CN1477205A - 生物催化剂转化人参皂甙生产稀有人参皂甙的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种采用生化技术生产稀有人参皂甙的方法，特别是属于一种生物催化剂转化人参皂甙生产稀有人参皂甙的方法，其特征在于选取具有水解人参皂甙的活力菌株，用生物催化剂转化人参皂甙，其步骤是：选用木霉、青霉、黑曲霉及人肠道菌为生物催化剂；将具有降解人参皂甙能力的生物催化剂接种至人参总皂甙溶液；所述的人参总皂甙溶液经培养和转化、发酵、离心、吸附、洗涤工序后，即可获得稀有人参皂甙。本发明能够将中国人参、高丽人参、西洋参、三七参的总皂甙，或分离纯化后的个别皂甙，经生物催化剂转化，可获得富集Rg3、Rh2、C－K的人参皂甙混合物，用硅胶柱分离及溶剂提取可得高纯度皂甙，转化获得的稀有人参皂甙的生产率达10％。

Description

生物催化剂转化人参皂甙生产稀有人参皂甙的方法
                          技术领域
本发明涉及一种采用生化技术生产稀有人参皂甙的方法，特别是属于一种生物催化剂转化人参皂甙生产稀有人参皂甙的方法。
                          背景技术
人参在中国和东南亚地区的应用已有数千年，人参所具有的滋补强身作用也已闻名全世界，人参属于五加科人参属，常用的人参有中国人参(Panax ginseng)、高丽参(P.ginsen C.A.Meyer)、西洋参(P.quiqueflium L.)和三七人参(P.notoginseng Burk)等，经过近半个世纪的研究，从人参植物的根部和其它部位分离了人参皂甙、人参炔醇、人参多糖、多肽、有机酸及脂、甾醇、氨基酸和微量元素。而且，证明了人参皂甙(ginsenoside)是人参功效的主要成分，随着分离分析技术的进步，人参皂甙的分离、精制、分子结构及生物学功能已被逐一阐明，近年还证明了人参制剂中含量极低的Rg3、Rg5、Rh2、Rh3、C-K等具有抗癌活性，稀有人参皂甙可以从天然植物中提取，也可以用化学法合成获得，但由于Rh2在红参中的含量约为万分之二，其分离纯化十分困难；化学法合成因成本过高而无法工业化生产。酶是天然催化剂，是目前已知的催化效率最高、专一性最强、惟一的具备立体异构体选择能力、催化能力可调节、在生理条件下作用的催化剂。利用生物催化剂专一而高效地催化无数物质的转化方法，在食品和医药行业的应用有着悠久的历史，近60年酶制剂工业和固定化酶在工业应用中的发展更显示出生物催化剂在加速反应进行、提高产品质量和产率、降低成本和适于工业化方面具有极大的优势。上世纪以来，Akao报道人肠道菌可水解人参皂甙Rb1的糖甙链，最终形成化合物K(C-K)(Akao Tetal j.Pharmacol.1998，50：1155-1160)；在近几年，采用微生物分离人参皂甙β-葡萄糖甙酶用于水解Rg3生产Rh2的方法也有报道(Yu HS，MaXQ，Gao Y，Jin FX，J.Ginseng.Res 1999 22：50-54)。
                          发明内容
本发明的目的在于提供一种采用生物催化剂转化人参皂甙生产稀有人参皂甙的方法。
本发明的目的是采用这样的技术方案实现的：其特征在于选取具有水解人参皂甙的活力菌株，用生物催化剂转化人参皂甙，其步骤是：
(1)选用木霉、青霉、黑曲霉及人肠道菌为生物催化剂，
(2)将具有降解人参皂甙能力的生物催化剂接种至人参总皂甙溶液；
(3)所述的人参总皂甙溶液经培养和转化、发酵、离心、吸附、洗涤工序后，即可获得稀有人参皂甙。
本发明提供了生物催化剂在温和条件下含量高的人参皂甙可以转化成极具应用潜力的稀有皂甙的方法，采用上述方法能够将中国人参、高丽人参、西洋参、三七参的总皂甙，或分离纯化后的个别皂甙，经生物催化剂转化，可获得富集Rg3、Rh2、C-K的人参皂甙混合物，用硅胶柱分离及溶剂提取可得高纯度皂甙，转化获得的稀有人参皂甙的生产率达10％。
                      具体实施方式
本发明采用选取具有水解人参皂甙的活力菌株，用生物催化剂转化人参皂甙，其步骤是：
(1)选用LDW2045：木霉；LDW2014：青霉Penicillium sp.；LDW2077：黑曲霉Aspenrgillus sp.；LDW2216：双歧杆菌Bifidobacterium.；LDW2217：真细菌Eubacterium为降解人参皂甙的生物催化剂；
(2)将被选用的生物催化剂接种至人参总皂甙溶液；
(3)所述的接种有生物催化剂的人参总皂甙溶液经培养和转化、发酵、离心、吸附、洗涤工序后，即可获得稀有人参皂甙。
本发明所述的细胞和固定化细胞可在温和条件下依赖人参皂甙糖苷酶，将皂甙分子上的单糖除去，由于细胞中含有多种皂甙糖苷酶，会使人参总皂甙中含量较高的皂甙随着除去糖基成那些在薄层层析谱上有较高Rf值的稀有皂甙。采用LDW2014：青霉Penicillium sp.能够转化人参总皂甙混合产生富集Rh2产物；人肠道细菌LDW2216：双歧杆菌Bifidobacterium和LDW2217：真细菌Eubacterium也能使人参皂甙Rc转化成化合物K(C-K)。
本发明所述的生物催化剂转化人参皂甙生产稀有人参皂甙的方案，采用生物催化平台(由微生物细胞、酶、固定化细胞和固定化酶组成)和生物反应器在批式搅拌罐中、温和条件下高效专一地降解人参皂甙转化稀有皂甙的技术，所述专一高效水解人参皂甙的生物催化剂为经筛选得到的木霉、青霉、曲霉及人肠道菌等微生物，这些微生物为以盐析分离纯化专一用于人参皂甙的水解酶，以及以包埋法固定化细胞和以共价法固定化酶，多种固定化酶，固定化细胞可以联合起来形成反应器；本发明所述生物催化剂转化人参皂甙技术分别采用批式搅拌器、柱式连续流动、水/有机溶剂两项生物反应器，本发明所选用的转化原料为中国人参、高丽人参、西洋参、三七参的总皂甙，反应产物分别为富集Rg3、Rh2、C-K的人参混合物，经过硅胶柱分离及溶剂抽提即获得高纯皂甙。
固定化酶和固定化细胞引入人参皂甙的转化也为生物催化剂延长工作寿命，减少杂质带来好处，尤其在人参皂甙Rh3转化Rh2时显示了优势。
实施例1：
LDW2014菌(黑曲霉Aspenrgillus niger)接种到25ml3％葡萄糖-2.5玉米浆-30mg/ml人参总皂甙溶液，PH6.0，30℃旋转摇床140r.p.m上培养和转化60h；发酵转化液4000r.p.m离心，上清液经HZ-803大孔吸附树脂吸附，水洗涤，甲醇洗涤，获得菌转化的富集Rh2的人参总皂甙，Rh2生产率可达10％。
实施例2：
LDW2014菌(黑曲霉Aspenrgillus niger)接种到50ml3％葡萄糖-2.5玉米浆-0.1％(NH4)2SO4-0.1人参总皂甙培养基中，28-30℃，200r.p.m旋转培养48小时，4000r.p.m离心，上清液以30-70硫酸铵饱和度获取酶活力部分，透析后，Q-Sepharose纯化皂甙糖苷酶；可得酶G，酶G能用于水解Rg3，生产Rh2；
实施例3
LDW2014菌(黑曲霉Aspenrgillus niger)经实施例2硫酸铵沉淀与Q-Sepharose纯化的皂甙糖苷酶G(活力150U/ml，蛋白0.65mg/ml)6ml与1g环氧基的GM多孔载体混合，4℃搅拌反应3d砂芯漏斗过滤，固定化酶颗粒经50mm醋酸缓冲液-0.5MnaCl洗涤。即得固定化人参皂甙苷酶G；活力回收28％，固定化酶表现活力250U/g。
实施例4
LDW2077菌(青霉Penicillium sp)在Medium338，马铃薯蔗糖培养基100ml和1％鲜参抽提液中26℃转速200r.p.m摇床中培养60h，直接加入人参总皂甙水溶液30mg/ml，继续转化60h后停止反应，乙醇提取，过滤、减压蒸干，可得Rh2，测得Rh2转化率6.5％。
实施例5
LDW2077菌(青霉Penicillium sp)和LDW2014菌(黑曲霉Aspenrgillusniger)同时接种与Medium325麦芽汁培养液100ml(麦芽抽提液20g-葡萄糖20g-蛋白质1g/升)和鲜参抽提液，培养48h，200r.p.m离心后，除去上清，备用；同时取5g聚乙二醇加75ml水，80℃搅拌均匀，与细胞浆混匀，通过8#注射针头滴入5％硼酸溶液中，制成直径约为2mm颗粒，即得固定化细胞；用该固定化细胞再悬于人参总皂甙中，可获得10％转化为Rh2。

Claims (9)

1.一种生物催化剂转化人参皂甙生产稀有人参皂甙的方法，其特征在于选取具有水解人参皂甙的活力菌株，用生物催化剂转化人参皂甙，其步骤是：
(1)选用木霉、青霉、黑曲霉及人肠道菌为生物催化剂，
(2)将具有降解人参皂甙能力的生物催化剂接种至人参总皂甙溶液；
(3)所述的人参总皂甙溶液经培养和转化、发酵、离心、吸附、洗涤工序后，即可获得稀有人参皂甙。
2.根据权利要求1所述的生物催化剂转化人参皂甙生产稀有人参皂甙的方法，其特征在于所述的人参总皂甙为中国人参、高丽人参、西洋参、三七参的总皂甙。
3.根据权利要求1所述的生物催化剂转化人参皂甙生产稀有人参皂甙的方法，其特征在于所述的生物催化剂转化是指生物催化平台和生物反应器在批式搅拌罐中、温和条件下高效专一地降解人参皂甙转化稀有皂甙。
4.根据权利要求3所述的生物催化剂转化人参皂甙生产稀有人参皂甙的方法，其特征在于所述的生物催化平台由微生物细胞、酶、固定化细胞和固定化酶组成。
5.根据权利要求1所述的生物催化剂转化人参皂甙生产稀有人参皂甙的方法，其特征在于所述的生物催化剂为经筛选得到的木霉、青霉、曲霉及人肠道菌等微生物，这些微生物为以盐析分离纯化专一用于人参皂甙的水解酶，以及以包埋法固定化细胞和以共价法固定化酶，多种固定化酶，固定化细胞能联合形成反应器。
6.根据权利要求1所述的生物催化剂转化人参皂甙生产稀有人参皂甙的方法，其特征在于所述的生物反应器是指批式搅拌器、柱式连续流动、水/有机溶剂两项生物反应器。
7.根据权利要求1所述的生物催化剂转化人参皂甙生产稀有人参皂甙的方法，其特征在于所述的LDW2014菌(黑曲霉Aspenrgillus niger)接种到25ml3％葡萄糖-2.5玉米浆-30mg/ml人参总皂甙溶液，PH6.0，30℃旋转摇床140r.p.m上培养和转化60h；发酵转化液4000r.p.m离心，上清液经HZ-803大孔吸附树脂吸附，水洗涤，甲醇洗涤，获得菌转化的富集Rh2的人参总皂甙，Rh2生产率可达10％。
8.根据权利要求1所述的生物催化剂转化人参皂甙生产稀有人参皂甙的方法，其特征在于所述的LDW2014菌(黑曲霉Aspenrgillus niger)经实施例2硫酸铵沉淀与Q-Sepharose纯化的皂甙糖苷酶G(活力150U/ml，蛋白0.65mg/ml)6ml与1g环氧基的GM多孔载体混合，4℃搅拌反应3d砂芯漏斗过滤，固定化酶颗粒经50mm醋酸缓冲液-0.5MnaCl洗涤。即得固定化人参皂甙苷酶G；活力回收28％，固定化酶表现活力250U/g。
9.根据权利要求1所述的生物催化剂转化人参皂甙生产稀有人参皂甙的方法，其特征在于所述的LDW2077菌(青霉Penicillium sp)在Medium338，马铃薯蔗糖培养基100ml和1％鲜参抽提液中26℃转速200r.p.m摇床中培养60h，直接加入人参总皂甙水溶液30mg/ml，继续转化60h后停止反应，乙醇提取，过滤、减压蒸干，可得Rh2，测得Rh2转化率6.5％。
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