CN103627771A - 利用长枝木霉重构三七中的皂苷成分 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种木霉发酵改变三七中单体皂苷含量和组成成分的方法。该方法的操作步骤主要包括：（1）长枝木霉Trichoderma longibrachiatumRifai菌种的制备；（2）三七培养基的制备；（3）发酵培养条件；（4）产物后处理和主要功效成分检测。使用本发明所提出的木霉发酵三七的方法，直接以三七原药材作为发酵底物，使三七中皂苷的组成成分和含量发生明显变化，实现了三七有效成分的重构。
Description
技术领域
本发明属微生物技术领域，涉及一种木霉发酵改变三七中单体皂苷含量和组成的方法。
背景技术
三七[Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen]为五加科人参属植物，主产于云南，主要活性成分为三七总皂苷(Panax notoginseng saponins, PNS)。目前为止，已从三七中分离出70余种人参皂苷，均属达玛烷型四环三萜皂苷。按其皂苷元类型又可细分为两类：20(S)-原人参二醇型[20(S)-protopanaxadiol]和20(S)-原人参三醇型[20(S)-protopanaxatriol]。其中原人参二醇型皂苷包括Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rh2、Rg3、Rb3、C-K、PPD；原人参三醇型皂苷包括Rg1、Rg2、Re、R1、Rh1、F1、PPT。天然皂苷中含量较高的是Rg1、Rb1、Rd、R1、Rc、Re；含量甚微的稀有皂苷为Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、F1、F2、PPD、C-K、PPT。其中人参皂苷Rd的含量较Rg1和Rb1少很多，西洋参含0.1-0.2%，人参含0.2-0.3%，三七含0.5-0.7%。但Rd对心脑血管、神经系统、免疫系统等作用独特。目前，人参皂苷Rd已完成Ⅱ期临床试验，正在开展Ⅲ期临床研究，有可能成为治疗脑中风的新型临床治疗药物，同时，在镇痛、神经保护作用方面，人参皂苷Rd有比其它单体皂苷更强的活性。人参皂苷Rd在植物中含量少，化学结构复杂，化学合成至今尚未成功，目前仅能从原植物的根、茎、叶中提取，效率低，成本高，严重制约了人参皂苷Rd的开发利用
对人参皂苷不同时段体内代谢产物的研究表明：绝大多数天然人参皂苷在胃肠道中吸收较差，人参皂苷在胃液作用下只发生轻微的水解反应，代谢产物在肠液中酶或菌的作用下，糖苷键逐步断裂，将连在C3、C6、C20位的糖逐步降解成稀有皂苷才真正发挥药理作用。通过对皂苷活性的研究发现，人参皂苷的抗肿瘤活性与皂苷糖链结构的关系为：苷元 > 单糖苷 > 二糖苷 > 三糖苷 > 四糖苷。人参皂苷的结构因糖基侧链的不同，表现出性质和功能的较大差异，不同的人参单体皂苷具有不同的药理活性。日本学者Hasegawa经过多年研究，总结出了原人参二醇型（Rb1、Rd和Rc）皂苷口服后，在大肠中被肠道菌水解成C-K，然后进入血液发挥药理作用；原人参三醇型（Rg1、R1和Re）皂苷口服后，在大肠中被肠道菌水解成原人参三醇PPT，然后进入血液，由此得知大量人参皂苷是前药，真正发挥作用的是它们的代谢产物C-K以及苷元PPT，同时C-K可以进一步降解成PPD。
但是，这种体内的转化过程受到多种个体因素的制约，转化甚微。因此，采用微生物转化技术在体外有效地改造皂苷的糖链结构，重构三七总皂苷单体皂苷的种类和含量具有重要研究意义。
目前，得到稀有人参皂苷的方法主要有加热法、酸解法、碱解法、Smith降解法和酶法。化学法可以使皂苷水解，但它们的水解条件都十分剧烈，不易控制，水解副产物多，且易污染环境。生物法具有反应选择性强、反应条件温和、副产物少、不造成环境污染、后处理简单等优点。本发明以三七药材为主要培养基成分，用三七中分离得到的长枝木霉为菌种进行发酵，获得原药材中缺乏的活性成分，优化三七总皂苷中各皂苷的组成和比例，达到改善药效的目的。
发明内容
本发明提供了一种利用微生物重构三七活性成分的方法。
该方法的操作步骤如下：
（1） 菌株为长枝木霉Trichoderma longibrachiatum Rifai，于2012年3月5日鉴定并保存于云南大学中草药生物资源研究所云百草实验室；
（2） 菌种制备：将长枝木霉接种到PPDA斜面培养基，于23℃恒温培养4d；
（3）三七培养基：精确称取1 g过60目筛的三七粉于100 mL三角瓶，加入0.2 mL无机盐：10 %KH2PO4和5 %MgSO4，20 mL水，自然pH，121℃灭菌30-90 min；
（4） 液体发酵培养：将步骤（2）中制备好的菌种接入步骤（3）三七培养基中，于10-30℃，130 r/min培养60-120 h；
（5） 液体发酵物后处理：将步骤（4）中培养好的液体发酵物抽滤，用10 mL纯水清洗滤渣，合并滤液，4000 r/min离心30 min，取上清液加入等体积水饱和正丁醇超声萃取1 h，静置分层后，收集上层正丁醇相60℃旋蒸至干燥，用5 mL70%甲醇溶解残渣采用行HPLC法检测皂苷含量。
本发明的关键点在于：利用三七根茎上分离得到的长枝木霉直接发酵三七药材，使活性成分（皂苷）的种类和含量发生变化，改善和提高了三七药效。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不是对本发明的限制。
实施例1：不同培养基灭菌时间对发酵后皂苷种类和含量的影响
（1） 菌种制备：将长枝木霉接种到PPDA斜面培养基，于23℃恒温培养4d；
（2）三七培养基：精确称取1 g过60目筛的三七粉于100 mL三角瓶，加入0.2 mL无机盐：10 %KH2PO4和5 %MgSO4，20 mL水，自然pH，121℃灭菌30、60、90 min；
（3） 液体发酵培养：将步骤（1）中制备好的菌种接入步骤（2）三七培养基中，于20℃，130 r/min培养96 h；
（4） 液体发酵物后处理：将步骤（3）中培养好的液体发酵物抽滤，用10 mL纯水清洗滤渣，合并滤液，4000 r/min离心30 min，取上清液加入等体积水饱和正丁醇超声萃取1 h，静置分层后，收集上层正丁醇相60℃旋蒸至干燥，用5 mL70%甲醇溶解残渣，采用HPLC法检测皂苷含量。其结果见表1。
表1 三七培养基121℃灭菌不同时间发酵对皂苷含量的影响
实施例2：不同培养温度对发酵后皂苷种类和含量的影响
（1） 菌种制备：将长枝木霉接种到PPDA斜面培养基，于23℃恒温培养4d；
（2）三七培养基：精确称取1 g过60目筛的三七粉于100 mL三角瓶，加入0.2 mL无机盐：10 %KH2PO4和5 %MgSO4，20 mL水，自然pH，121℃灭菌30 min；
（3） 液体发酵培养：将步骤（1）中制备好的菌种接入步骤（2）三七培养基中，分别于10、20、30℃，130 r/min培养96 h；
（4） 液体发酵物后处理：将步骤（3）中培养好的液体发酵物抽滤，用10 mL纯水清洗滤渣，合并滤液，4000 r/min离心30 min，取上清液加入等体积水饱和正丁醇超声萃取1 h，静置分层后，收集上层正丁醇相60℃旋蒸至干燥，用5 mL70%甲醇溶解残渣，采用HPLC法检测皂苷含量。其结果见表2。
表2 不同培养温度对发酵后皂苷种类和含量的影响
实施例3：不同培养时间对发酵后皂苷种类和含量的影响
（1） 菌种制备：将长枝木霉接种到PPDA斜面培养基，于23℃恒温培养4d；
（2）三七培养基：精确称取1 g过60目筛的三七粉于100 mL三角瓶，加入0.2 mL无机盐：10 %KH2PO4和5 %MgSO4，20 mL水，自然pH，121℃灭菌30 min；
（3） 液体发酵培养：将步骤（1）中制备好的菌种接入步骤（2）三七培养基中，分别于20 ℃，130 r/min培养60、96、120 h；
（4） 液体发酵物后处理：将步骤（3）中培养好的液体发酵物抽滤，用10 mL纯水清洗滤渣，合并滤液，4000 r/min离心30 min，取上清液加入等体积水饱和正丁醇超声萃取1 h，静置分层后，收集上层正丁醇相60℃旋蒸至干燥，用5 mL70%甲醇溶解残渣，采用HPLC法检测皂苷含量。其结果见表3。
表3 不同培养时间对发酵后皂苷种类和含量的影响
Claims (1)
1.一种木霉发酵改变三七中单体皂苷含量和组成的方法，其特征在于该方法包括：
（1） 生产菌株为长枝木霉Trichoderma longibrachiatum Rifai；
（2） 菌种制备：将长枝木霉接种到PPDA斜面培养基，于23℃恒温培养4d；
（3）三七培养基：精确称取1 g过60目筛的三七粉于100 mL三角瓶，加入0.2 mL无机盐：10 %KH2PO4和5 %MgSO4，20 mL水，自然pH，121℃灭菌30-90 min；
（4） 液体发酵培养：将制备好的菌种接入三七培养基中，于10-30 ℃，130 r/min培养60-120 h；
（5） 液体发酵物后处理：将液体发酵物抽滤，用10 mL纯水清洗滤渣，合并滤液，4000 r/min离心30 min，取上清液加入等体积水饱和正丁醇超声萃取1 h，静置分层后，收集上层正丁醇相60℃旋蒸至干燥，用5 mL70%甲醇溶解残渣，采用HPLC法检测皂苷含量。
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| CN1477205A (zh) * | 2003-07-10 | 2004-02-25 | 黄亚平 | 生物催化剂转化人参皂甙生产稀有人参皂甙的方法 |
| CN101139562A (zh) * | 2007-07-02 | 2008-03-12 | 昆明诺唯金参生物工程有限责任公司 | 一种链霉菌发酵三七皂苷制备稀有人参皂苷Compound K的工艺 |
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Non-Patent Citations (1)
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| 王艳等: "三七中高产人参皂苷Rd真菌的鉴定", 《食品与发酵工业》 * |
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