CN106045951B - 一种云实内酯及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从云实种子中分离纯化得到的内酯及其制法和用途，并利用现代分析手段确定了其化学结构和理化性质，根据有关化合物的命名规则命名为14β‑羟基‑12α‑甲氧基‑6α,7β‑二乙酰基‑1‑羰基‑卡山烷二萜‑13,15‑双键‑16,12‑内酯，为无色粉末，易溶于氯仿、甲醇。经功能性试验证明：14β‑羟基‑12α‑甲氧基‑6α,7β‑二乙酰基‑1‑羰基‑卡山烷二萜‑13,15‑双键‑16,12‑内酯对HeLa细胞、HT‑29细胞和KB细胞等肿瘤细胞均具有一定的抑制作用，能够作为制备防治肿瘤药物的原料，具有较强的应用价值和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种云实内酯及其制法和用途，具体指14β-羟基-12α-甲氧基-6α,7β-二乙酰基-1-羰基-卡山烷二萜-13,15-双键-16,12-内酯及其制法和用途。
背景技术
云实(Caesalpinia decapetala (Roth) Alston)又名“药王子”，“牛王刺”，“朝天子”，“倒挂刺”等，为豆科(Fabaceae)云实属植物，生于我国南部地区，平原地带长载培，常野生于山坡、岩旁、林边、河边或灌木丛中。云实的果、茎皮含单宁，种子可榨油，根茎及果实供药用，具有清热除湿杀虫之功效，治疗痢疾、疟疾、消渴、小儿疳积等疾病。
云实的药效主要来源于其中的内酯化合物，因此，开发和利用云实内酯中的单体化合物，进一步挖掘其潜在的药用价值，并对其单体化合物的结构和理化性质进行确定和表征，对于开发利用云实资源具有重要意义。
发明内容
本发明就是克服现有技术的不足，提供一种从云实种子中分离得到的具有重要生物活性和产业化利用价值的云实内酯单体化合物。该单体化合物为云实种子中首次分离得到，利用现代分析手段表征其结构并确认其生物活性后，根据有关化合物的命名规则命名为14β-羟基-12α-甲氧基-6α,7β-二乙酰基-1-羰基-卡山烷二萜-13,15-双键-16,12-内酯。
一种从云实种子中分离得到的14β-羟基-12α-甲氧基-6α,7β-二乙酰基-1-羰基-卡山烷二萜-13,15-双键-16,12-内酯，具有如下式所示结构：
上述从云实种子中分离得到的14β-羟基-12α-甲氧基-6α,7β-二乙酰基-1-羰基-卡山烷二萜-13,15-双键-16,12-内酯按下述方法得到：
云实种子干燥后粉碎过筛，加乙醇加热回流提取3次，每次1-3小时，合并提取液，减压回收溶剂，浓缩后得总浸膏，总浸膏经100～200目硅胶拌样，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和甲醇洗脱，洗脱液减压浓缩至干；取氯仿层浸膏用硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇(1:0-0:1)9梯度洗脱，得到9个馏分 Fr A-I，Fr.D部分经凝胶色谱洗脱后再用氯仿-甲醇作为洗脱液洗脱除去色素，然后样品经反相中压色谱柱经甲醇-水(60:40; 80:20; 90:10)梯度洗脱，得到三个部份FrD1-3，其中FrD2经高效液相色谱纯化分离，采用甲醇-水洗脱，收集30.4分钟的洗脱液结晶即得。
所述加热回流提取中云实种子与乙醇的质量体积比为1:8-1:12。
所述氯仿-甲醇洗脱液中氯仿与甲醇的体积比为40:60-55:45。
所述甲醇-水洗脱液中甲醇与水的体积比为68:32。
14β-羟基-12α-甲氧基-6α,7β-二乙酰基-1-羰基-卡山烷二萜-13,15-双键-16,12-内酯为无色粉末，易溶于氯仿，甲醇，将14β-羟基-12α-甲氧基-6α,7β-二乙酰基-1-羰基-卡山烷二萜-13,15-双键-16,12-内酯进行体外抗肿瘤药效学实验，体外抗肿瘤药效学实验利用MTT比色法。
以14β-羟基-12α-甲氧基-6α,7β-二乙酰基-1-羰基-卡山烷二萜-13,15-双键-16,12-内酯为实验组，以Doxorubicin（多柔比星，抗肿瘤药物）为对照组，同时设立空白组，实验组、对照组和空白组选取HeLa（人宫颈癌）细胞、KB（人口腔表皮样癌）和HT-29(人结肠癌)细胞为实验对象，培养基稀释后，以6×104/ml的密度接种于96孔板，每孔100μl，培养箱中正常培养24小时后，各组加入相对应的药物，使各组药物的最终浓度分别为2.5 μg/ml (1组)，5 μg/ml (2组)，10 μg/ml (3组)，20 μg/ml (四组)，40 μg/ml (5组)，共设5个浓度，每个浓度3个复孔；培养48小时后，于每孔加MTT 10 μl染色；继续培养四小时后，吸弃原培养液，每孔加入DMSO 100μl，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，并于酶联免疫检测仪 570 nm 波长处检测光密度值，根据光密度值计算50%抑制浓度（IC50 ，μg/mL)，光密度值计算IC50的计算方法为现有公知技术。实验组、对照组对HeLa细胞、HT-29细胞和KB细胞的IC50如表1所示。
表1
| 组别 | HeLa细胞 | HT-29细胞 | KB细胞 |
| 实验组 | 47.3 ± 2.2 | 81.9 ± 1.6 | >100 |
| 对照组 | 1.4 ± 0.21 | 0.97 ± 0.36 | 0.82 ± 0.13 |
通过上表的数据可以看出，本发明所述的14β-羟基-12α-甲氧基-6α,7β-二乙酰基-1-羰基-卡山烷二萜-13,15-双键-16,12-内酯对HeLa细胞、HT-29细胞和KB细胞均具有一定的抑制作用，能够作为制备防治肿瘤药物的原料，具备较强的产业化应用价值。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
首次从云实种子中分离得到了具有重要抗肿瘤活性的14β-羟基-12α-甲氧基-6α,7β-二乙酰基-1-羰基-卡山烷二萜-13,15-双键-16,12-内酯，并利用现代分析手段确定了其化学结构和理化性质。经功能性试验证明：14β-羟基-12α-甲氧基-6α,7β-二乙酰基-1-羰基-卡山烷二萜-13,15-双键-16,12-内酯对肿瘤细胞具有一定的抑制作用，能够作为制备防治肿瘤药物的原料，具有较强的应用价值和市场前景。
附图说明
图1是14β-羟基-12α-甲氧基-6α,7β-二乙酰基-1-羰基-卡山烷二萜-13,15-双键-16,12-内酯的分子结构示意图。
图2是7β-羟基-1α,2α,6α-三乙酰基-14β-羧甲基-卡山烷二萜-12(13),15(16)-双键-12,16-稠合呋喃的核磁共振氢谱（1H-NMR）。
图3是14β-羟基-12α-甲氧基-6α,7β-二乙酰基-1-羰基-卡山烷二萜-13,15-双键-16,12-内酯的核磁共振碳谱（13C-APT）。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作进一步的说明
第一步：云实种子(1.0 kg)干燥后粉碎过80目筛。第二步：药材粉末加10倍量乙醇加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，浓缩后得总浸膏62.0 g。第三步：云实种子总浸膏经100～200目硅胶拌样，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和甲醇洗脱，洗脱液减压浓缩至干。最终得到石油醚部位浸膏12.6 g，氯仿部位浸膏8.7 g，乙酸乙酯部位浸膏6.3 g，丙酮部位浸膏5.9 g，甲醇部位浸膏17.4 g。第四步：取氯仿层浸膏8.7 g经硅胶柱色谱(100～200目)分离，氯仿-甲醇(1:0-0:1)9梯度洗脱，得到9个馏分 Fr A-I。第五步：Fr.D部分经凝胶色谱洗脱，氯仿-甲醇（45-55）作为洗脱液洗脱除去色素，然后样品经反相中压色谱柱经甲醇-水(60:40; 80:20; 90:10)梯度洗脱，得到三个部份FrD1-3.第六步：其中FrD2经高效液相色谱纯化分离，采用甲醇-水(68:32)等度洗脱，收集30.4分钟的洗脱液结晶得到无色粉末，易溶于氯仿、甲醇。
上述无色粉末的结构表征和确认如下：
将上述所得无色粉末进行核磁共振氢谱（1H-NMR）和核磁共振碳谱（13C-APT）分析，1H-NMR谱图如图2所示，13C-APT谱图如图3所示。
对图2和图3进行图谱解析，将图2和图3各峰进行归属，图2和图3的峰归属如表2所示，通过图2、图3以及表1的数据可知，无色粉末的化学结构式如图1所示，根据有关化合物的命名规则命名为14β-羟基-12α-甲氧基-6α,7β-二乙酰基-1-羰基-卡山烷二萜-13,15-双键-16,12-内酯。
英文名为14β-hydroxyl-12α-methoxyl-6α,7β-diacetoxyl-1-oxo-cass-13,15-diene-16, 12-olide。
表2
| 位置 | δ H | δ C |
| 1 | 211.2 | |
| 2 | 2.31,m; 2.74,m | 35.3 |
| 3 | 1.78,m; 1.89,m | 39.2 |
| 4 | 38.9 | |
| 5 | 82.6 | |
| 6 | 5.45,d, 8.0 | 74.9 |
| 7 | 5.54,t, 8.0 | 72.2 |
| 8 | 1.85,m | 50.8 |
| 9 | 2.70,m | 34.2 |
| 10 | 55.1 | |
| 11 | 1.15,m;3.02,dd, 13.2, 1.8, | 37.4 |
| 12 | 107.1 | |
| 13 | 173.3 | |
| 14 | 75.1 | |
| 15 | 5.99, s | 115.4 |
| 16 | 169.6 | |
| 17 | 1.51, s | 20.5 |
| 18 | 1.11, s | 29.0 |
| 19 | 1.27, s | 25.9 |
| 20 | 1.39, s | 15.3 |
| OAc-6 | 2.07, s | 21.5/169.7 |
| OAc-7 | 2.01, s | 21.6/170.7 |
| OCH3-12 | 3.14, s | 51.8 |
上述只是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围的情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应落在本发明技术方案保护的范围内。
Claims (7)
1.一种化合物，其特征在于：具有如下式所示结构
。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：该化合物为无色粉末，易溶于氯仿、甲醇。
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：该化合物对HeLa细胞、HT-29细胞和KB细胞均具有抑制作用。
4.权利要求1或2或3所述化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.一种权利要求1或2或3所述化合物的制备方法，其特征在于：云实种子干燥后粉碎过筛，加乙醇加热回流提取3次，每次1-3小时，合并提取液，减压回收溶剂，浓缩后得总浸膏，总浸膏经100～200目硅胶拌样，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和甲醇洗脱，洗脱液减压浓缩至干；取氯仿层浸膏用硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇的体积比由1:0过渡到0:1进行9梯度洗脱，得到9个馏分 Fr A-I，Fr.D部分经凝胶色谱洗脱后再用氯仿-甲醇作为洗脱液洗脱除去色素，然后样品经反相中压色谱柱经甲醇-水的体积比分别为60:40、80:20和90:10三梯度洗脱，得到三个部份FrD1-3，其中FrD2经高效液相色谱纯化分离，采用甲醇-水洗脱，收集30.4分钟的洗脱液结晶即得；所述甲醇-水洗脱液中甲醇与水的体积比为68:32。
6.根据权利要求5所述化合物的制备方法：其特征在于：所述加热回流提取中云实种子与乙醇的质量体积比为1:8-1:12。
7.根据权利要求5所述化合物的制备方法：其特征在于：所述氯仿-甲醇洗脱液中氯仿与甲醇的体积比为40:60-55:45。
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