutisches Präparat ausgestaltet werden. Die Formulierung kann auf unterschiedliche Weise verwendet werden, beispielsweise in Form von Tabletten, Dispergiermittel, Granulat, Kapseln, Lösungen oder Injektionen in oralen oder nicht-oralen Dosierungsformen.
  • Die Dosis des Polysaccharids kann in Abhängigkeit vom Zustand, dem Gewicht, dem Alter und dem Geschlecht des Patienten variiert werden. Im allgemeinen sind 100-1.000 mg/Tag/60 kg bevorzugt.

Claims (2)

  1. Polysaccharidzusammensetzung mit hämatopoetischen, myeloprotektiven, Antitumor-Immunzellen-erzeugenden und radiosensibilisierenden Wirkungen, die aus den Wurzeln von Panax ginseng extrahiert ist, und welche sechs Polysaccharidfraktionen, die jeweils Molekulargewichte von 1.800.000-2.200.000, 1.350.000-1.650.000, 620.000-780.000, 105.000-130.000, 23.000-27.000 und 5.000-6.000 Dalton in Gewichtsverhältnissen von 11,4-13,4:3,6-4,2:4,5-5,1:0,7-0,9:40,1-48,1:31,0-37,0 aufweisen, bestehend aus α(1→6)-verknüpften D-Glukopyranoseeinheiten mit teilweise α(1→3)-verknüpften Verzweigungen, umfaßt, wobei die sechs Polysaccharidfraktionen hergestellt werden nach den Stufen, bei denen man i) einen Rückstand erhält, in dem man 1 Gewichtsteil Ginsengwurzel mit 2-4 Gewichtsteilen Methanol extrahiert, ii) eine wasserlösliche Fraktion aus dem Rückstand in Stufe i) extrahiert und erhält, wobei man 3-5 Gewichtsteile destilliertes Wasser verwendet, iii) die in Stufe ii) erhaltene wasserlösliche Fraktion gefrier trocknet, iv) eine innere Fraktion erhält, in dem man ein Präzipitat mit 40%-igem Ethanol der gefriergetrockneten Fraktion aus Stufe iii) dialysiert, v) die sechs Fraktionen durch Sephacryl-S-500-Gelchromatographie erhält und vi) die in Stufe v) erhaltene Polysaccharidzusammensetzung über DAEA-Sephadex-A-50-Chromatographie laufen läßt, und wobei die sechs Polysaccharidfraktionen anhand quantitativer Bestimmung bestimmt einen Anteil von mehr als 98,5% Kohlenwasserstoffe und einen Gehalt von weniger als 1,0% Proteine umfassen.
  2. Pharmazeutische Zusammensetzung mit einer wirksamen Menge von 100-1.000 mg/Tag/60-kg-Person der Polysaccharidzusammensetzung nach Anspruch 1 als hämatopoetisches Mittel, als Myeloprotektivum, als Hemmstoff gegenüber durch Strahlung und/oder Antikrebsmittel induzierte Schädigung, als chemoprophylaktisches Mittel und als radiosensibilisierendes Mittel.
DE60035406T 1999-08-27 2000-08-25 Hämatopoietisches, das mark schützende, antitumor-immunzellen erzeugendes und radiosensibilisierendes polysaccharid aus panax ginseng Expired - Lifetime DE60035406T2 (de)

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