KR20170027367A

KR20170027367A - 효소 및 유기산 처리를 통한 진세노사이드 Rh2, Rk2 및 Rh3 제조방법

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Publication number: KR20170027367A
Application number: KR1020150123741A
Authority: KR
Inventors: 임완택; 최강덕; 송봉규; 김경민; 채유리; 윤다슬
Original assignee: 셀루스원 주식회사; 한경대학교 산학협력단
Priority date: 2015-09-01
Filing date: 2015-09-01
Publication date: 2017-03-10
Also published as: KR101776005B1

Abstract

본 발명은 효소 및 유기산 처리를 통한 진세노사이드 Rh2, Rk2 및 Rh3 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 효소 및 유기산 처리 방법을 사용하여 인삼 조사포닌으로부터 마이너 진세노사이드(희귀 진세노사이드)인 진세노사이드 Rh2, Rk2 및 Rh3를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 인삼 또는 인삼의 가공품에 극미량으로 존재하는 마이너 형태(minor form)의 희귀 진세노사이드인 Rh2, Rk2 및 Rh3를 안전하고 효율적으로 제조할 수 있다. 특히 본 발명의 방법은 공정이 매우 간단하며 제조 효율이 매우 뛰어나 산업적인 용도로의 대량생산이 가능하다는 장점이 있다.

Description

효소 및 유기산 처리를 통한 진세노사이드 Rh2, Rk2 및 Rh3 제조방법{Production of ginsenoside Rh2, Rk2 and Rh3 through combinative usage of enzymes and organic acids}

본 발명은 효소 및 유기산 처리를 통한 진세노사이드 Rh2, Rk2 및 Rh3 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 효소 및 유기산 처리 방법을 사용하여 인삼 조사포닌으로부터 마이너 진세노사이드(희귀 진세노사이드)인 진세노사이드 Rh2, Rk2 및 Rh3를 제조하는 방법에 관한 것이다.

사포닌은 식물계에 널리 존재하는 배당체에서 당이 아닌 부분이 여러 고리 화합물로 이루어진 물질을 의미한다. 인삼 또는 홍삼에 주요 생리활성 성분으로 포함된 사포닌 성분인, 트리테르펜사포닌(triterpene saponin)은 타 식물에서 발견되는 사포닌과는 화학 구조가 상이하므로 이러한 인삼 사포닌을 타 식물계 사포닌과 구별하기 위해서 인삼(Ginseng) 배당체(Glycoside)란 의미로 진세노사이드(Ginsenoside)라고 부른다.

진세노사이드는 아글리콘(aglycone)의 구조에 따라 프로토파낙사이다이올계(Protopanaxadiol-type, PPD 타입) 진세노사이드, 프로토파낙사트라이올계(Protopanaxatriol-type, PPT 타입) 진세노사이드 및 올레아놀린산계(oleanolic acid 타입) 진세노사이드의 세 가지로 분류될 수 있다. 이러한 세 그룹은 다시, 화합물 구조 중 고리의 3번 탄소, 6번 탄소 및 20번 탄소 위치에 글리코시딕 결합(glycosicid bond)에 의해 부착되는 당 부위(sugar moieties)의 위치 및 수에 따라 분류된다. 올레아놀린산계 진세노사이드의 기본골격은 5환상이고, 여기에는 유일하게 진세노사이드 Ro가 있고, 그 아글리콘은 올레아놀릭산(oleanolic acid)이다. 현재, 180여종 이상의 진세노사이드들이 분리되었고, 이들 대부분은 PPD 타입의 진세노사이드이다. PPD 타입의 진세노사이드에는 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, 지페노사이드 XVII(Gypenoside XVII), 화합물 O(Compound O), 화합물 Mc1(Compound Mc1), F2, 화합물 Y(Compound Y), 화합물 Mc(Compound Mc), Rg3, Rh2, C-K가 포함된다. PPT 타입의 진세노사이드에는 Re, Rg1, Rf, Rg2, Rh1 등이 포함된다.

또한, 건삼에서의 진세노사이드의 90% 이상을 차지하는 것은 메이저 진세노사이드이나 이는 1,000 달톤 부근의 큰 사이즈로 인하여 생체 내에서의 흡수율이 매우 낮다. 따라서 진세노사이드의 약효를 증대시키기 위해서 메이저 진세노사이드를 상대적으로 흡수도 잘 되며 약효도 더 뛰어난 마이너 진세노사이드로 전환시키는 과정이 필요하다. 즉, 메이저 진세노사이드는 인 비보(in vivo)에서 효과적으로 생리적 활성을 나타내기 위하여 당을 구성하는 글루코스, 아라비노스, 람노스, 자일로스 등을 제거(deglycosylated)하는 전환과정이 요구된다. 메이저 진세노사이드에는 Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc 및 Rd 등이 포함되며, 미량으로 존재하는 마이너 진세노사이드(희귀 진세노사이드)에는 F2, Rg3, Rk1, Rg5, Rh1, Rh2, Rk2, Rh3, 지페노사이드(gypenoside, Gyp) XVII, 지페노사이드 LXXV 및 화합물 K, C-K, Mc, Mc1(compound K, C-K, Mc, Mc1)등이 포함된다.

마이너 진세노사이드 중 Rh2(S), Rh2(R), Rk2, Rh3 등은 인삼에서는 극히 적은 양으로 존재하며, 홍삼화하는 과정 중에 극미량 함유되어 있는 진세노사이드로서, 뇌세포 보호 효과(대한민국 등록특허 제10-0759772호 및 제10-0688425호), 항암관련 효과(Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 2006, 98, pp411-415), 만성 피부염 억제 효과(Archives of Pharmacal Research vol.29 no.8 2006. pp685-690), 항염증 효과(J. Agric. Food Chem., 2015, 63 (13), pp3472??3480) 등이 알려져 있으며 마이너 진세노사이드 중에서도 그 약리작용의 귀추가 주목되는 물질이다. 이와 같이 상기 Rh2, Rk2 및 Rh3와 같은 마이너 진세노사이드는 여러 가지 유용한 용도로 사용될 수 있는 물질이지만, 인삼에 미량 존재하므로 이를 대량생산하기 위한 기술의 개발이 필요한 실정이다.

미량으로 존재하는 마이너 진세노사이드를 생산하기 위한 방법으로 화학적 분해 방법, 효소적 방법 및 배당체 합성을 이용한 방법 등이 제시되어 왔으나, 상기와 같은 방법들은 1) 제조 공정상 여러 단계를 거쳐야 하거나, 2) 제조과정에서 목적하는 성분이 소실되며, 3) 식용에 부적합한 촉매를 사용하거나, 4) 낮은 수율을 나타내어 여전히 대량생산에 한계가 있었다.

특히 효소적 방법 중, 사용될 수 있는 효소의 종류로 β-글루코시다제(β-glucosidase), α-L-아라비노피라노시다제(α-L-arabinopyranosidase), α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase),α-L-람노시다제(α-L-rhamnosidase)가 있으며, 이와 같은 효소를 이용한 메이저 진세노사이드의 생전환(biotransformation)에 대해 많은 연구가 있었다. 그러나 이들 역시 대량 생산 방법으로서는 효과적이지 못하고, 많은 비용이 발생하는 문제가 있다.

뿐만 아니라, β-글루코시다제(β-glucosidase), α-L-아라비노피라노시다제(α-L-arabinopyranosidase), α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase),α-L-람노시다제(α-L-rhamnosidase)에 속한다고 해도 모두 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드로 전환시킬 수 있는 활성을 가지는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명자들은 아스로박터 클로로페노리쿠스(Arthrobacter chlorophenolicus) A6에서 유래한 것으로 알려진 베타 글루코시다제에는 진세노사이드의 생전환 활성이 없음을 확인한 바 있다. 또한, 기존의 알려진 효소들, 예컨대, Rb1으로의 전환능력이 있다고 알려진 효소인 베타-글리코시다제 A는 진세노사이드의 생전환 활성이 있다 하여도 그 활성이 미미하였다. 즉, 상기 효소들은 그 유래 등에 따라 기질 및 최종 산물에 차이가 있다.

그래서 대한민국 등록특허 제10-0329259호는 사포닌 알파-글루코시다제로 PPD 타입 진세노사이드의 사포닌 당기를 분해하여 진세노사이드 F2를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 발명의 사포닌 알파-글루코시다제는 진세노사이드 Rd를 진세노사이드 F2로 전환시키고, 진세노사이드 F2를 진세노사이드 C-K로 전환시킨다. 또한, 진세노사이드 Rb1과 Rc로부터 C-K를 제조할 수도 있다. 그러나 상기 특허의 실시예 3에 기재된 바에 따르면 상기 사포닌 알파-글루코시다제는 맥부와 인삼분말이 포함되어 있는 배지에 국균을 넣어서 배양하고 균체를 제거하여 생산해야하는 단점이 있다. 따라서 낮은 수율을 나타내어 대량생산방법으로 효과적이지 못하며 제조원가가 많이 들며, 제조과정 중 목적하는 성분이 소실될 수 있다는 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 인삼 등의 식물체에 미량으로 존재하는 마이너 형태(minor form)의 희귀 진세노사이드들 혼합물 Rh2 mix [20S-Rh2(S), 20S-Rh2(R), Rk2, Rh3]를 용이하게 고수율로 다량 수득하기 위한 방법을 개발하기 위하여 노력한 결과, 잘 추출된 인삼의 조사포닌에 글라이코사이드 하이드로라제(glycoside hydrolase) 활성이 있는 노보자임(Novozyme) 사의 비스코자임(viscozyme)을 처리하여 선택적으로 PPD type의 진세노사이드들(Rb1, Rb2, Rc, Rd 등)을 대부분 진세노사이드 F2로 전환시킨 후, 여기에 유기산을 일정한 농도로 넣고 고온에서 처리하면 희귀 진세노사이드 Rh2(S), Rh2(R)와 Rk2, Rk3를 대량 획득할 수 있는 것을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-0759772호 대한민국 등록특허 제10-0329259호 대한민국 등록특허 제10-0688425호

Zhenhua Wang, Qiusheng Zheng, Ke Liu, Gang Li and Rongliang Zheng, Ginsenoside Rh2 Enhances Antitumour Activity and Decreases Genotoxic Effect of Cyclophosphamide. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 2006, 98, pp411-415. Yong-Wook Shin, Eun-Ah Bae, Dong-Hyun Kim, Inhibitory effect of ginsenoside Rg5 and its metabolite ginsenoside Rh3 in an oxazolone-induced mouse chronic dermatitis model. Archives of Pharmacal Research vol.29 no.8 2006. pp685-690. Yu Young Lee, Jin-Sun Park, Eun-Jung Lee, Sang-Yun Lee, Dong-Hyun Kim, Jihee Lee Kang, and Hee-Sun Kim, Anti-inflammatory Mechanism of Ginseng Saponin Metabolite Rh3 in Lipopolysaccharide-Stimulated Microglia: Critical Role of 5′-Adenosine Monophosphate-Activated Protein Kinase Signaling Pathway, J. Agric. Food Chem., 2015, 63 (13), pp3472-3480.

따라서 본 발명의 주된 목적은 인삼 또는 인삼의 가공품에 극미량으로 존재하는 마이너 형태(minor form)의 희귀 진세노사이드들, 특히 진세노사이드 Rh2, Rk2 및 Rh3를 안전하고 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 a) 인삼 조사포닌을 비스코자임(viscozyme)과 반응시키는 단계; 및 b) 상기 a)단계에서 수득한 반응생성물에 유기산을 첨가하고 가열하는 단계;를 포함하는 진세노사이드 Rh2, Rk2 및 Rh3로 이루어진 군에서 선택된 진세노사이드 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 a)단계는 인삼 조사포닌을 비스코자임으로 처리함으로써 진세노사이드 F2를 수득하는 단계라고 할 수 있다. 본 발명에 따르면 인삼 조사포닌에 함유된 PPD type의 진세노사이드들(Rb1, Rb2, Rc, Rd)이 비스코자임의 처리로 인해 진세노사이드 F2로 전환된다. 이때 비스코자임 반응은 pH 4.5 내지 5.5 및 45 내지 50℃에서 이루어지는 것이 진세노사이드 F2로 전환 효율을 높이기 위해 바람직하다.

인삼 조사포닌(crude saponin)은 성분별로 나뉘기 전의 미정제 상태의 사포닌을 말하는 것으로 일반적으로 인삼시료를 에탄올 등의 용매로 추출하여 HP-20 또는 AB-8수지같은 다공성 수지를 이용하여 흡착 후 다시금 에탄올 농도를 조절하며 탈착시켜 얻을 수 있다. 본 발명에서는 이러한 인삼 조사포닌 중에서 Rb1, Rb2, Rc 또는 Rd가 함유되어 있는 조사포닌이라면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 이러한 조사포닌은 고려인삼, 화기삼, 죽절삼을 포함한 여타인삼의 잎 및 뿌리로부터 주정을 사용하여 추출하는 방법으로 얻을 수 있고, 보다 바람직하게는 HP-20 수지를 이용하여 당 및 protopanaxatriol 계열의 진세노사이드 등을 제거하여 Rb1, Rb2, Rc 또는 Rd의 함량을 높인 조사포닌을 사용하는 것이 좋다.

비스코자임은 상용효소로서 아스퍼질러스 아큘레아투스(Aspergillus aculeatus) 유래 아라바나아제(arabanase), 셀룰라아제(cellulase), 베타-글루카나아제(beta-glucanase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase) 및 자일라나아제(xylanase)를 포함하는 복합 효소이다. 이 비스코자임은 시중에서 쉽게 구매하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 b)단계는 비스코자임의 작용을 통해 생성된 진세노사이드 F2를 Rh2, Rk2 및 Rh3로 전환하는 단계라고 할 수 있다. 본 발명에 따르면 유기산 처리 및 가열하는 방법으로 이를 달성할 수 있다.

이때 유기산으로는 프로피온산(propionic acid), 시트르산(citric acid), 락트산(lactic acid), 타르타르산(tartaric acid) 및 아세트산(acetic acid) 중에서 선택된 유기산을 사용할 수 있다. 유기산의 농도는 0.5 내지 5%(v/v)가 되도록 하는 것이 효율적인 전환을 위해 바람직하다. 이와 같이 유기산을 첨가하고 가열하면 진세노사이드 F2로부터 Rh2, Rk2 및 Rh3로 전환시킬 수 있는데, 이때 가열온도는 80 내지 121℃로 이루어지는 것이 전환 효율을 위해 바람직하다. 가열온도를 121℃로 할 경우 약 15분 정도면 충분한 전환이 가능하며, 80℃로 할 경우에는 12시간 이상 가열하는 것이 바람직하다. 이를 토대로 온도에 비례하여 가열시간을 조절할 수 있을 것이다.

본 발명에 따르면 인삼 또는 인삼의 가공품에 극미량으로 존재하는 마이너 형태(minor form)의 희귀 진세노사이드인 Rh2, Rk2 및 Rh3를 안전하고 효율적으로 제조할 수 있다. 특히 본 발명의 방법은 공정이 매우 간단하며 제조 효율이 매우 뛰어나 산업적인 용도로의 대량생산이 가능하다는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 진세노사이드 제조방법을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 인삼 조사포닌에 비스코자임을 처리할 때 pH(5.0 ~ 6.0) 및 온도(45℃)에 따른 진세노사이드 F2로의 전환 효율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 PPD 타입 진세노사이드 혼합물(PPD type ginsenoside mixture)을 기질로 이용하여 노보자임사의 비스코자임을 처리하여 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd를 진세노사이드 F2로 전환시킨 후, 구연산을 1% 농도로 첨가하고 80℃에서 12시간 이상 반응시켜 진세노사이드 F2를 진세노사이드 Rh2, Rk2, Rh3로 모두 전환시킨 HPLC 분석결과를 나타낸 것이다. A는 고려인삼의 PPD 타입 진세노사이드 혼합물, B는 비스코자임 처리 12시간 후, C는 비스코자임 처리 24시간 후, D는 비스코자임 처리 48시간 후. E는 구연산을 1% 농도로 첨가하고 80℃에서 12시간 이상 반응시킨 것.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1.

1-1. 조사포닌 추출

고려인삼의 잎 및 뿌리를 20배 체적의 알코올 함량 80%(v/v)의 주정으로 2회 이상 추출(상온에서 1 ~ 2시간)하고 건조하여 추출물을 수득하였다. 이 추출물을 물에 다시 용해시켜서 HP-20 수지에 흡착시킨 후, 물로 세정하여 당을 제거하고 알코올 함량 40%(v/v)의 주정으로 1차 세정하여 protopanaxatriol 계열인 진세노사이드 Re와 Rg1을 우선적으로 제거한 후, 알코올 함량 80%(v/v)의 주정으로 세정하여 protopanaxadiol 계열인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd가 용출되어 나온 것을 획득하여 건조하였다.

1-2. 진세노사이드 F2 제조

상기 1-1에서 제조한 조사포닌을 0.1 ~ 2%의 초산 버퍼 0.1M(pH 5.0)로 용해한 후, 비스코자임(Viscozyme)(노보자임 사)을 전체부피의 1/10 ~ 1/2로 첨가하여 반응시키면 PPD type의 진세노사이드들(Rb1, Rb2, Rc, Rd)이 F2로 전환된다. 도 3은 pH에 따른 비스코자임의 효율성을 보여주고 있다. pH는 5.0에서 최적이며 온도는 45 ~ 50℃에서 최적이다. 이 최적 조건을 벗어나면 사포닌 중간 대사체들이 생길 수 있다. Gypenoside XVII (17), C-Mc, C-O, C-Mx 들이 그 중간 대사체들이다.

1-3. 진세노사이드 Rh2, Rk2, Rh3의 제조

진세노사이드 F2의 20번 탄소의 글루코스 한 분자를 떼어내기 위하여 약산 처리를 시도하였다. 이 약산으로는 구연산, 아세트산, 젖산, 프로피온산, 주석산(tataric acid)을 사용할 수 있다. 유기산의 농도는 0.5 ~ 3% 이내에서 사용할 수 있으며 또한 온도는 80 ~ 121℃까지 사용할 수 있으나 낮은 온도에서는 그 반응이 느려지므로 장시간 해야 하며, 121℃의 고온과 압력증기솥에서 반응이 이루어질 때에는 단 15분 만에 반응이 끝나 속성으로 Rh2(S), Rh2(R), Rk2, Rh3가 만들어질 수 있다. 또한 유기산의 종류와, 농도, 반응 온도에 따라서 네 가지 종류의 진세노사이드 비율이 다르게 만들어 질 수 있다. 대체적으로 Rh2(S), Rh2(R)의 함량을 높이기 위해서는 가급적 저온 80℃ 근처에서 장시간 반응시키는 것이 유리하다. 다음 표 1은 이 점을 잘 설명해 주고 있다.

반응온도	시료이름	면적비(%)
반응온도	시료이름	F2	Rh2(S)	Rh2(R)	Rk2	Rh3	Rh2(S)+Rh2(R)
80℃	propionic acid 1%	31.46	16.89	13.93	11.63	26.09	30.82
	propionic acid 3%		22.62	22.18	15.19	40.01	44.8
	citric acid 2%		20.13	23.49	14.57	41.81	43.62
	lactic acid 1%		20.75	21.98	15.99	41.27	42.73
	lactic acid 3%		16.72	24.27	15.77	43.23	40.99
	tartaric acid 1%		21.71	22.84	13.58	41.87	44.55
	tartaric acid 3%		20.01	23.2	13.96	42.83	43.21
	Acetic acid 0.5%	14.1	19.21	20.22	12.54	33.93	39.43
	Acetic acid 2%		21.02	23.32	13.89	41.77	44.34
	Acetic acid 5%		17.06	24.32	15.7	42.92	41.38

121℃	propionic acid 1%	30.16	13.53	14.09	12.11	30.12	27.62
	propionic acid 3%	1.2	14.89	22.04	16.7	45.17	36.93
	citric acid 2%		10.09	21.27	18.81	49.83	31.36
	lactic acid 1%		16.33	22.01	16.43	45.22	38.34
	lactic acid 3%		14.63	18.64	20.51	46.23	33.27
	tartaric acid 1%		10.6	21.94	18.36	49.1	32.54
	tartaric acid 3%		7.54	20.51	19.67	52.29	28.05
	Acetic acid 0.5%	23.74	14.06	15.56	12.8	33.83	29.62
	Acetic acid 2%	1.6	16.5	20.79	17.24	43.87	37.29
	Acetic acid 5%	0.49	13.02	21.3	18.58	46.61	34.32

Claims

a) 인삼 조사포닌을 비스코자임(viscozyme)과 반응시키는 단계; 및
b) 상기 a)단계에서 수득한 반응생성물에 유기산을 첨가하고 가열하는 단계;를 포함하는 진세노사이드 Rh2, Rk2 및 Rk3로 이루어진 군에서 선택된 진세노사이드 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 a)단계의 반응은 pH 4.5 내지 5.5 및 45 내지 50℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 유기산은 프로피온산(propionic acid), 시트르산(citric acid), 락트산(lactic acid), 타르타르산(tartaric acid) 및 아세트산(acetic acid) 중에서 선택된 유기산인 것을 특징으로 하는 진세노사이드 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 b)단계는 상기 유기산의 농도가 0.5 내지 5%(v/v)가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 가열은 80 내지 121℃로 이루어지는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 제조방법.