CN115073619B - 一种绞股蓝中性多糖及其提取方法和抗新冠病毒的应用 - Google Patents

Abstract

本方案公开了医药技术领域的一种绞股蓝中性多糖，包括甘露糖、葡萄糖和半乳糖；制备过程包括以下步骤：S1、称取干燥的绞股蓝茎叶，加入绞股蓝茎叶5～15倍重量的蒸馏水浸泡12～14h；S2、取浸泡后的绞股蓝茎叶水煮提取2～5次，每次2～5h；S3、合并多次水煮液后浓缩，用乙醇醇沉，冻干得到绞股蓝总多糖(GPP)；S4、将绞股蓝总多糖(GPP)配置成溶液上样于离子交换柱，上样后使用3倍柱体积的蒸馏水洗脱；S5、取S4步骤的洗脱液，浓缩透析后，冻干得到绞股蓝中性多糖(GPPN)。本发明得到的绞股蓝中性多糖GPPN可作为抗新冠肺炎的新药或者作为开发抗新冠肺炎新药重要药物中间体。

Description

一种绞股蓝中性多糖及其提取方法和抗新冠病毒的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及一种绞股蓝中性多糖及其提取方法和抗新冠病毒的应用。

背景技术

新冠肺炎病毒SARS-Cov-2属于典型的冠状病毒，膜表面的刺突糖蛋白(S，SpikeProtein)是与靶细胞受体结合的位点，Spike蛋白含有S1亚基和S2亚基。S1亚基主要包含有受体结合区，S1亚基与靶细胞膜上的ACE2蛋白结合，具有结合细胞作用，是主要的抗原位点。

针对新冠病毒的药物研发，包括病毒疫苗和抗体的研发，中药方剂的研发，化学药物的研发等。而化学药物均具有一定的毒副作用，氯喹、阿比朵尔、瑞德西韦等化学药物虽然对新冠病毒肺炎有一定的疗效，但是其毒性和副作用依然很大，造成了不可预知的病患死亡；中药方剂对于新冠病毒具有很好的疗效，是抗新冠病毒药物研发中最具潜力的。中药多糖是中药的活性成分之一，多糖具有多种寡糖末端，与糖蛋白结合域具有非常高的相似性，有报道称中药多糖具有很好的抗病毒活性，而且多糖具有多靶点，低毒副作用等生物活性，对于新型冠状病毒肺炎疾病(COVID-19)的预防和改善有很好的研究前景。

绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum Makino)属葫芦科草本植物，为多年生攀援草木，又称七叶胆、小苦药、天堂草、遍地生根、五叶参或七叶参。主要分布于中国、日本、朝鲜等国。我国作为绞股蓝的分布中心，绞股蓝资源主要分布于岭和长江以南地区，如湖南、湖北、广西、广东、贵州以及云南等省份。绞股蓝首次记载于朱橚编纂的《救荒本草》中，作为一种饥荒时的野菜使用。李时珍在《本草纲目》记载绞股蓝有“治疮疖、虫咬、凉血解毒、利小便”等疗效，第一次对绞股蓝的药用价值进行了明确阐述。研究发现,绞股蓝具有多种生物活性,如调节机体免疫力,抗氧化,降低血脂,心血管保护等。中药绞股蓝常以全草或根茎入药，其对高血脂症、高血压、冠心病等心血管系统疾患以及糖尿病、肿瘤等病症具有良好的防治效果，长期服用无毒副作用。含有多种化学成分，其中绞股蓝多糖是其活性成分之一。目前对绞股蓝的研究重点集中在降糖降脂、抗氧化，关于以Spike/ACE2的配体受体结合通路为靶点，研究绞股蓝中性多糖的抗新冠病毒的生物功能及机制的内容未见报道。

发明内容

本发明意在提供一种绞股蓝中性多糖。

本方案中的一种绞股蓝中性多糖(GPPN)，包括甘露糖、葡萄糖和半乳糖。

进一步，所述甘露糖、葡萄糖和半乳糖分别占绞股蓝中性多糖总质量的5％～7％、75％～85％和10％～15％。

进一步，所述绞股蓝中性多糖中，甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1：12.95：1.93。

本发明的目的之二是提供一种绞股蓝中性多糖(GPPN)的提取方法，包括以下步骤：

S1、称取干燥的绞股蓝茎叶，加入绞股蓝茎叶5～15倍重量的蒸馏水浸泡12～14h；

S2、取浸泡后的绞股蓝茎叶水煮提取2～5次，每次2～5h；

S3、合并多次水煮液后浓缩，用乙醇醇沉，冻干得到绞股蓝总多糖(GPP)；

S4、将绞股蓝总多糖(GPP)配置成溶液上样于离子交换柱，上样后使用3倍柱体积的蒸馏水洗脱；

S5、取S4步骤的洗脱液，浓缩透析后，冻干得到绞股蓝中性多糖(GPPN)。

进一步，S3步骤中水煮液浓缩时，将合并的水煮液浓缩至小体积，3500r/min～4500r/min离心15min～25min，收集上清液。

进一步，S3步骤中乙醇醇沉时，向S3步骤中收集的上清液中加入其3.5～4.5倍体积的95％乙醇醇沉过夜；弃去醇沉上清液后，将沉淀在3500r/min～4500r/min离心15min～25min，收集沉淀。

进一步，S3步骤中冻干时，向S3步骤中乙醇醇沉后获得的沉淀中加入适量蒸馏水溶解，加热挥发尽乙醇后，在-85℃～-75℃的温度下过夜，冻干。

进一步，所述离子交换柱选用DEAE Sepharose Fast Flow。

本发明以Spike/ACE2的配体受体结合通路为靶点，研究绞股蓝多糖的抗新冠病毒的生物功能及机制，发现本发明得到的绞股蓝中性多糖GPPN级分，在5mg/mL浓度下能显著抑制A549细胞膜上的ACE2蛋白与Spike-S1-FITC蛋白(FITC荧光蛋白结合的spike蛋白S1亚基基团)的结合，说明绞股蓝中性多糖GPPN可作为抗新冠肺炎的新药或者作为开发抗新冠肺炎新药重要药物中间体，功能性保健食品的天然原料。

附图说明

图1为绞股蓝中性多糖GPPN中单糖组成测定图。

图2为通过流式细胞仪检测到的空白组细胞的光密度值示意图。

图3为通过流式细胞仪检测到的模型组中A549细胞的光密度值示意图。

图4为通过流式细胞仪检测到的药物组中A549细胞的光密度值示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

1、一种绞股蓝总多糖的提取方法，包括以下步骤：

称取干燥的绞股蓝茎叶500g于煎药机中，加绞股蓝茎叶10倍重量的蒸馏水浸泡过夜(13h)，再加入6L蒸馏水煮3h，收集滤液，重复此操作三次，合并三次滤液。将三次收集滤液浓缩至小体积，4000r/min离心20min，收集上清液。上清液中加入其4倍体积的95％乙醇醇沉过夜。小心倾倒弃去醇沉上清液后，将沉淀4000r/min离心20min，收集沉淀。沉淀加入适量蒸馏水溶解，加热挥尽乙醇后，放入-80℃冰箱过夜，冻干。干燥后，合并称重，得到绞股蓝总多糖52.5g，收率为10.5％。

2、绞股蓝中性多糖分级制备：

称取5g绞股蓝总多糖GPP配制成100mg/mL的溶液上样于平衡好的DEAE SepharoseFast Flow离子交换柱，分别使用dH2O、0.35M NaCl和0.6M NaCl洗脱3倍柱体积，用苯酚-硫酸法检测是否洗脱完毕，将收集到的不同级分分别进行透析除盐、浓缩冻干，得到绞股蓝中性多糖GPPN、GPPA1和GPPA2三个级分收率分别为56.3％、9.1％、5.2％。

3、绞股蓝中性多糖的单糖组成分析：

HPLC条件：流动相组成为乙腈：磷酸缓冲盐＝18.2:81.8。检测器型号：VarianProstar325，检测波长：254nm。色谱柱型号：Thermo ScientificODS-2(c18)Hypersil Dim.(mm)150×4.6；柱温：35℃。进样量：20μL，流速：1mL/min。

样品前处理：

(1)酸水解：称取2mg绞股蓝中性多糖样品置于棕色小瓶中，使其溶于2mL浓度为4M/L的三氟乙酸(TFA)，加盖密封。在110℃的条件下加热水解4h，取出冷却至室温，使用甲醇减压浓缩，重复操作直至除尽TFA。蒸干后，残渣溶解200μL蒸馏水中。

(2)PMP衍生化：取100μL(1)中的完全酸水解溶液，加入100μL浓度为0.6M的NaOH溶液中混匀，再加入200μL现配置的浓度为0.5M/L的PMP甲醇溶液，密封后涡漩混匀。水浴温度为70℃条件下反应100min后，冷却至室温，用200μL浓度为0.3M/L的HCl进行中和，加蒸馏水补足至1mL。再加入1mL三氯甲烷萃取，取出上层水相，多次重复萃取，尽量除尽PMP。涡旋后取15μL上清液进样分析。

(3)取100μL浓度为1mg/mL的单糖标准品(Man，Rha，Gal，GalA，Glc，GlcA，Xyl，Ara，Fuc)混合液，按样品PMP衍生同法处理，然后进样分析。

结果显示绞股蓝中性多糖GPPN主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为1：12.95：1.93。

4、绞股蓝中性多糖抗新冠肺炎病毒活性测定

人肺癌A549细胞培养于DMEM完全培养基，于37℃、5％CO₂饱和湿度的孵箱中贴壁培养，隔天换液，显微镜下观察待融合度达到90％后，用0.25％胰蛋白酶消化传代。

人肺癌A549细胞传代3代后，将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化，用70％乙醇于4℃固定12h。将固定后的细胞用PBS制备为细胞悬液后计数。

通过流式细胞仪检测绞股蓝中性多糖GPPN组分对Spike-S1-FITC蛋白与ACE2蛋白结合的抑制作用。

取一定量细胞悬液至EP管，设为空白组。取等量细胞悬液至EP管，加入Spike-S1-FITC蛋白，设为模型组。取等量细胞悬液至EP管，加入Spike-S1-FITC蛋白，加入绞股蓝中性多糖GPPN溶液，使药物浓度为0.5mg/ml，设为药物组。

将离心管置于4℃摇床，结合12h后，离心，留沉淀。用PBS重悬，混匀。通过流式细胞仪检测细胞的荧光量，以判断模型组和药物组细胞与Spike-S1-FITC蛋白的结合情况。

如图2所示，空白组的光密度值为0.384。由图3可知，模型组的细胞100％被荧光标记。且模型组光密度值为20.1，对比空白组可知建模成功。由图4可知，虽然药物组细胞100％被荧光标记，但光密度值为16.5,与模型组相比显著降低,可知药物组细胞结合spike-FITC蛋白的量减少。将3组数据用Flowjo软件处理后发现，模型组曲线与空白组曲线无交集，可知建模成功。药物组曲线较模型组曲线向右偏移更靠近空白组，说明药物组细胞与spike-FITC蛋白结合量相对模型组显著减少。由此证明绞股蓝总多糖对Spike-S1-FITC蛋白与ACE2蛋白结合的具有抑制功能。可以作为治疗新冠肺炎的潜在药物研发。本发明中绞股蓝中性多糖GPPN根据流式的结果可知，绞股蓝中性多糖GPPN对Spike-S1-FITC蛋白与ACE2蛋白结合的具有抑制功能。绞股蓝中性多糖可以开发成抗新冠肺炎病毒的药物。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (6)

1.一种绞股蓝中性多糖，其特征在于：包括甘露糖、葡萄糖和半乳糖，甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1：12.95：1.93。

2.根据权利要求1所述的一种绞股蓝中性多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、称取干燥的绞股蓝茎叶，加入绞股蓝茎叶5～15倍重量的蒸馏水浸泡12~14h；

S2、取浸泡后的绞股蓝茎叶水煮提取2～5次，每次2～5 h；

S3、合并多次水煮液后浓缩，用乙醇醇沉，冻干得到绞股蓝总多糖（GPP）；

S4、将绞股蓝总多糖（GPP）配置成溶液上样于离子交换柱，上样后使用3倍柱体积的蒸馏水洗脱；

S5、取S4步骤的洗脱液，浓缩透析后，冻干得到绞股蓝中性多糖（GPPN）。

3. 根据权利要求2所述的一种绞股蓝中性多糖的提取方法，其特征在于：S3步骤中水煮液浓缩时，将合并的水煮液浓缩至小体积，3500 r/min～4500 r/min离心15min～25min，收集上清液。

4. 根据权利要求3所述的一种绞股蓝中性多糖的提取方法，其特征在于：S3步骤中乙醇醇沉时，向S3步骤中收集的上清液中加入其3.5～4.5倍体积的95%乙醇醇沉过夜；弃去醇沉上清液后，将沉淀在3500 r/min～4500 r/min离心15min～25min，收集沉淀。

5.根据权利要求4所述的一种绞股蓝中性多糖的提取方法，其特征在于：S3步骤中冻干时，向S3步骤中乙醇醇沉后获得的沉淀中加入适量蒸馏水溶解，加热挥发尽乙醇后，在-85℃～-75℃的温度下过夜，冻干。

6. 根据权利要求3～5任一项所述的一种绞股蓝中性多糖的提取方法，其特征在于：所述离子交换柱选用DEAE Sepharose Fast Flow。

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