CN110078842B - 皱盖假芝多糖f212的制备方法和用于预防和/或治疗乳腺癌的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多糖，具体涉及一种皱盖假芝多糖F212的制备方法和应用，按照质量百分比的单糖组成为：核糖4.3％，鼠李糖0.7％，阿拉伯糖5.3％，木糖4.5％，甘露糖30.5％，葡萄糖37.3％，半乳糖17.4％。多糖F212的制备方法从皱盖假芝子实体中分离纯化所得。多糖F212用于预防和/或治疗乳腺癌。本发明提供了一种皱盖假芝多糖F212的制备方法和应用，本发明申请的研究表明，皱盖假芝多糖F212具有抗肿瘤特性并且安全无毒，特别是乳腺癌肿瘤，具有广阔的应用前景和良好的经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及多糖，具体涉及一种皱盖假芝多糖F212的制备方法和用于预防和/或治疗乳腺癌的应用。
背景技术
美国癌症学会官方期刊发表了《2018年全球癌症统计数据》报告，这篇文章评估了185个国家中36种癌症发病率和死亡率。根据数据，肺癌发病率高居不下，而在女性中，乳腺癌占据榜首。全球每新增100个癌症患者，中国人占21个。相当于中国每天有超过1万人确诊癌症，平均每分钟有7个人得癌症。触目惊心的大数据告知了公众严酷的癌症现状。癌症死亡率高，容易复发和转移。目前的抗肿瘤药物普遍存在毒副作用大(如引起白细胞、血小板减少，免疫功能减低，体虚乏力、失眠多梦、食欲不振等)、价格昂贵的特点。
因此，从天然中草药中提取有效成分，开发疗效确切、成本低廉、毒副作用小的抗癌新药具有积极的意义。
食药用菌是一类可以食用的大型真菌，在民间用来预防和治疗多种疾病。自1969年日本学者千原首次报道了从香菇子实体中分离出一种抗肿瘤多糖以来，食用菌多糖的生物活性和功能已受到国内外研究人员的广泛关注。现代研究表明，多种食药用菌如灵芝、香菇、桦褐孔菌、虎奶菇、凤尾菇、皱盖假芝等具有显著抑制肿瘤的功效，因而成为探索和发掘新型药物及功能新产品的重要领域。目前，这类研究主要着眼于对食药用菌进行粗略的提取用于免疫调节、肿瘤抑制等方面的研究，并且主要作为保健品使用。这类研究一方面提取物的成分模糊且混杂，另一方面，效果也难以达到药用程度。
因此，对食药用菌抗肿瘤活性成分及作用机理进行深入研究，开发天然抗肿瘤活性药物具有广阔的市场前景。
发明内容
针对以上不足，本发明提供一种皱盖假芝多糖F212的制备方法和在抗乳腺癌肿瘤方面的新应用。
本发明通过以下方案达到上述目的：
第一方面，提供一种皱盖假芝多糖F212，按照质量百分比的单糖组成为：核糖4.3％，鼠李糖0.7％，阿拉伯糖5.3％，木糖4.5％，甘露糖30.5％，葡萄糖37.3％，半乳糖17.4％。
第二方面，提供一种上述皱盖假芝多糖F212的制备方法，从皱盖假芝子实体中分离纯化所得。
一种上述皱盖假芝多糖F212的制备方法，包括：
(1)将皱盖假芝子实体经干燥、粉碎、水浸提，优选用热水进行浸提，得到皱盖假芝水提液，向水提液中加入酒精，优选为质量百分浓度为95％-100％的酒精，进一步优选为质量百分浓度为95％的酒精，调节至酒精质量百分浓度为80％，常温静置，优选静置过夜，后离心，将沉淀分离收集沉淀物，得到皱盖假芝粗多糖F0；
(2)对F0采用DEAE sepharose fast flow进行纯化，采用氯化钠溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，流速优选为20-40ml/min，氯化钠溶液的浓度优选为0.1、0.5、1、2Mol/l，收集得到4个组分；
(3)采用乳腺癌细胞对4个组分进行活性筛选，得到活性最好的组分F1；
(4)采用Sephaacyl S-200chromatography对组分F1进行纯化，用水优选纯水进行洗脱，流速2-5ml/min，根据多糖含量收集得到3个组分；
(5)采用乳腺癌细胞对3个组分进行活性筛选，得到活性最好的组分F212。
第三方面，提供一种上述制备方法制备得到的皱盖假芝多糖F212。
第四方面，提供一种皱盖假芝多糖F212的应用，用于预防和/或治疗乳腺癌。
第五方面，提供一种皱盖假芝多糖F212的应用，用于制备预防和/或治疗乳腺癌的药物或保健品。
第六方面，提供一种预防和/或治疗乳腺癌的药物或保健品，包括有效量的皱盖假芝多糖F212和药学上可接受的载体。
本发明提供了一种皱盖假芝多糖F212的制备方法和应用，本发明申请的研究表明，皱盖假芝多糖F212具有抗肿瘤特性并且安全无毒，特别是乳腺癌肿瘤，具有广阔的应用前景和良好的经济价值。
附图说明
图1为皱盖假芝多糖F212的凝胶色谱图。
图2为皱盖假芝多糖F212的红外光谱图。
图3为皱盖假芝多糖F212显著抑制肿瘤细胞生长图。
图4为皱盖假芝活性成分F212显著抑制肿瘤小鼠的肿瘤生长图。
图5为肿瘤组织切片染色图。
图6为活性成分对Ki67和CD34的抑制效果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
多糖是食药用菌的重要活性成分。在之前的发明申请中，发明人对皱盖假芝粗多糖进行分离纯化，得到具有显著抗肿瘤活性的多糖F212，并分析了其组成和结构特征。
在本发明申请中，发明人进一步分析了其结构特征，并且根据其结构特征，开发了其在抗肿瘤方面的新应用。
第一方面，提供一种皱盖假芝多糖F212，按照质量百分比的单糖组成为：核糖4.3％，鼠李糖0.7％，阿拉伯糖5.3％，木糖4.5％，甘露糖30.5％，葡萄糖37.3％，半乳糖17.4％。
进一步的，上述皱盖假芝多糖F212的分子量为4.5852e3g/mol(数均分子量)。
进一步的，上述皱盖假芝多糖F212的分子量为5.8659e3g/mol(重均分子量)。
进一步的，上述皱盖假芝多糖F212为含有糖醛酸的杂多糖。
本发明在之前发明申请提供的皱盖假芝多糖F212的制备方法基础上，对制备方法继续进行改进，得到制备步骤更加简洁、成本更低的而提取率和纯度并未降低的制备方法。
第二方面，提供一种上述皱盖假芝多糖F212的制备方法，从皱盖假芝子实体中分离纯化所得。
一种上述皱盖假芝多糖F212的制备方法，包括：
(1)将皱盖假芝子实体经干燥、粉碎、水浸提，优选用热水进行浸提，得到皱盖假芝水提液，向水提液中加入酒精，优选为质量百分浓度为95％-100％的酒精，进一步优选为质量百分浓度为95％的酒精，调节至酒精质量百分浓度为80％，常温静置，优选静置过夜，后离心，将沉淀分离收集沉淀物，得到皱盖假芝粗多糖F0；
(2)对F0采用DEAE sepharose fast flow进行纯化，采用氯化钠溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，流速优选为20-40ml/min，氯化钠溶液的浓度优选为0.1、0.5、1、2Mol/l，收集得到4个组分；
(3)采用乳腺癌细胞对4个组分进行活性筛选，得到活性最好的组分F1；
(4)采用Sephaacyl S-200chromatography对组分F1进行纯化，用水优选纯水进行洗脱，流速2-5ml/min，根据多糖含量收集得到3个组分；
(5)采用乳腺癌细胞对3个组分进行活性筛选，得到活性最好的组分F212。
在上述制备方法中，对皱盖假芝粗多糖F0不需要经过第二次沉淀后进行葡聚糖凝胶柱纯化的步骤，就可以直接采用DEAE sepharose fast flow纯化，而在后续对F1进行纯化后的洗脱步骤根据多糖含量收集3个组分即可，简化了步骤和试剂消耗，降低了成本而未影响提取率和纯度。
优选的，上述制备方法中的采用乳腺癌细胞进行活性筛选的过程包括：(1)制备乳腺癌细胞液；(2)向乳腺癌细胞液中加入样品组分；(3)培养后测定乳腺癌细胞的增殖情况。
优选的，上述乳腺癌细胞可以为乳腺癌细胞4T1细胞或MDA-MB-231细胞。
经过大量实验发现，上述制备得到的皱盖假芝多糖F212对肿瘤具有显著的抑制效果，特别是对乳腺癌细胞(4T1或MDA-MB-231)都有显著的抑制作用。
第三方面，提供一种上述制备方法制备得到的皱盖假芝多糖F212。
第四方面，提供一种皱盖假芝多糖F212的应用，用于预防和/或治疗乳腺癌，优选的，所述乳腺癌为乳腺癌细胞4T1细胞或MDA-MB-231引发的乳腺癌。
第五方面，提供一种皱盖假芝多糖F212的应用，用于制备预防和/或治疗乳腺癌的药物或保健品，优选的，所述乳腺癌为乳腺癌细胞4T1细胞或MDA-MB-231引发的乳腺癌。
第六方面，提供一种预防和/或治疗乳腺癌的药物或保健品，包括有效量的皱盖假芝多糖F212和药学上可接受的载体，优选的，所述乳腺癌为乳腺癌细胞4T1细胞或MDA-MB-231引发的乳腺癌。
体内药理学实验表明，肿瘤小鼠连续灌胃给予皱盖假芝多糖F212 30天，可显著降低肿瘤体积。抑制肿瘤的机制主要是通过调节免疫系统功能和抑制肿瘤相关靶蛋白表达实现。
本发明的皱盖假芝多糖F212安全无毒，检测大鼠体质量、脏器系数、血常规及血生化各项指标，各组间比较无显著性差异，表明安全无毒。
实施例1：皱盖假芝多糖F212的制备
1、皱盖假芝子实体1kg经干燥、粉碎，采用热水浸提，得到皱盖假芝水提浓缩液；往浓缩液中加入95％-100％的酒精，调节至80％，常温静置过夜，接下来离心沉淀分离，收集沉淀物，得到皱盖假芝粗多糖F0，得率为1％-4％；
2、对F0进行DEAE sepharose fast flow纯化，进行梯度洗脱，流速5ml/min洗脱液依次用0.1、0.5、1,、2Mol/l的氯化钠进行洗脱，进行梯度收集，分别得到4个组分；
3、活性筛选实验：用乳腺癌细胞(4T1和MDA-MB-231)对此4个组分进行活性筛选。
4、筛选出活性最好的组分F1，用Sephaacyl S-200chromatography进行纯化，用纯水进行洗脱，流速2ml/min，每分钟收集一管，然后测每管多糖含量，用硫酸-苯酚法测多糖，做出多糖含量-时间曲线，根据多糖含量收集得到3个组分；
5、用乳腺癌细胞(4T1和MDA-MB-231)对此3个组分进行活性筛选，筛选出活性好的组分F212。
实施例2：皱盖假芝多糖F212的组成分析
经检测皱盖假芝多糖F212分子量为MN(数均分子量)：4.5852e3g/mol，MW(重均分子量)：5.8659e3g/mol。
经检测，皱盖假芝多糖F212单糖组成为：核糖4.307％，鼠李糖0.717％，阿拉伯糖5.265％，木糖4.527％，甘露糖30.527％，葡萄糖37.284％，半乳糖17.374％。
对皱盖假芝多糖F212进行凝胶色谱分析和红外光谱分析，色谱图如图1所示，光谱图如图2所示。红外光谱吸收峰的归属诠释如表1所示。
表1皱盖假芝多糖F212红外光谱吸收峰的归属诠释
对红外光谱图的吸收峰进行诠释，各峰的归属见表1。结合红外光谱图的图2分析，由C＝O伸缩振动引起的1597.2cm-1的吸收峰与-CO伸缩振动引起的1396.7cm-1吸收峰，说明多糖中可能含有-COOH(Zhao et al,2007)，也就是说含有糖醛酸，这与多糖F212含有2.9％的糖醛酸的结果吻合，因此，单峰多糖F212推测为主要由β糖苷键相连的吡喃环组成的，含有糖醛酸的杂多糖。
实施例3皱盖假芝多糖F212的部分酸水解分析
皱盖假芝多糖F212经酸水解透析后，透析袋袋外的低分子截留液为F212-L，袋内的高分子截留液为F212-H。结果如表2所示。
表2部分酸水解产物的单糖组分与组成
从表2应该看出，F212由7种单糖组成，其中核糖Rib、鼠李糖Rha、半乳糖Gal只存在F212-L中，这表明它们主要分布在支链或主链末端，因此在弱酸条件下，容易与主链分离；反之，高分子截留液F212-H的检出成分表明甘露糖Man和葡萄糖Glc主要分布在主链上。
实施例4皱盖假芝多糖F212有效抑制乳腺癌细胞生长
将不同浓度的活性成分皱盖假芝多糖F212水溶液(0、100、200、300、400μg/mL)加入肿瘤细胞(4T1和MDA-MB-231)中，48小时后进行观察，结果如图3所示，结果显示，皱盖假芝多糖F212能显著抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡，并且随着浓度的提高，效果越来越显著，在低剂量下即可达到显著的凋亡效果。
实施例5皱盖假芝多糖F212对肿瘤小鼠的抑制作用
将肿瘤干细胞注射小鼠体内形成肿瘤，用皱盖假芝多糖F212进行腹腔注射，每两天注射一次，时间为30天，其中每10天测量一次肿瘤大小，结果如图4所示(2.4mg组代表每只小鼠每次注射2.4mg F212，4.8mg组代表每只小鼠每次注射4.8mg F212)。实验结束后取出肿瘤组织切片进行HE染色并观察。结果如图5和图6所示。
图4的实验结果显示，皱盖假芝多糖F212能显著抑制乳腺癌小鼠肿瘤的生长，并且随着浓度提高，抑制效果更加显著。
图5和图6的结果为对肿瘤组织进行切片染色观察，在图5中，S代表基质组织；T代表肿瘤组织；而Tumor-C代表阴性对照组，Tumor-L指低剂量组(2.4mg/只小鼠)，Tumor-H指高剂量组(4.8mg/只小鼠)。图5中的两个Tumor-H图是从不同视野范围观察。从图5中可以看出，经过多糖F212处理后，肿瘤细胞大量死亡，且能抑制肿瘤血管的生成。
图6中的C代表阴性对照组，L代表低剂量组，H代表高剂量组，Ki67标记的是处于增殖周期中的细胞。该标记阳性率越高，肿瘤生长越快，组织分化越差，对化疗也越敏感。CD34分子是高度糖基化的i型跨膜糖蛋白，选择性地表达于人类及其他哺乳动物造血干或者祖细胞表面，并随细胞的成熟逐渐减弱至消失，用在血管肿瘤诊断时提示血管肿瘤起源，具有判定肿瘤的意义。从图6中可以看出，多糖F212能显著抑制肿瘤蛋白Ki67和CD34的生成，并且具有浓度依赖性。这表明，多糖F212可能有助于乳腺癌肿瘤的化疗治疗敏感性和诊断等。
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (1)
1.皱盖假芝多糖F212的应用，其特征在于，用于制备治疗乳腺癌细胞4T1细胞或MDA-MB-231引发的乳腺癌的药物；所述皱盖假芝多糖F212按照质量百分比的单糖组成为：核糖4.3%，鼠李糖0.7%，阿拉伯糖5.3%，木糖4.5%，甘露糖30.5%，葡萄糖37.3%，半乳糖17.4%，皱盖假芝多糖F212的制备方法包括：
（1）将皱盖假芝子实体经干燥、粉碎、水浸提，得到皱盖假芝水提液，向水提液中加入酒精，调节至酒精质量百分浓度为80%，常温静置过夜，后离心，将沉淀分离收集沉淀物，得到皱盖假芝粗多糖F0；
（2）对F0采用DEAE sepharose fast flow进行纯化，采用氯化钠溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，流速为5mL/min，氯化钠溶液的浓度为0.1、0.5、1、2mol/L，收集得到4个组分；
（3）采用乳腺癌细胞4T1细胞或MDA-MB-231对4个组分进行活性筛选，得到活性最好的组分F1；
（4）采用Sephacyl S-200 chromatography对组分F1进行纯化，用水进行洗脱，流速为2mL/min，根据多糖含量收集得到3个组分；
（5）采用乳腺癌细胞4T1细胞或MDA-MB-231对3个组分进行活性筛选，得到活性最好的组分F212。
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