CN114533755B - 一种绞股蓝多糖与靛玉红在抗黑色素瘤药物上的应用 - Google Patents
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Abstract
本方案涉及药物研究领域，特别涉及一种绞股蓝多糖与靛玉红在抗黑色素瘤药物上的应用，所述的绞股蓝总多糖是采用绞股蓝茎叶通过水提醇沉，将沉淀物冻干而得，包括鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和葡萄糖。所述的绞股蓝总多糖可辅助靛玉红抑制黑色素瘤，显著降低靛玉红抑制黑色素瘤的半抑制浓度。所以绞股蓝总多糖与靛玉红可以组成治疗黑色素瘤的药物组合物。
Description
技术领域
本发明属于药物研究领域，特别涉及一种绞股蓝多糖与靛玉红在抗黑色素瘤药物上的应用。
背景技术
在现代快速的生产生活方式中，人们的不良生活习惯、日益严峻的环境污染、慢性刺激与创伤和免疫、遗传、内分泌等内、外源性因素是肿瘤的主要诱因。黑色素瘤是一种起源于黑素细胞的皮肤恶性肿瘤，可发生于正常皮肤，也可由色素痣恶变形成。该病病因不明，起病隐袭，恶性程度高、易转移、预后差，约占皮肤恶性肿瘤的1％。恶性黑色素瘤可见于任何年龄，多见于中、老年人，好发于白色人种。治疗以手术治疗为主。我国恶性黑色素瘤的发病率不高，但有逐渐增高的趋势。
目前，综合化学疗法、放射线治疗、手术治疗以及一些其他方法是恶性肿瘤的主要治疗手段，但这些传统的治疗方法因其特异性较低、易致机体产生耐药性，对机体会造成较大的不良反应。因此安全、高效且毒副作用小的抗肿瘤药物的需求仍很迫切，植物多糖因具有较强的抗肿瘤生物活性，对多种肿瘤细胞均有较好的抑制作用，且对正常细胞几乎没有毒副作用，因此成为了一种潜在的新型抗肿瘤药物资源。
绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum Makino)属葫芦科草本植物，为多年生攀援草木，又称七叶胆、小苦药、天堂草、遍地生根、五叶参或七叶参。主要分布于中国、日本、朝鲜等国。我国作为绞股蓝的分布中心，绞股蓝资源主要分布于岭和长江以南地区，如湖南、湖北、广西、广东、贵州以及云南等省份。绞股蓝首次记载于朱橚编纂的《救荒本草》中，作为一种饥荒时的野菜使用。李时珍在《本草纲目》记载绞股蓝有“治疮疖、虫咬、凉血解毒、利小便”等疗效，第一次对绞股蓝的药用价值进行了明确阐述。研究发现,绞股蓝具有多种生物活性,如调节机体免疫力,抗氧化,降低血脂,心血管保护等。中药绞股蓝常以全草或根茎入药，其对高血脂症、高血压、冠心病等心血管系统疾患以及糖尿病、肿瘤等病症具有良好的防治效果，长期服用无毒副作用。含有多种化学成分，其中绞股蓝多糖是其活性成分之一。目前对其的研究重点集中在降糖降脂、抗氧化，对绞股蓝总多糖的抗癌较少，前期研究也发现绞股蓝多糖对于细胞的抑制具有较强的选择性。因此将绞股蓝总多糖与靛玉红联合应用于抗黑色素瘤，发挥绞股蓝总多糖的抗黑色素瘤的作用是本专利的研究重点。
许多单位广泛地研究了青黛的有效成分靛玉红的抗肿瘤作用、毒性、作用原理及临床疗效，肯定了它治疗慢性粒细胞白血病的作用。有少量报道初步认为本品对缩小伴有巨脾的骨髓纤维化患者脾脏亦可能有一定疗效。但是鲜有靛玉红对于抗黑色素瘤的报导。因此探究靛玉红抗黑色素瘤的作用是本专利的研究重点。
发明内容
本发明意在提供针对绞股蓝总多糖和靛玉红抗肿瘤现有研究进展，提供一种对黑色素瘤具有较好活性的药物组合物。
本方案中的一种绞股蓝总多糖，所述绞股蓝总多糖包括鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和葡萄糖。
所述鼠李糖：甘露糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖：葡萄糖分别占所述绞股蓝总多糖总质量的1％-5％：2％-6％：5％-10％：7％-12％：10％-15％：65％-75％。
所述的绞股蓝总多糖与靛玉红联合使用可用于治疗黑色素瘤，所以绞股蓝总多糖与靛玉红可以组成治疗黑色素瘤的药物组合物。
本发明研究发现绞股蓝总多糖可辅助靛玉红抑制黑色素瘤，显著降低靛玉红抑制黑色素瘤的半抑制浓度。
本发明还提供了绞股蓝总多糖的的提取方法，包括以下步骤：
S1、称取干燥的绞股蓝茎叶，加入5～15倍蒸馏水浸泡过夜。
S2、取浸泡后的绞股蓝茎叶水煮提取2～5次，每次2～5h；
S3、合并多次水煮液后浓缩，用乙醇进行沉淀，沉淀物冻干得到绞股蓝总多糖。
进一步，S1浸泡绞股蓝茎叶时的料液比为1:12。
进一步，所述S2绞股蓝茎叶加水煮沸后过滤得水煮液，滤渣加水继续煮沸，煮沸3次，每次3小时。
进一步，所述S3中用4倍体积95％乙醇醇沉。
附图说明
图1为绞股蓝总多糖单糖组成结果；
图2为靛玉红对黑色素瘤B16-F10细胞活力的影响示意图；
图3为绞股蓝总多糖对黑色素瘤B16-F10细胞活力的影响示意图；
图4为绞股蓝总多糖辅助靛玉红对黑色素瘤B16-F10细胞活力的影响示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
1、一种绞股蓝总多糖的提取方法，包括以下步骤：
称取干燥的绞股蓝茎叶500g于煎药机中，加10蒸馏水浸泡过夜，再加入6L蒸馏水煮3h，收集滤液，重复此操作三次，合并三次煮提液。将三次收集滤液浓缩至小体积，4000r/min离心20min，收集上清液。上清液中加入4倍95％乙醇醇沉过夜。小心倾倒弃去醇沉上清后，将沉淀4000r/min离心20min，收集沉淀。沉淀加入适量蒸馏水溶解，加热挥尽乙醇后，放入-80℃冰箱过夜，冻干。干燥后，合并称重，得到绞股蓝总多糖52.5g，收率为10.5％。
2、绞股蓝总多糖的单糖组成分析：
HPLC条件：流动相组成为乙腈：磷酸缓冲盐＝18.2:81.8。检测器型号：VarianProstar325，检测波长：245nm。色谱柱型号：Thermo ScientificODS-2(c18)Hypersil Dim.(mm)150×4.6；柱温：30℃。进样量：15μL，流速：1mL/min。
样品前处理：
(1)酸水解：称取2mg绞股蓝总多糖样品置于棕色小瓶中，使其溶于2mL 4M的三氟乙酸(TFA)，加盖密封。在110℃的条件下加热水解4h，取出冷却至室温，使用甲醇减压浓缩，重复操作直至除尽TFA。蒸干后，残渣溶解200μL蒸馏水中。
(2)PMP衍生化：取100μL(1)中的完全酸水解溶液，加入浓度为0.6M的NaOH溶液100μL混匀，再加入200μL现配置的浓度为0.5M的PMP甲醇溶液，密封后涡漩混匀。水浴温度为70℃条件下反应100min后，冷却至室温，用浓度为0.3M的HCl 200μL进行中和，加蒸馏水补足至1mL。再加入1mL三氯甲烷萃取，取出上层水相，多次重复萃取，尽量除尽PMP。涡旋后取15μL上清液进样分析。
(3)取100μL 1mg/mL单糖标准品(Man，Rha，Gal，GalA，Glc，GlcA，Xyl，Ara，Fuc)混合液，按样品PMP衍生同法处理，然后进样分析。
如图1所示，结果显示绞股蓝总多糖主要由鼠李糖：甘露糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖：葡萄糖组成，含量比为：1：1.26：3.3：4：5.47：33.8。
3、靛玉红、绞股蓝总多糖抗黑色素瘤活性实验。
B16-F10黑色素瘤细胞，细胞密度为4*103个细胞/mL铺板至96孔板，放入37℃，5％CO2中培养继续培养过夜，换培养基，分别加入不同浓度不同级分靛玉红、绞股蓝总多糖药物，及同时加入不同浓度的靛玉红及100μg/ml绞股蓝总多糖药物处理48小时。然后每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)继续培养4h，弃去上清液。最后，每孔加入150μL的DMSO，在490nm波长处检测吸光值。结果如图2所示，靛玉红对B16-F10黑色素瘤细胞的细胞活力具有显著的抑制活性，且呈浓度梯度依赖性；结果如图3所示，绞股蓝对B16-F10黑色素瘤细胞的细胞活力具有抑制活性，但在100μg/ml对细胞的抑制不显著；结果如图4所示，浓度为100μg/ml绞股蓝总多糖辅助靛玉红对B16-F10黑色素瘤细胞的细胞活性抑制，显著降低靛玉红抑制黑色素瘤的半抑制浓度。
以上结果显示靛玉红具有抗黑素瘤活性，绞股蓝总多糖可以辅助靛玉红抗黑色素瘤，显著降低靛玉红抑制黑色素瘤的半抑制浓度。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (3)
1.一种用于制备治疗黑色素瘤的药物组合物，其特征在于：包括靛玉红和绞股蓝总多糖，所述绞股蓝总多糖主要由鼠李糖：甘露糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖：葡萄糖组成；所述的鼠李糖：甘露糖：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸：半乳糖：葡萄糖的含量比为：1：1.26：3.3：4：5.47：33.8；所述绞股蓝总多糖的浓度为100μg/ml；
所述绞股蓝总多糖的提取过程如下：
S1、称取干燥的绞股蓝茎叶，加入5～15倍蒸馏水浸泡过夜；
S2、取浸泡后的绞股蓝茎叶水煮提取2～5次，每次2～5h；
S3、合并多次水煮液后浓缩，用4倍浓缩液体积的浓度为95％的乙醇进行沉淀，沉淀物冻干得到绞股蓝总多糖。
2.根据权利要求1所述的一种用于制备治疗黑色素瘤的药物组合物，其特征在于：所述S1浸泡绞股蓝茎叶时的料液比为1:12。
3.根据权利要求2所述的一种用于制备治疗黑色素瘤的药物组合物，其特征在于：所述S2绞股蓝茎叶加水煮沸后过滤得水煮液，滤渣加水继续煮沸，煮沸3次，每次3小时。
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Non-Patent Citations (3)
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| Isolation and antitumor activities of acidic polysaccharide from Gynostemma pentaphyllum Makino;Xiao-Li Li 等;Carbohydrate Polymers;第89卷;第 942-947页，尤其是摘要，表2及第2.2节 * |
| Xiao-Li Li 等.Isolation and antitumor activities of acidic polysaccharide from Gynostemma pentaphyllum Makino.Carbohydrate Polymers.2012,第89卷第 942-947页，尤其是摘要，表2及第2.2节. * |
| 绞股蓝多糖体外抗氧化活性研究;尚晓娅等;天然产物研究与开发;第25卷(04);第450-454页 * |
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