JP6854815B2

JP6854815B2 - 酵素的方法によって人参のサポニンからジンセノサイドＲｄを選択的に製造する方法

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Publication number: JP6854815B2
Application number: JP2018520414A
Authority: JP
Inventors: ギベクナム; ドンヒュンキム; ヨンドクホン; ジュンソンパク
Original assignee: Amorepacific Corp
Current assignee: Amorepacific Corp
Priority date: 2015-10-22
Filing date: 2016-10-21
Publication date: 2021-04-07
Anticipated expiration: 2036-10-21
Also published as: EP3351639A1; KR20170047008A; JP2018531029A; US20180320212A1; EP3351639A4; US10519480B2; TWI737638B; CN108138210B; TW201718866A; CN108138210A; WO2017069565A1; EP3351639B1

Description

本発明は人参内に多量存在する人参サポニンであるジンセノサイドＲｂ１から、本来人参内に微量に存在するジンセノサイドＲｄを選択的に製造する方法に関し、さらに詳細には、人参から得られるパナキサジオール系のサポニンであるジンセノサイドＲｂ１に特定の酵素を処理して、上記サポニンを構造転換させることによって所望する目標化合物、すなわちジンセノサイドＲｄを高収率に収得することのできる方法に関する。

人参サポニンは他の植物から発見されるサポニンとは異なる特異な化学構造を有しており、これによって薬理効能も特異なため、人参（ｇｉｎｓｅｎｇ）配糖体（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）という意味で“ジンセノサイド（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）”とも呼ばれる。人参サポニンの具体的な種類としては、パナキサジオール系であるジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ、コンパウンドＫ、コンパウンドＭｃ、コンパウンドＯなど、およびパナキサトリオール系であるジンセノサイドＲｅ、Ｒｆ、Ｒｇ１、Ｒｇ３、Ｒｇ５、Ｒｈ１、Ｒｈ２などがあって、これら人参サポニンはそれぞれ異なる効能を表す。

［反応式１］

上記の反応式１に示すように、特にパナキサジオール系サポニンであるジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃなどは微生物代謝によって他の人参サポニンに転換され得るため、人参サポニンから他の種類の特定の人参サポニンに転換させる方法として酵素を用いる方法が以前から使用されている。

しかしながら、従来の酵素を用いる転換反応は、基質に対する酵素の非特異性が大きいため用いられるサポニン基質対比極めて多い量の酵素を使用せざるを得ず、酵素反応が所望する人参サポニンで終了されるのではなく、追加反応が非特異的に行われるため、所望する人参サポニンにのみ転換されずに他の人参サポニンが多様に生成されて所望する人参サポニンの収率が極めて低かった。

また、人参サポニンを収得する従来の方法は、所望する特定の人参サポニンだけに転換させるのではなく、転換された多様な人参サポニンを抽出などを通じて収得した後、これを精製して、所望する人参サポニンのみを分離することを技術的解決策としている。

ところが、このような従来方法は、純粋な特定の人参サポニンを収得するために精製による追加的な費用、時間などが所要されるため、人参サポニンの販売価が上昇せざるを得ず、これによって関連製品に人参サポニンを多量に適用するには限界がある。

さらに、酵素反応が非特異的に行われると、ジンセノサイドＲｄにおいて糖の非選択的除去によりジンセノサイドＦ２、コンパウンドＫに転換されるため、ジンセノサイドＲｄなどのような中間代謝物を高収率に得ることは難しくなる。

大韓民国公開特許第１０−２０１４−０００６３３１号（２０１４年１月１６日公開）

従来の方法により特定の人参サポニンを収得するためには、費用が多くかかるのみならず、所望する人参サポニンを大量に入手することが困難であった。したがって、目標人参サポニンを大量に生産することができ、かつ費用を節減することのできる製造方法を開発する必要性が存在した。

それゆえ、本発明は、所望する特定の人参サポニンを高収率に収得することができ、かつ実施が容易な人参サポニンの転換方法を提供することを目的とする。

上記の目的を達成するため、本発明は、トリコデルマ属から分離したペクチナーゼとセルラーゼからなる群より選択される一種以上の酵素を用いて、人参のサポニンを転換させることによって、ジンセノサイドＲｄを製造する方法を提供する。

本発明による人参サポニンへの転換方法を用いることによって、所望する人参サポニンを高収率で容易に収得することができる。

図１は、人参サポニンへの転換反応後に生成されるジンセノサイドＲｄをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって確認した結果を示す。

本発明は、酵素的方法によって人参サポニン、特にパナキサジオール系サポニンであるジンセノサイドＲｂ１から下記の化学式１で示すジンセノサイドＲｄを選択的に製造する方法に関する。

［化学式１］

本発明の方法によると、微生物由来の酵素を用いることによって、人参のサポニンから所望する人参サポニンへの転換が効率的に行われるようにして、高収率にジンセノサイドＲｄを収得することができる。

具体的には、本発明において用いられる酵素は、好ましくはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物、特にトリコデルマアグレシバム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｇｇｒｅｓｓｉｖｕｍ）、トリコデルマハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマリーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）およびトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ）からなる群より選択される一種以上の微生物から得られるものであって、最も好ましくはトリコデルマリーゼイから得られるものである。

さらに、本発明において用いられる酵素は、トリコデルマ属の微生物から分離したラクターゼ、セルラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ペクチナーゼ、ナリンギナーゼ、ヘミセルラーゼ、またはこれらの混合物であることができ、好ましくはペクチナーゼ、セルラーゼ、またはこれらの混合物である。

大部分が同一な作用を行う同じ種類の酵素であっても、酵素が由来した微生物の種によって、具体的に酵素が基質内で作用する部位が相違して基質特異性に差が生じる。したがって、本発明においては、最も好ましくはトリコデルマリーゼイから得られるペクチナーゼおよびセルラーゼからなる群より選択される一種以上を用いることである。

本発明においては、人参のサポニンを溶媒に０．０１〜２０重量％の量で溶解させた後、上記酵素を用いて酵素的方法によって、サポニンを所望する人参サポニンに転換させる。このとき用いられる溶媒としては、酵素の活性を阻止しないものを使用することが好ましく、例えば水または緩衝溶液のような水性溶媒、あるいは水または緩衝溶液のような水性溶媒と有機溶媒との混合液を使用することができる。具体的にこのとき用いられる緩衝溶液としては酢酸、クエン酸、リン酸またはクエン酸−リン酸などであり、有機溶媒としてはアセトニトリル、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどである。好ましくは、用いられる溶媒としてはｐＨ範囲が２．５〜７．５、より好ましくは３．５〜５．５である。

本発明の方法において、用いられる酵素は、使用する基質の量に対し、１〜５００重量％の量で添加されるのが好ましく、より好ましくは１０〜４００重量％、さらに好ましくは１０〜２００重量％の量で添加される。

反応温度は、酵素の不活性化が行われない温度条件でなければならないが、好ましくは３０〜６０℃、より好ましくは３５〜６０℃、さらに好ましくは４０〜５５℃の範囲で温度を維持することである。

さらに、反応時間も酵素の活性が維持される期間であれば特に制限を受けないが、１〜１２０時間、好ましくは１〜７２時間、より好ましくは１〜４８時間、さらに好ましくは１〜２４時間撹拌しながら反応させることである。

以降、沸騰水浴槽における加熱のような公知の方法を用いて、酵素を不活性化することによってジンセノサイドＲｄを多量含有した反応液を得ることができる。

以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。但し、次の実施例で本発明の範疇が限定されるものではない。

［参考例１］人参精製サポニンの製造
紅参、白参、水参、尾参あるいはこれらの人参の葉、人参の花、人参の実２ｋｇにエタノール２０リットル（Ｌ）を入れ、３回還流抽出した後、１５℃で６日間沈積させた。その後、ろ過布ろ過と遠心分離を通じて残渣とろ液を分離し、分離されたろ液を減圧濃縮して得られたエキスを水に懸濁した後に、エーテル１Ｌで５回抽出して色素を除去し、水層を１−ブタノール１Ｌで３回抽出した。これから得られた総１−ブタノール層を５％ＫＯＨで処理した後に蒸留水で洗浄し、減圧濃縮して１−ブタノールエキスを収得し、これを少量のメタノールに溶かした後、大量の酢酸エチルに加えて、生成された沈殿物を乾燥させることによって、人参精製サポニン（ジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｇ１、Ｒｆなどを含む）４０〜８０ｇを収得した。

［実施例１］酵素反応を通じたジンセノサイドＲｄの製造
上記参考例１の人参精製サポニン（ジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｇ１、Ｒｆなどを含む）１０ｇを水１Ｌに入れて溶解した。
その後、上記混合液にトリコデルマリーゼイから分離したペクチナーゼを基質対比２００重量％添加した後、３０℃で４８時間反応させた。薄層クロマトグラフィーによって周期的に確認して基質が完全に消失されると、沸騰水浴槽で１０分間加熱して酵素を不活性化させて、反応を終了させた。最後に反応液に酢酸エチルあるいはエタノールを１：１の比率（反応液に対する体積比）で入れて３回抽出した後に濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）によって図１に示すようにジンセノサイドＲｄを分離した。

使用した参考例１の人参精製サポニン１０ｇには２．６６ｇのジンセノサイドＲｂ１、０．７３ｇのジンセノサイドＲｂ２、１．２３ｇのジンセノサイドＲｃおよび０．３８ｇのジンセノサイドＲｄが存在した。酵素反応以降の収得した混合液には、ジンセノサイドＲｂ１が０．００９ｇ存在した反面、ジンセノサイドＲｄは２．５７ｇが存在し、ジンセノサイドＲｂ２およびＲｃはそれぞれ０．７３ｇおよび１．２３ｇが存在した。これはジンセノサイドＲｄがジンセノサイドＲｂ１から選択的に転換されたことを意味し、特にジンセノサイドＲｂ１から２．１９ｇのジンセノサイドＲｄが生成されて、ジンセノサイドＲｄへの転換率が９５％以上であることを示す。一方、ジンセノサイドＲｂ２とＲｃは、酵素反応以降にも同一な量で存在し、転換が行われない状態で残っていることを示す。

Claims

トリコデルマ属の微生物から分離したペクチナーゼを用いて、人参のパナキサジオール系のサポニンを転換させることによって、下記の化学式１で示すジンセノサイドＲｄを選択的に製造する方法。
［化学式１］
前記の方法は、以下の段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法：
（１）基質である人参のパナキサジオール系のサポニンを水性溶媒または水性溶媒と有機溶媒との混合液中に溶解させ、酵素としてトリコデルマ属の微生物から分離したペクチナーゼを添加して、加温状態の水浴槽上で撹拌しながら反応させる段階；
（２）前記の基質が完全消失したら、酵素を不活性化させて反応を終了させる段階；および
（３）反応液に酢酸エチルまたはエタノールを添加して抽出した後に濃縮させて、ジンセノサイドＲｄを分離する段階。
前記の基質である人参のパナキサジオール系のサポニンは、ジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃまたはこれらの混合物中から選択される一種以上であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
前記のトリコデルマ属の微生物は、トリコデルマアグレシバム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｇｇｒｅｓｓｉｖｕｍ）、トリコデルマハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマリーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）およびトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ）からなる群より選択される一種以上であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
前記の酵素は、基質の量に対して１０〜４００重量％の量で用いられることを特徴とする請求項２に記載の方法。
前記（１）の酵素の反応は、３０〜６０℃の温度で行われることを特徴とする請求項２に記載の方法。
前記（１）の酵素の反応は、１〜４８時間行われることを特徴とする請求項２に記載の方法。
前記の水性溶媒または水性溶媒と有機溶媒との混合液はｐＨが３．５〜５．５の範囲であることを特徴とする請求項２に記載の方法。