WO2017069565A1 - 효소적 방법에 의하여 인삼의 사포닌으로부터 진세노사이드 rd를 선택적으로 제조하는 방법 - Google Patents

효소적 방법에 의하여 인삼의 사포닌으로부터 진세노사이드 rd를 선택적으로 제조하는 방법 Download PDF

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    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase

Definitions

  • the present invention relates to a method for selectively preparing ginsenoside Rd, which is present in trace amounts in ginseng, from ginseng saponins, which are present in large amounts in ginseng, and more specifically, panaxadiol-based saponins obtained from ginseng.
  • the present invention relates to a method in which ginsenoside Rb1 is treated with a specific enzyme to structurally convert the saponin to obtain a desired target compound, ie, ginsenoside Rd, in high yield.
  • Ginseng saponins have a unique chemical structure that is different from those found in other plants, and because of their unique pharmacological effects, they are also called "ginsenoside", meaning ginseng glycosides.
  • Specific types of ginseng saponins include ginsenosides Rb1, Rb2, Rc, Rd, compound K, compound Mc, compound O, and the like, and ginsenosides Re, Rf, Rg1, Rg3, and Rg5, which are panaxanadiols. , Rh1, Rh2 and the like, and these ginseng saponins each show different efficacy.
  • ginsenosides Rb1, Rb2, Rc, etc. which are panaxadiol-based saponins, may be converted to other ginseng saponins by microbial metabolism, thereby converting them from ginseng saponins to other kinds of ginseng saponins.
  • a method using an enzyme has been used before.
  • the conversion of the enzyme using a conventional enzyme has to use a very large amount of enzyme compared to the saponin substrate used because of the nonspecificity of the enzyme to the substrate, and the enzyme reaction does not end at the desired ginseng saponin but causes additional reactions to occur nonspecifically. Therefore, not only the desired ginseng saponin is converted, but other ginseng saponins are produced in various ways, and the yield for the desired ginseng saponin is very low.
  • the conventional methods for obtaining ginseng saponins are not technical conversion of the desired ginseng saponins, but instead of obtaining a variety of converted ginseng saponins by extraction, and then purified to separate only the desired ginseng saponins as a technical solution.
  • an object of the present invention is to provide a method for converting ginseng saponin, which can be easily obtained while obtaining a desired specific ginseng saponin in high yield.
  • the present invention is a method for producing ginsenoside Rd by converting saponins of ginseng using at least one enzyme selected from the group consisting of pectinase and cellulase separated in Trichoderma To provide.
  • the desired ginseng saponin can be easily obtained in high yield.
  • Figure 1 shows the result of confirming the ginsenoside Rd produced after the conversion reaction to ginseng saponin by silica gel column chromatography.
  • the present invention relates to a method for selectively preparing ginsenoside Rd (Formula 1) from ginsenoside Rb1, which is a saponin of ginseng, in particular a panaxadiol-based saponin, by an enzymatic method.
  • ginsenoside Rd can be obtained in high yield by efficiently converting ginseng saponins into desired ginseng saponins.
  • the enzymes used in the present invention are preferably microorganisms of the genus Trichoderma , in particular Trichoderma aggressivum , Trichoderma harzianum harzianum ), Trichoderma reesei and trichoderma viride are obtained from one or more microorganisms selected from the group consisting of, and most preferably from Trichoderma reesei .
  • the enzyme used in the present invention may be lactase, cellulase, beta-galactosidase, pectinase, naringinase, hemicellulase, or mixtures thereof isolated from microorganisms of the genus Trichoderma, Preferably pectinase, cellulase, or mixtures thereof.
  • the specificity of the substrate is different depending on the species of the microorganism from which the enzyme is derived. Therefore, in the present invention, it is preferable to use one or more selected from the group consisting of pectinase and cellulase, most preferably obtained from Trichoderma ressay.
  • the saponin is converted to the desired ginseng saponin by the enzymatic method using the enzyme.
  • a solvent which does not lower the activity of the enzyme.
  • an aqueous solvent such as water or a buffer solution, or a mixture of an aqueous solvent and an organic solvent such as water or a buffer solution can be used. have.
  • the buffer used at this time may be acetic acid, citrate, phosphoric acid or citrate-phosphate, and the like, and the organic solvent is acetonitrile, dioxane, dimethyl sulfoxide, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, or the like.
  • the solvent used has a pH range of 2.5 to 7.5, preferably 3.5 to 5.5.
  • the enzyme used is preferably added in an amount of 1 to 500% by weight, more preferably 10 to 400% by weight, even more preferably 10 to 200% by weight, based on the amount of the substrate used. Is added in an amount of%.
  • the reaction temperature should be a temperature condition at which the enzyme inactivation does not occur, preferably it is maintained at a temperature in the range of 30 ⁇ 60 °C, more preferably 35 ⁇ 60 °C, even more preferably 40 ⁇ 55 °C .
  • reaction time is not particularly limited as long as the activity of the enzyme is maintained, but it is 1 to 120 hours, preferably 1 to 72 hours, more preferably 1 to 48 hours, even more preferably 1 to 24 hours. It is preferred to react while stirring.
  • the reaction solution containing a large amount of ginsenoside Rd can be obtained by inactivating the enzyme.
  • the total 1-butanol layer obtained therefrom was treated with 5% KOH, washed with distilled water, and then concentrated under reduced pressure to obtain 1-butanol extract, which was dissolved in a small amount of methanol and added to a large amount of ethyl acetate.
  • ginseng purified saponin including ginsenosides Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1, Rf and the like
  • Ginsenoside Rb1 2.66g, Ginsenoside Rb2 0.73g, Ginsenoside Rc 1.23g, and 0.38g Ginsenoside Rd existed in 10 g of ginseng purified saponins used. Ginsenoside Rb1 was present at 0.009 g, while ginsenoside Rd was present at 2.952.57 g, and ginsenosides Rb2 and Rc were present at 0.73 g and 1.23 g, respectively.
  • ginsenoside Rd is selectively converted from ginsenoside Rb1, in particular 2.19 g of ginsenoside Rd is generated from ginsenoside Rb1, indicating that the conversion to ginsenoside Rd is 95% or more.
  • ginsenosides Rb2 and Rc were present in the same amount even after the enzyme reaction, and appeared to remain unconverted.

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Abstract

본 발명은 인삼의 파낙사디올계 사포닌으로부터, 원래 인삼 내에 미량으로 존재하는 진세노사이드 Rd를 선택적으로 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인삼으로부터 얻은 파낙사디올계 사포닌에 특정 효소를 처리하여, 상기 사포닌을 구조 전환시킴으로써 원하는 목표 화합물, 즉 진세노사이드 Rd를 고수율로 수득할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

효소적 방법에 의하여 인삼의 사포닌으로부터 진세노사이드 RD를 선택적으로 제조하는 방법
본 발명은 인삼 내에 다량 존재하는 인삼 사포닌인 진세노사이드 Rb1으로부터, 원래 인삼 내에 미량으로 존재하는 진세노사이드 Rd를 선택적으로 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인삼으로부터 얻은 파낙사디올계 사포닌 진세노사이드 Rb1에 특정 효소를 처리하여, 상기 사포닌을 구조 전환시킴으로써 원하는 목표 화합물, 즉 진세노사이드 Rd를 고수율로 수득할 수 있는 방법에 관한 것이다.
인삼 사포닌은 다른 식물에서 발견되는 사포닌과는 다른 특이한 화학구조를 가지고 있으며, 이로 인하여 약리효능도 특이하므로, 인삼(ginseng) 배당체(glycoside)란 의미로 “진세노사이드(ginsenoside)”라고도 불린다. 인삼 사포닌의 구체적인 종류로는 파낙사디올계인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, 컴파운드 K, 컴파운드 Mc, 컴파운드 O 등, 및 파낙사트리올계인 진세노사이드 Re, Rf, Rg1, Rg3, Rg5, Rh1, Rh2 등이 있으며, 이들 인삼 사포닌은 각각 다른 효능을 나타낸다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2016011905-appb-I000001
상기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 특히 파낙사디올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 등은 미생물 대사에 의해 다른 인삼 사포닌으로 전환될 수 있으므로, 인삼 사포닌으로부터 다른 종류의 특정 인삼 사포닌으로 전환시키는 방법으로서 효소를 이용하는 방법이 이전부터 사용되어 왔다.
그러나, 종래 효소를 이용한 전환 반응은 기질에 대한 효소의 비특이성이 커서 사용되는 사포닌 기질 대비 매우 많은 양의 효소를 사용하여야 하였으며, 효소 반응이 원하는 인삼 사포닌에서 종료되는 것이 아니라 추가 반응이 비특이적으로 일어나게 되므로, 원하는 인삼 사포닌으로만 전환되는 것이 아니라 다른 인삼 사포닌들이 다양하게 생성되어 원하는 인삼 사포닌에 대한 수율이 매우 낮았다.
또한, 종래의 인삼 사포닌을 얻는 방법들은 원하는 특정 인삼 사포닌만으로 전환시키는 것이 아닌, 전환된 다양한 인삼 사포닌을 추출 등을 통해 수득한 다음, 이를 정제하여 원하는 인삼 사포닌만을 분리하는 것을 기술적 해결책으로 하고 있다.
그러나, 이와 같은 종래 방법들은 순수한 특정 인삼 사포닌을 획득하기 위해 정제에 따른 추가적인 비용, 시간 등이 소요되기 때문에, 인삼 사포닌의 판매가가 상승할 수 밖에 없고, 그에 따라 관련 제품에 인삼 사포닌을 다량으로 적용하기에는 한계점이 있다.
추가적으로, 효소 반응이 비특이적으로 일어나게 되면, 진세노사이드 Rd에서 당의 비선택적 제거로 진세노사이드 F2, 컴파운드 K로 전환되므로 진세노사이드 Rd 등과 같은 중간 대사물은 고수율로 얻기 어렵게 된다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
1. 국내 공개특허 제10-2014-0006331호(2014년 1월 16일 공개)
종래의 방법으로 특정 인삼 사포닌을 얻기 위해서는 비용이 많이 들 뿐만 아니라, 원하는 인삼 사포닌을 대량으로 입수하기가 어려웠다. 따라서, 목표 인삼 사포닌을 대량 생산할 수 있으면서 비용을 절감할 수 있는 제조 방법에 대한 필요성이 존재하였다.
그러므로, 본 발명은 원하는 특정 인삼 사포닌을 고수율로 획득할 수 있으면서 실시가 용이한 인삼 사포닌 전환 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 트리코데르마 속에서 분리한 펙티나제와 셀룰라제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 효소를 이용하여 인삼의 사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 Rd를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 인삼 사포닌으로의 전환 방법을 이용함으로써 원하는 인삼 사포닌을 고수율로 용이하게 획득할 수 있다.
도 1은 인삼 사포닌으로의 전환 반응 후 생성된 진세노사이드 Rd를 실리카겔 칼럼크로마토그래피에 의해 확인한 결과를 나타낸다.
본 발명은 효소적 방법에 의해 인삼의 사포닌, 특히 파낙사디올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1으로부터 진세노사이드 Rd(화학식 1)를 선택적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
Figure PCTKR2016011905-appb-C000001
본 발명의 방법에서는 미생물 유래의 효소를 사용함으로써, 인삼의 사포닌으로부터 원하는 인삼 사포닌으로의 전환이 효율적으로 일어나게 하여 고수율로 진세노사이드 Rd를 획득할 수 있다.
구체적으로, 본원발명에서 사용되는 효소는 바람직하게는 트리코데르마(Trichoderma) 속의 미생물, 특히 트리코데르마 아그레시붐(Trichoderma aggressivum), 트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) 및 트리코데르마 비리데(richoderma viride)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 미생물로부터 얻은 것이며, 가장 바람직하게는 트리코데르마 레세이로부터 얻은 것이다.
또한, 본 발명에서 사용되는 효소는 트리코데르마 속의 미생물로부터 분리한 락타제, 셀룰라제, 베타-갈락토시다제, 펙티나제, 나린지나제, 헤미셀룰라제, 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 바람직하게는 펙티나제, 셀룰라제, 또는 이들의 혼합물이다.
대부분 동일한 작용을 하는 같은 종류의 효소라 하더라도, 효소가 유래한 미생물의 종에 따라서 구체적으로 효소가 기질 내에서 작용하는 부위가 상이하여 기질 특이성에 차이가 생긴다. 따라서, 본 발명에서는 가장 바람직하게는 트리코데르마 레세이로부터 얻은 펙티나제 및 셀룰라제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 사용하는 것이 좋다.
본 발명에서는 인삼의 사포닌을 용매에 0.01~20중량%의 양으로 용해시킨 후, 상기 효소를 사용하여 효소적 방법에 의해 사포닌을 원하는 인삼 사포닌으로 전환시킨다. 이 때 사용되는 용매로는 효소의 활성을 저하시키지 않는 것을 사용하는 것이 바람직하며, 예를 들어 물 또는 완충용액과 같은 수성용매, 또는 물이나 완충용액과 같은 수성용매와 유기용매의 혼합액을 사용할 수 있다. 구체적으로 이 때 사용되는 완충용액은 아세트산, 시트레이트, 인산 또는 시트레이트-인산 등일 수 있고, 유기용매는 아세토니트릴, 디록산, 디메틸 설폭사이드, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 등이 있다. 바람직하게, 사용되는 용매는 pH 범위가 2.5~7.5, 바람직하게는 3.5~5.5이다.
본 발명의 방법에서, 사용되는 효소는 사용되는 기질의 양에 대하여 1~500중량%의 양으로 첨가됨이 바람직하며, 더 바람직하게는 10~400중량%, 보다 더 바람직하게는 10~200중량%의 양으로 첨가된다.
반응 온도는 효소의 불활성화가 일어나지 않는 온도 조건이어야 하는데, 바람직하게는 30~60℃, 더 바람직하게는 35~60℃, 보다 더 바람직하게는 40~55℃의 범위로 온도를 유지하는 것이 좋다.
또한, 반응 시간 역시 효소의 활성이 유지되는 기간이라면 특별히 제한을 받지 않으나, 1~120시간, 바람직하게는 1~72시간, 더 바람직하게는 1~48시간, 보다 더 바람직하게는 1~24시간 동안 교반하면서 반응시키는 것이 바람직하다.
이후 비등 수욕조에서의 가열과 같은 공지된 방법을 사용하여, 효소를 불활성화시킴으로써 진세노사이드 Rd가 다량 함유된 반응액을 얻을 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세히 설명한다. 다만, 다음 실시예로 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.
[참고예 1] 인삼 정제 사포닌의 제조
홍삼, 백삼, 수삼, 미삼 또는 이들의 인삼엽, 인삼꽃, 인삼열매 2㎏에 에탄올 20ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 후, 15℃에서 6일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후에, 에테르 1ℓ로 5회 추출하여 색소를 제거하고, 수층을 1-부탄올 1ℓ 로 3회 추출하였다. 이로부터 얻은 총 1-부탄올층을 5% KOH로 처리한 다음 증류수로 세척한 뒤, 감압농축하여 1-부탄올 엑기스를 얻고, 이를 소량의 메탄올에 녹인 다음, 대량의 에틸아세테이트에 추가하여, 생성된 침전물을 건조함으로써, 인삼 정제 사포닌(진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1, Rf 등을 포함함) 40∼80g을 얻었다.
[실시예 1] 효소반응 통한 진세노사이드 Rd의 제조
상기 참고예 1의 인삼 정제 사포닌(진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1, Rf 등을 포함함) 10g을 물 1ℓ에 넣고 용해하였다.
그런 다음 상기 혼합액에 트리코데르마 레세이에서 분리한 펙티나제를 기질대비 200중량% 첨가한 후 30℃에서 48시간을 반응시켰다. 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 비등 수욕조에서 10분간 가열하여 효소를 불활성시켜 반응을 종료시켰다. 마지막으로 반응액에 에틸아세테이트나 에탄올을 1:1의 비율(반응액에 대한 부피비)로 넣고 3회 추출한 후 농축한 다음 실리카겔 칼럼크로마토그래피(클로로포름:메탄올=9:1)에 의해 진세노사이드 Rd를 분리하였다(도 1).
사용한 인삼 정제 사포닌 10g에는 진세노사이드 Rb1 2.66g, 진세노사이드 Rb2 0.73g, 진세노사이드 Rc 1.23g, 진세노사이드 Rd 0.38g이 존재하였다. 효소 반응 이후 수득한 혼합액에는 진세노사이드 Rb1이 0.009g 존재한 반면, 진세노사이드 Rd는 2.952.57g이 존재하였으며, 진세노사이드 Rb2 및 Rc는 각각 0.73g 및 1.23g 존재하였다. 이는 진세노사이드 Rd가 진세노사이드 Rb1으로부터 선택적으로 전환되었음을 의미하며, 특히 진세노사이드 Rb1으로부터 진세노사이드 Rd 2.19g이 생성되어 진세노사이드 Rd로의 전환율이 95% 이상임을 나타낸다. 한편, 진세노사이드 Rb2와 Rc는 효소 반응 이후에도 동일한 양으로 존재하여, 전환이 이루어지지 않은 상태로 남아 있는 것으로 나타났다.

Claims (8)

  1. 트리코데르마 속에서 분리한 펙티나제 및 셀룰라제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 이용하여 인삼의 파낙시디올계 사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 Rd(화학식 1)를 제조하는 방법.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2016011905-appb-I000002
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은
    1) 기질인 인삼의 파낙사디올계 사포닌을 수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합액 중에 용해시켜 효소로서 트리코데르마 속에서 분리한 펙티나제 및 셀룰라제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 첨가하여 가온 상태의 수욕조상에서 교반하면서 반응시키는 단계;
    2) 상기 기질이 완전히 소실되면 효소를 불활성화시켜 반응을 종료시키는 단계;
    3) 반응액에 에틸아세테이트 또는 에탄올을 첨가하여 추출한 후 농축시켜 진세노사이드 Rd를 분리하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 인삼의 파낙사디올계 사포닌은 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 1종 이상임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 트리코데르마 속의 미생물은 트리코데르마 아그레시붐(Trichoderma aggressivum), 트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) 및 트리코데르마 비리데(richoderma viride)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 효소는 기질의 양에 대하여 10~400중량%의 양으로 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 효소는 35~60℃의 온도에서 반응하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기 효소는 1~48시간 동안 반응하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제2항에 있어서, 상기 용매는 pH가 3~5.5의 범위임을 특징으로 하는 방법.
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