CN103037879B - 微量人参皂苷成分得到增加的新型加工人参或加工人参提取物的制备方法 - Google Patents

微量人参皂苷成分得到增加的新型加工人参或加工人参提取物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及加工人参或加工人参提取物的制备方法。尤其涉及人参皂苷含量得到增加的加工人参或加工人参提取物的制备方法。更详细地，本发明涉及制备皂苷分解酶后，利用所制得的皂苷分解酶和有机酸的水解作用，从而使微量人参皂苷成分得到增加的新型加工人参或加工人参提取物的制备方法及含有由此制备的加工人参或加工人参提取物的抗癌辅助剂组合物或药物组合物。

Description

微量人参皂苷成分得到增加的新型加工人参或加工人参提取物的制备方法
技术领域
本发明涉及制备皂苷分解酶后，利用所制得的皂苷分解酶和有机酸的水解作用，从而使微量人参皂苷成分得到增加的新型加工人参或加工人参提取物的制备方法及含有由此制备的加工人参提取物的抗癌辅助剂组合物领域。
背景技术
人参在植物分类学上属于五加科人参属，是多年生宿根植物，其种类约有11种。其中，作为代表的高丽人参（PanaxginsengC.A.Meyer）具有非常优异的药效。人参是一种非常广义的概念，其包含水参、白参、红参、山参、长脑参、尾参、元参等。人参作为价值很高的天然物，在中医学上，作为医药品使用，在很多医书中记载有人参的药效。虽然人参的使用历史非常悠久，但其科学的临床研究还处于非常低级的状态。即便如此，人参在西医盛行的现代也受着广泛青睐，强力把守着保健功能食品第一位，这是源于其显示出了在悠久的临床历史上所公认的药效，是一种副作用少，安全性高的天然药材。人参的主要的功能性成分是人参皂苷。人参皂苷是众多植物皂苷中特殊命名的。人参成分中的皂苷有抗癌、抗过敏、消炎、中枢抑制及安神、镇痛、改善记忆力、护肝、促进蛋白质及脂质合成、抗糖尿、抗抑郁、促进抗氧化活性物质的生成、调节免疫、抑制血小板凝聚、抗老化等药理效能。
皂苷根据结合在取代基的糖（葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖）的种类和数量分为多种人参皂苷，口服后几乎不会被活体消化酶分解（长谷川，H.等人.,健康与疾病状态微生物生态学，12，85-91，2000（Hasegawa，H.etal.,MicrobialEcololgyinHealthandDisease，12，85-91，2000）），在肠内菌作用下分解为20（S）-O-β-原人参二醇、20-O-β-D吡喃葡萄糖苷、20（S）原人参二醇及20（S）-原人参三醇后被吸收。（长谷川，H.等人.,药用植物，62,453-457,1996（Hasegawa，H.etal.,PlantaMedica，62,453-457,1996））但是肠内微生物状况按个体存在很大差异，因此皂苷的吸收根据个体而有所不同。
据目前已知的人参药理知识，作为显示药理效能的主要成分有人参皂苷Rb1，Rb2及Rc等皂苷。但实际上，含量极少的混合物（compound）K（compK），人参皂苷Rh1、Rh2、Rg3才是抗癌、抑制癌细胞转移或抗过敏的成分。取代基上结合有一个葡聚糖分子的人参皂苷Rh2，混合物K的抗癌、抗过敏、抗炎效果优异的同时，其糖链不多、亲水性低、因此肠内吸附及吸收率优异。为了将人参作为抗癌、抗过敏及增强免疫的药物使用，需要增加其含量极少或根本不含有的混合物K、人参皂苷Rh1、Rh2、Rg3等皂苷成分含量。
最近为了提高人参根本不含有或含量极少的人参有效成分（人参皂苷）及为了使人体容易吸收，人们开始尝试利用微生物发酵人参的方法，用酶处理人参的方法，或酸解人参的方法。例如公开有以下方法。利用硫酸、盐酸、制备易于吸收的酸法糖化人参的方法（韩国专利申请第2000-58997号），利用超高压提高人参有效成分的同时加工含红参特有人参皂苷的人参加工方法（韩国专利公开第2003-87250），在人参或红参中接种泡菜乳酸菌，包括使用有机酸处理步骤的发酵人参或发酵红参的制备方法（韩国专利公开第2006-1834号），以曲霉发酵人参后，以使用淀粉分解酶及蛋白分解酶进行分解作为特征的功能性及感官性能优异的人参发酵液的制备方法（韩国专利公开第2003-61756号），以干酪乳杆菌菌株（LactobacilluscaseiHasegawa）分解人参内的糖苷成分，含有其分解所得物质的发酵人参（韩国专利公开第2006-74970号），以多种乳酸菌菌株发酵人参得到的含皂苷分解物的发酵人参（韩国专利公开第1998-40224号）等。
发明内容
本发明需要解决的技术问题
为了使人参根本不含有或含量极少的人参皂苷含量得到增加，并且为了使体内容易吸收，人们试图进行了以下研究，如利用微生物发酵人参的方法、利用酶处理人参的方法、对人参进行酸解的方法等，但遗憾的是至今为止仍没有开发生产出具有高附加价值的人参产品。其原因在于，为了增强特定成分而使用高能源大量生产时，存在效率方面的问题，以及在利用多种微生物发酵的情况下，不能够生产出含有一定的标准有效成分含量的产品。
本发明的目的在于，改变人参的参皂苷的组成。
本发明的另一目的在于，增加人参的人参皂苷中的Rg3及Rh2含量。
本发明的再一目的在于，提供一种可有效提取人参内有效成分的方法。
本发明的又一目的在于，提供一种人参皂苷含量、特别是Rg3及Rh2成分含量高的人参提取物及含有其的抗癌辅助剂组合物。
解决技术问题的方法
本发明提供一种加工人参或加工人参提取物的制备方法，其包括以下步骤，（a）将黑曲霉（Aspergillusniger）接种到由人参及麦麸构成的培养基中；（b）对上述步骤（a）的菌进行培养；（c）精制上述步骤（b）的培养物；（d）从上述步骤（c）的精制物中分离酶；（e）向人参或红参中添加上述步骤（d）的酶；（f）对上述步骤（e）的添加物进行发酵；（g）对上述步骤（f）的发酵物进行分离；（h）对上述步骤（g）的上清液进行浓缩；（i）将上述步骤（h）的浓缩物与有机酸进行反应；以及（j）将上述步骤（i）的反应物进行中和及过滤、精制、浓缩、干燥。
根据本发明的另一实施方式，本发明的制备方法的特征在于，增加人参皂苷含量，特别是增加Rg3及Rh2含量。所述方法包括以下步骤，（a）将黑曲霉接种到由人参及麦麸构成的培养基中；（b）对上述步骤（a）的菌进行培养；（c）精制上述步骤（b）的培养物；（d）从上述步骤（c）的精制物中分离酶；（e）向人参或红参中添加上述步骤（d）的酶；（f）对上述步骤（e）的添加物进行发酵；（g）对上述步骤（f）的发酵物进行分离；（h）对上述步骤（g）的上清液进行浓缩；（i）将上述步骤（h）的浓缩物与有机酸进行反应；以及（j）将上述步骤（i）的反应物进行中和及过滤、精制、浓缩、干燥。
本发明的加工人参或加工人参提取物的制备中,对使用的人参原产地没有特别限制，例如可以使用韩国、美国、日本、喜马拉雅、越南及中国人参，红参的情况下，可以使用细须和参根。
此外，本发明的加工人参或加工人参提取物的制备中所使用的人参可以是人参或红参，人参或红参的提取物粉末及提取液（extract）形态。所述提取物可以通过热水提取法、酒精提取法及混合提取法制得。对所述人参或红参粉的末化程度没有特别的限制，例如人参或红参提取粉末的粉末化程度的粒子大小可以是30~150目左右。所述提取液可以通过减压蒸馏法或薄膜蒸馏法制备。
进一步地，本发明中使用的所述人参可以选自人参的根、叶子及茎，红参可以从细须和参根中选择使用。
下面，对本发明进行详细的说明。
所述步骤（a）中使用的菌为黑曲霉，购自韩国生物资源中心的ACTC6985。所述步骤（a）的培养基，其人参粉末与麦麸重量比为1：1~1：5（g/g），优选为1：3。按上述比例配制好培养基后，在该培养基上接种黑曲霉。该步骤的黑曲霉接种，其是将黑曲霉孢子悬浮液孢子数按照每g培养基中接种5×105个孢子量进行接种，并使初期水分含量维持在50~80%，优选65%。
所述步骤（b）中的培养温度为25~40℃，优选维持在30℃，培养时间为3~7天，此时，皂苷分解酶的生产量达最高值。
所述步骤（c）和步骤（d）中，培养菌株结束后，添加0.02M醋酸钠缓冲溶液后，以Watman玻璃微纤维滤纸（Watmanglassmicrofiberfilter）过滤培养基后，为了完全去除孢子，再次以含有酶的0.22μm瓶顶过滤装置（bottletopfilter）过滤。利用超过滤膜（Ultrafilteration）对收集的过滤液进行过滤，精制混合酶液体，此时使用的过滤膜的截留分子量（cutoff）为100KDa。利用由此得到的浓缩精制皂苷分解酶液体，可以发酵红参或可以向精制的酶液中添加酒精等，分离皂苷分解酶。即，向提纯的皂苷分解酶液体中添加酒精，使蛋白质沉淀，可以获得块状皂苷分解酶，或者可以直接冷冻干燥酶液，获得粉末状皂苷分解酶。
所述步骤（e）和步骤（f）中使用的人参或红参，是向所述人参或红参粉末、人参或红参提取液或浓缩粉末中，以人参或红参粉末、人参或红参提取液或浓缩粉末的重量的5~20%的量添加所述皂苷分解酶后，在适当的发酵温度25~60℃，优选在30~35℃条件下，培养6~24小时，优选为在1kg人参或红参提取液中添加30L水制备悬浮液后，添加50g酶。
所述步骤（g）中，向人参或红参发酵物中添加酒精，从而使皂苷分解酶沉淀，通过过滤（滤纸0.8μm）或离心分离，分离皂苷分解酶后，只收集上清液，在50℃条件下进行浓缩。
在步骤（i）中，向发酵的人参或红参中添加有机酸，在40~80℃下，反应2~18小时。所述有机酸没有特别的限制，可以使用乙酸，乳酸，柠檬酸，苹果酸及酒石酸等或它们的混合物。所述有机酸的浓度为：在所述步骤（h）的浓缩物中添加精制水，从而获得的浓度为10%的浓缩物溶液的1~50%（w/w），优选为5~25%（w/w）。
所述步骤（h）和步骤（j）中，对有机酸反应物进行中和时，可以使用作为食品添加剂的酸中和剂。而有机酸反应物的浓缩在50℃下进行，可以添加水或酒精后进行过滤、浓缩，也可以通过常规的精制过程进行精制后，进行浓缩。所述常规的精制过程有树脂及溶剂分流，即使用丁醇或乙酸乙酯等进行精制。
此外，本发明提供一种药物组合物及抗癌辅助剂。其是将通过本发明的制备方法制得的人参皂苷Rg3及Rh2含量得到增加的加工人参或加工人参提取物与现在临床上使用的抗癌剂联用，在使用时，具有增强的抗癌效果的同时，用于预防及治疗因抗癌剂引起的对骨髓、血细胞、肝脏或肾脏的毒性。所述抗癌剂相当于顺铂（cisplatin）、卡铂（carboplatin）、伯尔定（Paraplatin）、奥沙利铂（oxaliplatin）、奈达铂（Nedaplatin）、阿霉素（doxorubicin）、紫杉酚（taxol）、三苯氧胺（tamoxifen）、坎托贝尔（Camtobell）、氟脲嘧啶（Adrucil）、格列卫（Gleevec）、依托泊苷（etoposide）、唑来膦酸（Zometa）、长春新碱（Oncovin）、利普安（Lupron）、吉西他滨（gemzar）、5-氟尿嘧啶氟脲嘧啶（5-fluorouracil）、甲酰四氢叶酸（Leucovorin）、伊立替康（Irinotecan）等。
按照本发明的制备方法制得的人参皂苷Rg3及Rh2含量得到增加的加工人参或加工人参提取物，对于现有抗癌剂1重量份，优选联合使用0.1到1000重量份。其含量在上述范围内的情况下，可以表现出现有抗癌剂的增强的抗癌效果的同时，可有效降低因抗癌剂引起的毒性。
发明的效果
利用本发明的加工人参或加工人参提取物的制备方法，可以获得人参皂苷含量得到显著增加的人参或人参提取物。
利用本发明的加工人参或加工人参提取物的制备方法，可以得到人参皂苷中的Rg3和Rh2含量同时得到增加的加工人参或加工人参提取物。
本发明中，对仅使用皂苷分解酶进行发酵的人参和仅实施有机酸工序的加工人参，以及按照本发明的方法加工的加工人参中的人参皂苷Rg3和Rh2的含量进行比较的结果如下。可确认同时实施了皂苷分解酶工序和有机酸工序的加工人参中的Rg3及Rh2含量显著高于仅实施了皂苷分解酶工序和有机酸工序的加工人参。（表1）
此外，所述皂苷分解酶是用由人参和麦麸构成的培养基培养黑曲霉所得到的酶，该技术已在以酶改变人参皂苷糖基，从而制备稀少的人参皂苷的方法（韩国专利公开10-1999-45180号）等中公开。另外，霉菌的β-葡糖苷酶（β-Glucosidase），α-阿拉伯糖苷酶（α-arabinosidase），α-鼠李糖苷酶（α-rhamnosidase）的活性高，此外，其还分泌蛋白酶（Protease）、纤维素（Cellulose）等有利于发酵人参或红参等的酶。但现有技术中，发酵人参或红参的情况下，人参皂苷成分变化状况不稳定，很难生产出人参皂苷成分稳定的产品。
因此，本发明中，确认了用黑曲霉培养后，实施超过滤膜后的酶中存在β-葡糖苷酶、α-鼠李糖苷酶。并且所述酶是β-葡糖苷酶和α-鼠李糖苷酶以3：1~8：1的重量比混合的酶。与超过滤膜实施之前相比，该混合的酶的酶活性（activity）提高了2倍以上。用薄层色谱法（TLC）确认超过滤膜过滤的酶2和未过滤的酶1的活性，其结果为超过滤膜过滤的酶2的情况下，生成了F2、通过有机酸反应转变成Rh2，而未经过超过滤膜过滤的酶1生成了更多的化合物K（ComK）、其转变成Rh2的量很少。由此完成了本发明。（图4）
即，本发明采用从黑曲霉表达的混合酶物质中，精制出可表达更多的人参皂苷Rh2的酶的方法，生产出酶活性得到提高的、且β-葡糖苷酶与α-鼠李糖苷酶的比例一定的皂苷分解酶，从而可以调节人参皂苷各成分的变化，可以生产标准化加工人参或加工人参提取物。因此，本发明可以提供可同时增加Rg3及Rh2含量，且含一定量Rg3和Rh2的加工人参或加工人参提取物的标准制备方法，从而解决了现有技术中无法预测人参皂苷变化率的问题，同时可制备Rg3、Rh2含量同时得到增加的加工人参或红参。
此外，分别对皂苷分解酶精制后使用的情况下，存在酶精制时间长、成本高的问题。但本发明不仅可以按一定比率生产皂苷分解酶，且其精制过程简单，易于大量生产，精制收率高、还能降低生产成本。另外，混合多种微生物进行发酵的情况下，存在不同微生物之间的交叉污染问题，而本发明使用单一的霉菌—黑曲霉，从而解决了这一问题。
此外，本发明为了发酵人参或红参，生产皂苷分解酶后，用其发酵人参或红参，之后添加有机酸、进行水解，从而完成了本发明。与之相关的现有技术是利用泡菜乳酸菌的发酵人参或发酵红参的制备方法（韩国专利申请10-2005-94311号），其公开了以泡菜乳酸菌发酵人参或红参后进行有机酸处理，由此制备发酵人参或红参的方法。但通过上述现有技术制备的发酵人参或红参中几乎不包括Rh2，并且Rg3的含量也非常少。（图5、图6）
本发明以超过滤膜精制皂苷转换酶后，使用其来发酵人参或红参，通过添加有机酸完成了可同时增加Rg3和Rh2含量的加工人参或加工红参制备方法，从而解决了上述问题。
本发明的加工人参或加工人参提取物，其特征在于，优选地，加工人参中的人参皂苷Rg3及Rh2含量为0.05%~1%，加工人参提取物中，即使用人参浓缩液或红参浓缩液制备的加工人参提取物中的Rg3及Rh2含量为0.5%~5%，使用人参浓缩液粉末或红参浓缩液粉末制备的加工人参提取物中的人参皂苷Rg3及Rh2含量为0.5%~30%，之外，精制人参皂苷或红参皂苷而获得的加工人参提取物中的人参皂苷Rg3及Rh2含量为30%~50%。
此外，以本发明制备方法制备的人参皂苷Rg3、Rh2含量得到增加的加工人参或加工人参提取物可与现有临床使用的抗癌剂联用，可提高抗癌效果，可以预防由抗癌剂引起的对骨髓、血细胞、肝脏或肾脏的毒性。
附图说明
图1为皂苷成分根据人参提取液酶反应物与有机酸反应物的变化光谱。
图2为表示使标准品Re与本发明的酶反应时，通过确认生成Rg1，从而确认存在α-鼠李糖苷酶的光谱。
图3为表示使标准品Rg3与本发明的酶反应时，通过确认生成Rh2，从而确认存在β-葡糖苷酶的光谱。
图4为表示使用TLC确认步骤（c）和步骤（d）的超过滤膜过滤的酶2与未过滤的酶1活性的薄层色谱图，如图所示，酶2的情况下，生成了F2、通过有机酸反应转换成Rh2，而未经过超过滤膜过滤的酶1生成了更多的化合物K，其转换成Rh2的量很少。
图5是本发明与现有技术Rg3生成的比较光谱。
图6是本发明与现有技术Rh2生成的比较光谱。
具体实施方式
在此，通过实施例对本发明进行更详细的说明。这些只是为了更详细地说明本发明，根据本发明的技术思想，本发明的权利范围不受限于这些实施例。
实施例1：利用人参制备加工人参
放入250g人参粉末和750g麦麸，在121℃，1.5个大气压条件下，使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌。向灭菌后的培养基中放入2L灭菌水进行混合后，在28℃下，培养黑曲霉悬浮液（5×105个孢子/培养基重量g），培养7天。培养结束后，添加0.02M醋酸钠缓冲溶液，混合后过滤培养基。使用超过滤膜（100KDa以上）对过滤后的培养液进行过滤浓缩，获得60g酶液。向200g人参中添加30g酶液，在28℃下，培养18小时后，添加酒精，沉淀酶，浓缩上清液。向上述200g浓缩物中添加2L精制水后，添加250g柠檬酸，在50℃下，搅拌18小时。反应结束后，添加70%酒精，过滤，浓缩，获得了200g加工人参。
实施例2：利用人参浓缩液制备加工人参浓缩液
放入250g人参粉末和750g麦麸，在121℃，1.5个大气压条件下，使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌。向灭菌后的培养基中放入2L灭菌水进行混合后，接种黑曲霉悬浮液（5×105个孢子/培养基重量g），在28℃下，培养7天。培养结束后，添加0.02M醋酸钠缓冲溶液，混合后过滤培养基。使用超过滤膜（100KDa以上）对过滤后的培养液进行过滤浓缩，获得60g酶液。向200g人参浓缩液中添加30g酶液，在28℃下，培养18小时后，添加酒精，沉淀酶，浓缩上清液。向上述200g浓缩物中添加2L精制水后，添加250g柠檬酸，在50℃下，搅拌18小时。反应结束后，添加70%酒精，过滤，浓缩，获得了190g加工人参浓缩液。
实施例3：利用人参浓缩液粉末制备加工人参浓缩液粉末
放入250g人参粉末和750g麦麸，在121℃，1.5个大气压条件下，使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌。向灭菌后的培养基中放入2L灭菌水进行混合后，接种黑曲霉悬浮液（5×105个孢子/培养基重量g），在28℃下，培养7天。培养结束后，添加0.02M醋酸钠缓冲溶液，进行混合后过滤培养基。使用超过滤膜（100KDa以上）对过滤后的培养液进行过滤浓缩，获得60g酶液。向200g人参浓缩液粉末中添加30g酶液，在28℃下，培养18小时后，添加酒精，沉淀酶，浓缩上清液。向上述200g浓缩物中添加2L精制水后，添加250g醋酸，在50℃下，搅拌8小时。反应结束后，添加70%酒精，过滤，浓缩，干燥，获得了195g加工人参浓缩液粉末。
实施例4：利用红参制备加工红参
放入250g人参粉末和750g麦麸，在121℃，1.5个大气压条件下，使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌。向灭菌后的培养基中放入2L灭菌水进行混合后，接种黑曲霉悬浮液（5×105个孢子/培养基重量g），在28℃下，培养7天。培养结束后，添加0.02M醋酸钠缓冲溶液，进行混合后过滤培养基。使用超过滤膜（100KDa以上）对过滤后的培养液进行过滤浓缩，获得60g酶液。向200g红参中添加30g酶液，在28℃下，培养18小时后，添加酒精，沉淀酶，浓缩上清液。向上述200g浓缩物中添加2L精制水后，添加250g醋酸，在50℃下，搅拌8小时。反应结束后，添加70%酒精，过滤，浓缩，干燥，获得了195g加工红参。
实施例5：利用红参浓缩液制备加工红参浓缩液
放入250g人参粉末和750g麦麸，在121℃，1.5镉大气压条件下，使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌。向灭菌后的培养基中放入2L灭菌水进行混合后，接种黑曲霉悬浮液（5×105个孢子/培养基重量g），在28℃下，培养7天。培养结束后，添加0.02M醋酸钠缓冲溶液，进行混合后过滤培养基。使用超过滤膜（100KDa以上）对过滤后的培养液进行过滤浓缩，获得60g酶液。向200g红参浓缩液中添加30g酶液，在28℃下，培养18小时后，添加酒精，沉淀酶，浓缩上清液。向上述200g浓缩物添加2L精制水后，添加250g柠檬酸，在50℃下，搅拌18小时。反应结束后，添加70%酒精，过滤，浓缩，获得了190g加工红参浓缩液。
实施例6：利用红参浓缩液粉末制备加工红参浓缩液粉末
放入250g人参粉末和750g麦麸，在121℃、1.5镉大气压条件下，使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌。向灭菌后的培养基中放入2L灭菌水进行混合后，接种黑曲霉悬浮液（5×105个孢子/培养基重量g），在28℃下，培养7天。培养结束后，添加0.02M醋酸钠缓冲溶液，进行混合后过滤培养基。使用超过滤膜（100KDa以上）对过滤后的培养液进行过滤浓缩，获得60g酶液。向200g红参浓缩液粉末中添加30g酶液，在28℃下，培养18小时后，添加酒精，沉淀酶，浓缩上清液。向上述200g浓缩物添加2L精制水后，添加250g醋酸，在50℃下，搅拌8小时。反应结束后，添加70%酒精，过滤，浓缩，干燥，获得了195g加工红参浓缩液粉末。
实施例7：利用人参浓缩液粉末制备精制的加工人参提取物
放入250g人参粉末和750g麦麸，在121℃，1.5个大气压条件下，使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌。向灭菌后的培养基中放入2L灭菌水进行混合后，接种黑曲霉悬浮液（5×105个孢子/培养基重量g），在28℃下，培养7天。培养结束后，添加0.02M醋酸钠缓冲溶液，进行混合后过滤培养基。使用超过滤膜（100KDa以上）对过滤后的培养液进行过滤浓缩，获得60g酶液。向200g人参浓缩液粉末中添加30g酶液，在28℃下，培养18小时后，添加酒精，沉淀酶、浓缩上清液。向上述200g浓缩物中添加2L精制水后，添加250g醋酸，在50℃下，搅拌8小时。反应结束后，添加70%酒精，过滤，浓缩，干燥，获得了195g加工人参浓缩液粉末。之后使用树脂进行精制，获得10g加工人参提取物。
比较例1：仅使用皂苷分解酶进行发酵来制备加工人参浓缩液粉末
采用与实施例3相同的方法进行实验，但去除放入醋酸溶液的有机酸反应步骤，获得了加工人参浓缩液粉末。
比较例2：仅使用有机酸进行反应来制备加工人参浓缩液粉末
采用与实施例3相同的方法进行实验，但去除酶处理步骤，获得了加工人参浓缩液粉末。向200g人参浓缩液粉末中添加2L精制水后，添加250g醋酸，在50℃下，搅拌8小时。反应结束后，添加70%酒精，过滤，浓缩，干燥，获得了195g加工人参浓缩液粉末。
比较例3：以未提纯的皂苷分解酶处理的方式制备加工人参浓缩液粉末
采用与实施例3相同的方法进行实验，但使用了没有经过超过滤膜过滤工序进行精制的皂苷分解酶，并且进行了有机酸反应，从而获得加工人参浓缩液粉末。
本发明的加工人参或加工人参提取物皂苷含量变化如表1所示。
表1
加工人参或加工人参提取物皂苷含量变化
实验例1：皂苷分解酶的确认
将50mg标准品Rg3与50mg标准品Re试样分别放入20mM乙酸钠缓冲溶液中，添加本发明皂苷分解酶25mg后，在32℃下，恒温搅拌22小时。向各个酶反应物中放入丁醇，分层后，浓缩丁醇层后，通过高效液相色谱法（HPLC）进行确认。HPLC分析条件如下。
1）设备：资生堂纳米空间SI-2（ShiseidonanospaceSI-2）
2）色谱柱：CapcellPakC18UG804.6×150mm（5μm）
3）流速：1.00mL/min4）紫外波长（UVwavelength）：203nm
5）柱温：40℃6）注入量：20μL
7）流动相：①Re分析：20%乙腈（Acetonitrile）
②Rg3分析：将40%乙腈和60%乙腈进行40分钟浓度梯度洗脱。
实验结果，使标准品Re与本发明的酶反应时，可确认生成了Rg1，这说明本发明的皂苷分解酶中含有α-鼠李糖苷酶。另外，以相同实验方式，使Rg3标准品与本发明的酶反应时，可确认生成Rh2，这说明本发明的皂苷分解酶含有β-葡糖苷酶。（图2、图3）
实验例2：皂苷分解酶的TLC确认
分别取25mg培养皂苷分解酶后通过超过滤膜过滤的酶2及未过滤的酶1，使它们分别于50mg标准品Rb1反应后，确认TLC结果。展开剂为CHCl3：MeOH：H2O=7：2.5：0.5，显色剂（sprayreagent）为5%硫酸-茴香醛溶液。（图4）
实验例3：决定皂苷分解酶的比例
在4℃下，向本发明的皂苷分解酶中，缓慢添加重量体积比为50%的硫酸氨，搅拌均匀。以12000xG对上述酶液进行30分钟离心分离，只收集沉淀物。使该沉淀物溶解在0.01M醋酸钠缓冲溶液中，在同一缓冲溶液中进行渗析。使渗析后的酶液通过二乙胺基乙基纤维素柱，使酶吸附于柱上，放入0.01mol氯化钾进行分离。将分离后的酶的各个流分，只确认有酶活性的流分，只收集精制程度较好的β-葡糖苷酶与α-鼠李糖苷酶，确定比例。（参照表2）
表2
只收集精制程度较好的β-葡糖苷酶与α-鼠李糖苷酶的比例结果
实验例4：急性毒性测试
将实施例2中获得的加工人参浓缩液溶解在精制水，使浓度分别为100、300、500mg/mL浓度溶液，作为小鼠实验试料溶液。使用六周龄健康的雄性小鼠和雌性小鼠（ICR系），在给药试料前5小时内禁食，分别取5只雄性和雌性小鼠、作为1组，以0.5g/kg、1g/kg、2g/kg的试料投入量，经口给药10mL/kg。此外，对照组只投入相同量的精制水。在实验期间内，使实验动物自由摄取饲料及水。对所有实验动物投入试料溶液后持续观察30分钟临床症状，在实验期间内，每天观察1次临床症状。在给药前及给药后第1、3、7及14天测量了体重。对于体重的变化，使用studentst-检验法分析了对照组与给药组之间的差异。
在实验期间，所有动物没有一例死亡的情况，这说明加工人参提取液对白鼠的半数致死量（LD50）大于2g/kg。另外，与对照组相比，给药组没有表现出任何可认为由给药而引发的症状，也没有表现出体重的差异。并且，在观察期结束后，在尸检时，用肉眼也没有观察到脏器的异常。由以上结果可知，本发明的加工人参或加工红参的安全性优异。
实验例5：抗癌辅助剂组合物物的制备及效果
使用东方公司（株）（OrientCo.,Ltd.）提供的体重为20±2g，六周龄，雌性Balb/c-nu/nu小鼠作为实验动物，在温度为23±1℃，相对湿度为55±15%，以12小时间隔调节明暗的动物饲养室内进行了饲养，使老鼠自由摄入饲料一周，对其进行驯化，用肉眼观察症状。在驯化一周后的Balb/c-nu/nu小鼠的胁肋皮下分别移植100μLHT-29（1×107细胞/小鼠）后，进行肉眼观察。将肿瘤的尺寸达到200mm3的小鼠随机分组后，开始施用药物。体重及肿瘤体积的检测频率为每周2次，检测肿瘤体积时使用游标卡尺（verniercalipers）、测量长度（length）和宽度（width）。使用以下下公式计算检测的肿瘤体积，并实施到实验结束为止。
*肿瘤体积（mm3）=l×w2×0.5
（肿瘤体积=肿瘤的大小，l=长度，w=宽度）
所有实施例、比较例及各个与人参相关的浓缩液等以100mg/kgBW容量稀释到蒸馏水（DW）中，进行调制后，使用经口灌胃针（sonde），经口强制给药。给药量为以当天检测的体重为准，给药200μL/20g，实验物质的给药时间为每天一次，上午10点统一给药。FOLFOX（奥沙利铂）疗法以5-氟尿嘧啶（5-FU）/甲酰四氢叶酸（LV）+奥沙利铂（Ox）=16：5：1mg/kgBW浓度，溶解在0.9%的3mL的NaCl溶液中，按测量的体重，以每天1次的周期，初期每周腹腔给药5次。（下表3表示FOLFOX及比较例给药方法及给药量）
表3
FOLFOX及比较例投入方法及投入容量
小鼠死前，使用肝素化毛细管（heparinizedcapillary）（追逐仪器有限公司（ChaseinstrumentsCo.））从眼静脉采血，放入装有EDTA（K3）的试验管（舍伍德医疗有限公司（SherwoodmedicalCo.）），使用辊式混合机进行混合后，用库尔特计数器（Coultercounter）测定了WBC（白血球（whitebloodcell））、RBC（红血球（redvloodcell））、PLT（血小板（platelet））。在使用库尔特计数器前以4Cplus液校正WBC、RBC、PLT值，使之符合标准溶液值后，进行血液分析。而从心脏采取的血液，直接以3,000rpm、4℃条件进行10分钟离心分离，获得血清。利用采取的血清直接检测AST（转氨酶（aspartateaminotransferase)）、ALT（丙氨酸转氨酶（alanineaminotransferase））、血尿素氮（Bloodureanitroden），并在24小时内定量肌酸酐（creatinine）。下表4为对异种移植HT-29大肠癌细胞株的Balb/C裸鼠联合使用FOLFOX和给药本发明加工人参提取物等时，显示出的提高的抗癌效果。如表4所示，在使用HT-29大肠癌细胞株进行异种移植的Balb/C裸鼠中，给药FOLFOX与本发明的实施例等的情况下，可确认提高的联用效果。FOLFOX（5-Fu/LV+Ox=16：5：1mg/kgBW）处理方法为：移植细胞后肿瘤体积达到200mm3时，将老鼠随机分组，在初期5天，连续腹腔给药。药物组一律以100mg/kgBW的浓度每天口腔给药。给药4周后，结果为FOLFOX组与对照组相比，显示出了42.7%的癌生长抑制率。与此相反，作为同时给药FOLFOX和本发明实施例的组中，实施例2为74.6%，实施例3为80.2%，实施例6为77%，癌细胞生长抑制率呈上升地显著增加，这与没有使用本发明的制备方法制得的一般人参浓缩液或人参浓缩液粉末、红参浓缩液粉末进行处理的组，以及比较例2（58.7抑制）的条件相比，显示出了非常显著的抗癌效果。
表4
联用FOLFOX与本发明的加工人参提取物时提高的抗癌效果
下表5为对异种移植HT-29大肠癌细胞的Balb/C裸鼠联用FOLFOX与加工人参提取物时的血液生化分析结果。本实验中，施用4周药物等后，进行了血液生化分析。其结果为，FOLFOX给药组在WBC、RBC、PLT等方面大大低于对照组。与之相反，联用FOLFOX与本发明实施例的组，可确认因FOLFOX而下降的血液数值呈现恢复的倾向，其恢复率与没有按照本发明的制备方法制备的通常的人参浓缩液、人参浓缩液粉末、红参浓缩液粉末进行处理的组和比较例2相比，显示出了优异的血液生化数值的恢复结果。
表5
联用FOLFOX与加工人参提取物时血液生化分析结果
下表6为对异种移植HT-29大肠癌细胞的Balb/C裸鼠联用FOLFOX与加工人参提取物时，肾脏毒性及肝毒性变化分析结果。本实验中，施用4周药物等后，进行了肾脏功能评价指标BUN（血尿素氮）、肌酸酐（reatinine）及肝毒性指标AST、ALT分析。结果FOLFOX组在BUN（血尿素氮）、肌酸酐及AST、ALT方面，与对照组相比，显著增加，可确认肾脏毒性及肝毒性大大增加。与此相反，联用给药FOLFOX与本发明实施例的组，可确认因FOLFOX而升高的肾脏毒性及肝毒性的数值呈现出大大恢复的倾向，与没有按照本发明的制备方法制备的通常的人参浓缩液、人参浓缩液粉末、红参浓缩液粉末进行处理的组和比较例2相比，可确认显示出了优异的肾脏毒性及肝毒性的恢复结果。
表6
并用FOLFOX与加工人参提取物时肾脏毒性及肝毒性变化分析结果
工业实用性
人参的药理效能已通过很多研究查明，其产品开发也脱离了单纯提取或加工方法，在2000年之后，除了与人参发酵并用的技术之外，陆续出现了各种人参加工技术。但这些技术还存在以下问题。例如大量生产时的效率性问题，难以确立标准化的生产方法等。德国德国勃林格殷格翰公司的PAMATON作为人参的代表性产品，其也只不过是单纯通过人参的提取工艺制得的产品。但其年销售量达500亿美元以上。这是因为PAMATON是以标准生产工序生产出的含有一定量人参皂苷成分的产品。从而可知标准化生产方法对人参加工行业非常重要。而本发明完成了通过标准化生产工序生产Rg3、Rh2含量同时得到提高的加工人参或加工人参提取物的制备方法，此外，还提供了含有由上述方法制得的加工人参或加工人参提取物的抗癌辅助剂组合物，可将其应用于高附加值的人参产品开发中。

Claims (8)

1.一种人参皂苷Rg3及Rh2含量得到增加的加工人参提取物的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤，
(a)将黑曲霉接种到由人参及麦麸构成的培养基中；
(b)对上述步骤(a)的菌进行培养；
(c)用截留分子量为100KDa的超过滤膜精制上述步骤(b)的培养物；
(d)从上述步骤(c)的精制物中分离酶；
(e)向人参、红参、人参提取物或红参提取物中添加上述步骤(d)的酶；
(f)对上述步骤(e)的添加物进行发酵；
(g)对上述步骤(f)的发酵物进行分离；
(h)对上述步骤(g)的上清液进行浓缩；
(i)将上述步骤(h)的浓缩物与选自乙酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸及酒石酸中的一种以上的有机酸进行反应；
(j)将上述步骤(i)的反应物进行中和及过滤、精制、浓缩、干燥，所述步骤(c)(d)的酶为β-葡糖苷酶与α-鼠李糖苷酶以3：1～8：1的重量比生成的酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中的黑曲霉接种，其是将黑曲霉孢子悬浮液中的孢子数按照每g培养基中接种5×105个孢子量进行接种，并使初期水分含量维持在50～80％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(e)的酶的添加是将所述步骤(d)中的酶以人参、红参、人参提取物或红参提取物重量的5～20％进行添加。
4.根据权利要求1所述的物制备方法，其特征在于，所述步骤(f)的发酵是在25～60℃的发酵温度下，培养6～24小时。
5.一种人参皂苷Rg3及Rh2含量得到增加的加工人参提取物，其特征在于，其通过权利要求1～4中任一项所述的制备方法制得。
6.一种抗癌辅助剂组合物，其特征在于，其含有权利要求5中所述的人参皂苷Rg3及Rh2含量得到增加的加工人参提取物作为有效成分。
7.根据权利要求6所述的抗癌辅助剂组合物，其特征在于，所述抗癌辅助剂组合物与抗癌剂联用。
8.根据权利要求7所述的抗癌辅助剂组合物，其特征在于，所述抗癌剂选自顺铂、卡铂、伯尔定、奥沙利铂、奈达铂、阿霉素、紫杉酚、三苯氧胺、坎托贝尔、氟脲嘧啶、格列卫、依托泊苷、唑来膦酸、长春新碱、利普安、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、伊立替康中的一种以上。
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