CN102888437B - 一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法，具体涉及一种黑曲霉发酵转化各种二醇型人参皂苷，制备人参皂苷Rd的微生物转化的方法。本方法中，采用一株高转化的工业黑曲霉，菌种保藏号CICC40426，在全自动发酵罐中，发酵转化各种二醇型人参皂苷，并通过大孔树脂纯化和结晶，制备高纯度人参皂苷Rd。本发明工艺简单、成本低、收率高，且绿色环保；本发明方法能实现人参皂苷Rd的产业化制备，扩充人参皂苷Rd药物资源来源，满足广阔的医疗保健的市场需要，具有极大价值。

Description

一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法，具体涉及一种用黑曲霉发酵转化各种二醇型人参皂苷制备人参皂苷Rd的微生物转化的方法。

技术背景

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是我国传统的名贵中药材，化学成分复杂，生物活性广泛，药理作用独特。随着现代分离和分析技术的进步，人参中的化学成分得到了进一步的阐明，人参皂苷是这些分离的组分中主要的生物活性物质，到目前为止，已分离鉴定的人参皂苷单体有50余种。

有研究公开了有关人参皂甙Rd已经通过中山大学医学院关永源实验证实可作为一种新型钙离子拮抗药物，该人参皂甙Rd可通过血管平滑肌细胞受体介导(ROCC)和钙池调控(SOCC)钙离子通道途径显著的特异性抑制Ca2+内流，然而对血管平滑肌细胞电压依赖的钙离子通道(VDCC)和Ca2+释放未见明显作用。动物实验还表明，该Rd能明显抑制高血压脑血管重构，降低SHRSP大鼠中风率及死亡率，保护脑细胞。上述研究结果同时也提示了人参皂苷Rd新药一旦开发成功用于急性缺血性脑卒中病的治疗具有非常大的市场空间。目前，国内广东泰禾医药科技有限公司已经开发Rd注射液作为治疗脑中风新药，并进入了III期临床试验总结阶段，但其中的药用来源的Rd主要从天然的人参总皂苷中直接提取；众所周知的原因，由于天然Rd含量非常稀少，获取渠道单一，因此其市场价格十分昂贵。

本领域公知，所述的人参皂苷Rd在人参中含量较低，只有0.2％左右，因其结构复杂，化学合成该人参皂苷Rd至今尚未成功；有研究从人参、三七等植物根、茎、叶中提取获得Rd单体，由于其提取方法收率低，成本较高，明显影响了医疗保健市场需求的进一步扩大，因此有必要开发一种产率高，纯度好，并且简单易行的制取人参皂苷Rd的方法。目前，有研究试图利用加化学方法将主要皂苷转化为活性更高的稀有皂苷，但是上述化学方法中水解条件较剧烈，不易控制，且在水解过程中常使皂苷元发生脱水、环合、差向异构、羟化等反应，产生较多副产物，很难得到目标产物；而由于生物转化的区域和立体选择性强、反应条件温和，使得本领域研究者青睐于采用酶转化法和微生物转化法制备稀有人参皂苷；但所获得的人参皂苷Rd及其转化过程中仍存在如下述的缺陷与不足：

Kim M.M等筛选了一株β-糖苷酶高表达的菌株Sphingomonas echinoides GP50，并利用其转化人参皂苷Rb1制备Rd，但转化率仅为65％。CN200810200086.7公开了运用底物耐受诱变获得了一株高耐受、高转化的拟青霉菌Paecilomyces sp.4685，通过条件优化转化率达到85％，投料量最大为2％，但只局限于摇瓶工艺。Ye L.等通过LiCl诱变获得一株高转化菌株Paecilomyces Bainier sp.229-7，进行了6L发酵，转化率可以达到90％，但最终获得的产品的纯度仅为92％。

因此，目前迫切需要一种工艺简单、成本低、收率高、且绿色环保的制取人参皂苷Rd的方法。

与本发明有关的参考文献有：

Sanada S，Kondo N，Sgoji J，et al.Studies on the saponins of ginseng，I Structure of ginsenoside Ro，Rb，Rb1，Rd[J].Chem Pharm Bul1，1974，22：421-428.

Sanada S，Kondo N，Sgoji J，et al.Studies on the saponins of ginseng，I Structure of ginsenoside Re，Rf，Rg[J].Chem Pharm Bull，1974，22，2407-2412.

Yahara S，Tanaka O.and Komori T.Saponin of leaves of Panax ginseng C.A.Meyer[J].Chem PharmBull，1976，24：2204-2208.

Guan Y.Y.，Zhou J.G.，Zhang Z.，et al.Ginsenoside-Rd from panax notoginseng blocks Ca2+influxthrough receptor-and store-operated Ca2+channels in vascular smooth muscle cellsEuropean[J].Journal of Pharmacology，2006，548：129-136.

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Kim M.M.，Lee J.W.，Lee K.Y.，et al.Microbial conversion of major ginsenoside Rb1 topharmaceutically active minor ginsenoside Rd[J].The Journal of Microbiology，2005，43：456-462.

周珮，史训龙，冯美卿等.一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法[P].CN200810200086.7，2008-9-18.

Ye L.，Zhou C.Q，Zhou W.，et al.Biotransformation of ginsenoside Rb1 to ginsenoside Rd by highlysubstrate-tolerant Paecilomyces bainier 229-7[J].Bioresource Technology，2010，101：7872-7876。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法，具体涉及一种用黑曲霉发酵转化各种二醇型人参皂苷制备人参皂苷Rd的微生物转化的方法；该方法可简便、高效、环保、规模化制备高纯度人参皂苷Rd。

本发明方法中，采用高转化的工业黑曲霉，在全自动发酵罐中，发酵转化各种二醇型人参皂苷，通过大孔树脂纯化和结晶，制备高纯度人参皂苷Rd；本发明方法中所采用的黑曲霉为由中国微生物菌种保藏管理委员会工业微生物保藏中心保藏的黑曲霉(Aspergillus niger)，菌种保藏号CICC40426。

具体而言，本发明的利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于，其包括步骤：

(1)将筛选的黑曲霉(Aspergillus niger，菌种保藏号CICC40426)置于发酵培养基中，培养后；

(2)采用流加方式添加二醇型人参皂苷于全自动发酵罐中，进行发酵转化；

(3)添加大孔树脂于全自动发酵罐中，富集产物；

(4)采用HP20ss大孔树脂进行柱层析纯化，制得人参皂苷Rd；

(5)采用结晶方法对步骤(4)制得的人参皂苷Rd进行纯化，制得高纯度人参皂苷Rd。

本发明中，所述步骤(1)的发酵培养基为以麸皮、蔗糖、葡萄糖、淀粉之中的一种或几种培养基作为碳源，以酵母粉、蛋白胨及黄豆粉之中的一种或几种培养基作为氮源组成。

本发明中的黑曲霉(Aspergillus niger)，培养条件粗狂，营养条件不苛刻，可生长于上述发酵培养基之中；

本发明中，所述步骤(2)的二醇型人参皂苷选自人参皂苷Ra1、Ra2、Rb1、Rb2、Rb3或Rc中的任何一种或组合物，也可为从人参或三七等人参属植物中提取的二醇型人参总皂苷。

本发明中，步骤(2)所述的发酵转化，是在100L全自动发酵罐中进行发酵转化，发酵过程中，发酵温度为20-50℃，1％-30％磷酸调节发酵pH＝3-9，通气比0.1-10(v/v)，搅拌速率为100-1000rpm，发酵时间12-96h；

其中，二醇型人参皂苷的添加速度为1-500g/h，所述的各种二醇型人参皂苷的投料比例为0.1-10％；

本发明中，步骤(3)中所述的大孔树脂为弱极性或低极性大孔吸附树脂，选自AB-8、D101、HP60，HP20或XAD16等，添加量为0.1-30％，添加时间为二醇型人参皂苷投料后6-24h；

本发明中，所述步骤(4)中采用HP20ss大孔树脂进行柱层析纯化，通过一步层析使纯度到达80％以上；

本发明中，所述步骤(5)采用结晶方法对人参皂苷Rd进行纯化，其中所采用的有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮或乙酸乙酯，或上述溶剂的混合物，所述的有机溶剂浓度为20％～100％，所述的结晶温度为-20～40℃，所述的产品纯度达到98％以上。

本发明的利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法，工艺简单、成本低、收率高，且绿色环保；本发明方法能实现人参皂苷Rd的产业化制备，扩充人参皂苷Rd药物资源来源，满足广阔的医疗保健的市场需要，具有极大现实意义。

本发明与现有技术比较，具有如下突出的优点：

1)所采用的黑曲霉(Aspergillus niger，菌种保藏号CICC40426)为高转化的工业微生物菌株，该菌种在传代稳定性和工业化放大发酵方面，相比于诱变菌株具有非常大的优势；

2)制备过程中的发酵规模达到100L，通过流加方式投料、发酵液中添加大孔树脂吸附等步骤，使转化率可达到90％以上；

3)采用HP20ss树脂层析和结晶相结合，使产品纯化度可稳定在98％以上，达到国家食品药品监督管理局(SFDA)对新药的纯度要求。

附图说明

图1显示了本发明人参皂苷Rd的纯化结果，其中，

A：标准品图谱，人参皂苷Rb1，Rd，F2，C-K，

B：三七二醇型人参皂苷为底物转化，HP20吸附洗脱液，

C：HP20ss柱层析结果，

D：一次结晶，

E：重结晶。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。

实施例1菌株筛选

从中国微生物菌种保藏管理委员会工业微生物保藏中心购买不同菌株50株，采用以下摇瓶工艺进行筛选：

发酵培养基：蔗糖3％，黄豆粉3％，硫酸铵0.1％，硫酸镁0.1％，氯化钙0.1％，麸皮0.5％。培养基均装在250ml三角瓶中，装液量30ml，在121℃，灭菌20min。从马铃薯斜面接种，28℃，250rpm摇床上培养24h，加入5％的人参皂苷Rb1，继续培养48h。发酵结束，加入等体积乙醇提取。通过HPLC分析，确定菌种保藏号为CICC40426的黑曲霉为本发明的微生物转化制备人参皂苷Rd的菌株，其具有最佳的转化率，可达到60％左右。

实例2传代试验

采用实施例1发酵方法，以菌种保藏号为CICC40426的黑曲霉进行发酵，进行传代试验，结果如表1所示，传代20代以后，该菌种的Rd转化率依然十分稳定。

表1传代结果

实例3培养基的优化

采用实施例1发酵方法，以菌种保藏号为CICC40426的黑曲霉进行发酵，对培养基进行优化，碳源优化：分别考察了葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，乳糖，马铃薯，淀粉，麸皮作为碳源时，对Rd转化率的影响。结果麸皮，葡萄糖，蔗糖，淀粉为碳源时，具有较高Rd的转化率。迟效氮源：分别考察了玉米浆，棉籽粉，酵母粉，黄豆粉，蛋白胨，花生粉作为迟效氮源时，对Rd转化率的影响。结果酵母粉，黄豆粉，蛋白胨，为氮源时，具有较高Rd的转化率。在此基础上，利用统计学方法综合考察碳源，氮源以及微量元素及其含量对转化率的影响，目前得到的培养基为：麸皮3％；淀粉1％，葡萄糖2％，酵母粉2％，黄豆粉1％，蛋白胨0.5％，硝酸钠0.1％，硫酸镁0.1％，氯化钙0.1％，转化率可以达到80％以上。

实施例4

将所述的黑曲霉从马铃薯斜面接种实施例1中原始培养基500mL，28℃培养24h。接种种子罐，培养基为实施例2中优化所得培养基，工作体积8L，28℃培养12h。接种100L全自动发酵罐，培养基同种子罐，工作体积60L，种子液移种量6L，30℃培养，搅拌速率200rpm。培养24h后，搅拌速率调整为500rpm，通气量调整为1∶3(v/v)，流加人参皂苷Rb1 720g，流加速率为72g/h，5％磷酸控制pH5.0。发酵40h，搅拌速率调整为200rpm，通气量调整为1∶5(v/v)，按5％加入XAD16大孔树脂。72h发酵结束，滤布抽滤，收集滤饼，加入40L乙醇浸泡，搅拌3h，浸泡过夜。抽滤，2L乙醇洗涤2次，收集滤液，加水稀释到40％乙醇浓度，过HP20吸附树脂柱吸附，乙醇洗脱人参皂苷Rd。洗脱液减压浓缩至浸膏，经HP20ss柱层析分离纯化，65％乙醇-水洗脱，收集人参皂苷Rd组分，减压浓缩至浸膏，甲醇结晶，获得人参皂苷Rd 460g(摩尔转化率95％)，HPLC分析纯度为98.7％。

实施例5

将所述的黑曲霉从马铃薯斜面接种实施例1中原始培养基500mL，28℃培养24h。接种种子罐，培养基为实施例2中优化所得培养基，工作体积8L，28℃培养12h。接种100L全自动发酵罐，培养基同种子罐，工作体积60L，种子液移种量6L，30℃培养，搅拌速率200rpm。培养24h后，搅拌速率调整为500rpm，通气量调整为1∶4(v/v)，流加人参皂苷Rb3720g，流加速率为100g/h，5％磷酸控制pH5.0。发酵40h，搅拌速率调整为200rpm，通气量调整为1∶8(v/v)，按5％加入XAD16大孔树脂。72h发酵结束，滤布抽滤，收集滤饼，加入40L乙醇浸泡，搅拌3h，浸泡过夜。抽滤，2L乙醇洗涤2次，收集滤液，加水稀释到40％乙醇浓度，过HP20吸附树脂柱吸附，乙醇洗脱人参皂苷Rd。洗脱液减压浓缩至浸膏，经HP20ss柱层析分离纯化，65％乙醇-水洗脱，收集人参皂苷Rd组分，减压浓缩至浸膏，甲醇结晶，获得人参皂苷Rd 454g(摩尔转化率89％)，HPLC分析纯度为98.5％。

实施例6

将所述的黑曲霉从马铃薯斜面接种实施例1中原始培养基500mL，28℃培养24h。接种种子罐，培养基为实施例2中优化所得培养基，工作体积8L，28℃培养12h。接种100L全自动发酵罐，培养基同种子罐，工作体积60L，种子液移种量6L，28℃培养，搅拌速率200rpm。培养24h后，搅拌速率调整为500rpm，通气量调整为1∶5(v/v)，流加三七二醇型总皂苷1200g，流加速率为120g/h，10％磷酸控制pH5.0。发酵50h，搅拌速率调整为200rpm，通气量调整为1∶8(v/v)，按3％加入D101大孔树脂。84h发酵结束，滤布抽滤，收集滤饼，加入50L乙醇浸泡，搅拌3h，浸泡过夜。抽滤，2L乙醇洗涤2次，收集滤液，加水稀释到40％乙醇浓度，过HP20吸附树脂柱吸附，乙醇洗脱人参皂苷Rd。洗脱液减压浓缩至浸膏，经HP20ss柱层析分离纯化，60％乙醇-水洗脱，收集人参皂苷Rd组分，减压浓缩至浸膏，丙酮结晶，获得人参皂苷Rd 289g(质量转化率55％)，HPLC分析纯度为98.3％。

实施例7

将所述的黑曲霉从马铃薯斜面接种实施例1中原始培养基500mL，28℃培养24h。接种种子罐，培养基为实施例2中优化所得培养基，工作体积8L，28℃培养12h。接种100L全自动发酵罐，培养基同种子罐，工作体积60L，种子液移种量6L，28℃培养，搅拌速率200rpm。培养24h后，搅拌速率调整为500rpm，通气量调整为1∶5(v/v)，流加人参总皂苷2000g，流加速率为250g/h，10％磷酸控制pH4.5。发酵45h，搅拌速率调整为200rpm，通气量调整为1∶8(v/v)，按3％加入D101大孔树脂。96h发酵结束，滤布抽滤，收集滤饼，加入50L乙醇浸泡，搅拌3h，浸泡过夜。抽滤，2L乙醇洗涤2次，收集滤液，加水稀释到40％乙醇浓度，过HP20吸附树脂柱吸附，乙醇洗脱人参皂苷Rd。洗脱液减压浓缩至浸膏，经HP20ss柱层析分离纯化，60％乙醇-水洗脱，收集人参皂苷Rd组分，减压浓缩至浸膏，丙酮结晶，获得人参皂苷Rd 306g(质量转化率40％)，HPLC分析纯度为98.1％。

实施例8HPLC检测方法

色谱柱：Eclipse XDB C18

流速：1ml/min；

检测波长：203nm；

柱温：30℃，

流动相：如表2所示；

表2

时间(min)	乙腈(％)	水(％)
			0	30	70
20	60	40
			30	90	10

实例9结构鉴定

Rd鉴定的核磁数据，如表3所示。

表3 NMR chemical shift of compound ginsenoside Rd(C₅D₅N)

上述实施例的结果表明，本发明的利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法，工艺简单、成本低、收率高，且绿色环保；本方法采用了新的工艺，能实现人参皂苷Rd的产业化制备，扩充人参皂苷Rd药物资源来源，满足广阔的医疗保健的市场需要，具有极大价值。

Claims (7)

1.一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于，采用黑曲霉菌株，在全自动发酵罐中，转化各种非Rd二醇型人参皂苷，并在发酵过程中添加大孔树脂进行富集，最后经柱层析和结晶相结合的方法，制备高纯度人参皂苷Rd；其包括步骤：

（1）将黑曲霉置于发酵培养基中，培养；

（2）采用流加方式添加非Rd二醇型人参皂苷于全自动发酵罐中，进行发酵转化；

（3）添加大孔树脂于全自动发酵罐中，富集产物；

（4）采用HP20ss大孔树脂进行柱层析纯化，制得人参皂苷Rd；

（5）采用结晶方法对步骤（4）制得的人参皂苷Rd进行纯化，制得高纯度人参皂苷Rd。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的黑曲霉菌株是由中国微生物菌种保藏管理委员会工业微生物保藏中心保藏的黑曲霉Aspergillus niger，菌种保藏号CICC40426。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的发酵培养基为，以麸皮、蔗糖、葡萄糖、淀粉中的一种或几种培养基作为碳源，以酵母粉、蛋白胨及黄豆粉中的一种或几种培养基作为氮源组成。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的非Rd二醇型人参皂苷选自人参皂苷Ra1、Ra2、Rb1、Rb2、Rb3或Rc中的一种或组合物，或为从人参或三七人参属植物中提取的非Rd二醇型人参皂苷。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）的发酵过程中添加的大孔树脂为弱极性或低极性大孔吸附树脂，选自AB-8、D101、HP60、HP20或XAD16；大孔树脂的添加量为0.1-30%，添加时间为非Rd二醇型人参皂苷投料后6-24h。

6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，采用HP20ss大孔树脂进行柱层析纯化。

7.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）结晶中，采用的有机溶剂为乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯，或上述溶剂的混合物；所述溶剂浓度为20%～100%。