KR20160067476A

KR20160067476A - 진세노사이드 Rh2가 강화된 인삼추출물 배양액의 제조방법

Info

Publication number: KR20160067476A
Application number: KR1020140172925A
Authority: KR
Inventors: 박종상; 황준영; 배은영
Original assignee: 주식회사 에이치엘에스글로벌
Priority date: 2014-12-04
Filing date: 2014-12-04
Publication date: 2016-06-14

Abstract

본 발명은 진세노사이드 Rh2가 강화된 인삼추출물 배양액의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 인삼추출물에 유산균을 배양한 인삼추출물 배양액을 자외선 처리하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드가 강화된 인삼추출액물 배양액의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 항암 활성과 항알러지 효능이 뛰어난 진세노사이드 Rh2의 함량이 현저히 증가된 인삼추출물 배양액을 제조할 수 있어, 암예방 또는 알러지 예방 효과가 뛰어난, 기능성 식품 개발에 유용하다.

Description

진세노사이드 Rh2가 강화된 인삼추출물 배양액의 제조방법{Method for Preparing Ginsenoside Rh2 Enriched Culture Broth of Ginseng}

본 발명은 진세노사이드 Rh2가 강화된 인삼추출물 배양액의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 인삼추출물에 유산균을 배양한 인삼추출물 배양액을 자외선 처리하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드가 강화된 인삼추출액물 배양액의 제조방법에 관한 것이다.

인삼은 식물학적으로 오가과(Araliaceae)의 인삼속(Panax)에 속하는 식물로서, 동양에서는 오래전부터 효능 및 유효성이 잘 알려져 온 한약재이다.

근래 들어 인삼의 약리효능 연구의 과학적 진보에 따라 인삼으로부터 특유의 진세노사이드 성분을 분리하고, 그 화학구조를 밝히는 한편, 인삼의 유효성분과 약리효능을 구명함에 따라 인삼의 개별 사포닌마다 그 약리효능이 각각 다르고 새로운 효능이 속속들이 밝혀짐으로써 특정성분의 사포닌을 강화시킨 기능성 제품을 효율적이고 경제성 있게 제조하기 위한 인삼의 가공 및 제조방법과 관련된 기술이 개발되고 있으며, 이러한 기술들이 각광을 받고 있다.

인삼에 함유된 특정성분의 사포닌을 강화시킨 기술과 관련하여 고전적인 방법으로 구증구포에 의한 흑삼제조방법이 알려져 있으며, 홍삼농축액 및 추출액을 고온 고압처리하는 열처리에 의한 방법이 있는데, 고전적인 흑삼제조의 방법은 제조공정에 따른 시간이 너무 긴 단점이 있고, 고온고압처리 방법은 제조공정에 따른 시간은 단축할 수 있으나 고온고압에 의한 에너지 소비에 따른 비용이 증가하고, 공정 안정성이 낮은 단점이 있다.

현재까지 30여 종이 넘는 진세노사이드가 인삼 사포닌으로부터 분리·동정되었으며, 담마란(dammarane) 골격을 가진 아글리콘(aglycone)을 포함하는 글리코사이드(glycoside)인 진세노사이드에는 프로토파낙사디올(protopanaxadiol)계 사포닌에 속하는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd와 프로토파낙사트리올(protopanaxatriol)계 사포닌에 속하는 진세노사이드 Re와 Rg1이 대부분을 차지하고 있다.

한편, 진세노사이드는 섭취 후 사람의 장내 미생물에 의해 대사되어 그 대사산물이 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다(Karikura M, et al., Chem. Pharm. Bull, 39:2357-61, 1991; Kanaoda M, et al., J. Tradit. Med. 11:241-5,

1994; Akao T, et al., Biol. Pharm. Bull. 21:245-9, 1998). 예를 들어, 프로토파낙사디올계 사포닌인 Rb1, Rb2, Rc는 사람의 장내 세균에 의해 20-O-β-D-글루코피라노실(glucopyranosyl)-20(S)-프로토파낙사디올(IH-901, 화합물 K)로 대사되고(Hasegawa H, et al., Planta Medica 63:463-40, 1997; Tawab MA, et al., Drug Metab. Dispos. 31:1065-71, 2003), 프로토파낙사트리올계 사포닌인 Re와 Rg1은 장내세균에 의해 진세노사이드 Rh1이나 진세노사이드 F1으로 대사되며(Hasegawa H, et al., Planta Medica 62:453-7, 1996; Tawab MA, et al., Drug Metab. Dispos. 31:1065-71, 2003), 이렇게 전환된 화합물은 다양한 생리활성을 나타낸다.

이러한 이유로 진세노사이드를 그의 대사산물로 전환시키려는 노력들이 광범위하게 시도되었다. 일부 연구자들은 화학적 합성, 약산 가수분해, 알칼리 분해 등으로 진성 프로사포제닌(genuine prosapogenin) 또는 사포제닌을 생산하려 하였다

(Han BH, et al., Planta Medica 44:146-9, 1982; Chen Y, et al., Chem. Pharm. Bull. 35: 1653-5, 1987; Elyakov GB, Atopkina LN, Uvarova NI. Synthesis of the ginseng glycosides and their analogs. Proc. 6th Int. Ginseng Symp.Seoul 74-83, 1993).

그러나, 이러한 방법들은 에피머화(epimerization), 수화(hydration), 히드록실화(hydroxylation) 등과 같은 여러 가지 부반응을 야기시키므로, 최근에는 효소(Ko SR, et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 64:2739-43, 2000; Ko SR, et al., Planta Med. 69:285-6, 2003)와 장내세균(Hasegawa H, et al., Planta Medica 63:463-40, 1997; Bae EA, et al., J. Microbial. Biotechnol. 13:9-14, 2003) 등을 이용한 온화한 조건에서 진세노사이드를 전환시키는 방법들이 다양하게 연구되고 있다. 그러나, 이러한 분야에 대한 연구는 아직 부족한 상태이고, 현재 몇몇 생물 전환체가 보고되어 있기는 하지만 모두 일부 미생물에 국한된 전환 경로가 연구되어 있을 뿐이다. 또한, 인삼 사포닌을 전환하기 위해 사용된 미생물들은 대부분 식용가능하지 않은 유박테리움 종(Eubacterium sp.), 푸소박테리움 종(Fusobacterium sp.) 또는 박테로이데스 등으로서, 이로부터 생산된 대사산물들을 실생활에 이용하기 어렵다는 문제점이 있었다.

그리고 미생물(유산균)에 의한 방법, 산 및 효소에 의한 가수분해방법 등이 있으며, 미생물(유산균)에 의한 방법은 특정사포닌을 선택적으로 강화시킬 수 있는 장점은 있으나, 유산균의 선택과 배양하는 기술이 어렵고, 공정이 복잡하고 관리하기가 어렵다는 단점이 있으며, 상기 가수분해방법은 산의 종류나 효소의 종류에 따라서 특정사포닌의 선택성이나 변환효율이 차이가 나고, 일반적으로 미생물에 의한 방법보다 선택성이나 변환효율이 다소 떨어진다는 것이 단점이 있지만, 공정이 간단하여 생산단가를 현저히 낮출 수 있는 장점이 있고,

특히, 특정사포닌 변환에 적합한 산이나 효소의 선택과 공정의 최적조건을 개발한다면 산업경쟁력이 가장 큰 기술이다.

인삼에 함유된 특정성분의 사포닌을 강화시킨 선행기술로 예를 들면, 대한민국 공개특허공보 공개번호 10-2010-0098208호에는 인삼을 9회 증숙하고, 9회 건조 즉, 증숙과 건조를 9회 반복하는 과정에서 1회 및 6회차의 증숙공정을 상압 및 5~15기압의 압력조건하에서 수행하여 Rg3 및 Rh2의 함량이 증가된 흑삼의 제조방법을 개시하고 있으며, 이는 이른바 구증구포(九蒸九曝)하여 흑삼을 제조하는 방법을 이용하여 고압 하에서 열처리하는 기술로서, 고온고압조건에서 30일 이상의 긴 공정시간을 필요로 하기 때문에 비경제적 단점이 있다. 대한민국 공개특허공보 공개번호 10-2011-0052940호에는 인삼의 진세노사이드 Rb1함유 주정 추출물을 물 및 초산의 혼합물과 반응시킨 다음 정제하여 진세노사이드 Rg3가 강화된 인삼 추출물 분획을 제조하는 방법을 개시하고 있으며, 이는 반응 시에 초산 사용량이 반응액 부피 대비 25% 정도 사용하기 때문에 제품품질이 저하될 우려가 있을 뿐만 아니라 진세노사이드 Rg3만을 강화시킬 수 있고, 또한, 공정상에 다이아이온 HP-20 칼럼 등 정제방법을 사용하기 때문에 공정이 복잡한 단점을 가지고 있다.

추출물을 산가수분해 열처리하여 백삼 추출물로부터 Rg3의 전환을 유도함으로써 진세노사이드 Rg3를 함유한 산가수분해 백삼 추출물의 제조방법을 개시하고 있으며, 이는 진세노사이드 Rg3 함유량이 증가된 산가수분해 백삼 추출물이 얻어지고 있으나, 시트르산(citric acid)을 이용하여 PD(panaxadiol)계 사포닌을 산가수분해하여 Rg3를 강화시키는 방법으로서, 원료의 전처리공정에서 백삼추출액을 추출하여 고형분이 60% 이상으로 고농축 시킨 후, 80% 주정으로 불순물을 침전시키는 공정이 추가되어 있고, 다시 이로부터 얻어진 추출액을 10배 희석하여 산가수분해반응에 사용하므로 원료인 백삼추출물을 얻는 공정이 복잡한 것이 단점이다.

상기한 바와 같이 인삼에는 진세노이드가 일반적으로 약 33종 함유되어 있으며, 함량으로는 4% ~ 6% 정도가 포함되어 있는데, 특정 사포닌이 강화된 제품을 생산하기 위하여 보다 단순한 공정에서 효율적으로 제조할 수 있는 기술을 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 항암 활성과 항알러지 효능이 뛰어난 진세노이드 Rh2의 함량이 높은 인삼추출물을 얻고자 예의 노력한 결과, 인삼추출물에 유산균을 배양한 인삼추출물 배양액을 자외선 처리하는 경우, Rh2의 함량이 현저히 높아지는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 진세노사이드가 강화된 인삼추출물 배양액의 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 인삼분말 또는 인삼에 용매를 첨가하여 진세노사이드를 함유하는 인삼추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 인삼추출액에 유산균을 첨가한 후 배양하여 인삼추출물 배양액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 인삼추출물 배양액을 자외선 처리하는 단계를 포함하는 진세노사이드 Rh2가 강화된 인삼추출액물 배양액의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 항암 활성과 항알러지 효능이 뛰어난 진세노사이드 Rh2의 함량이 현저히 증가된 인삼추출물 배양액을 제조할 수 있어, 암예방 또는 알러지 예방 효과가 뛰어난, 기능성 식품 개발에 유용하다.

인삼에 포함된 진세노이드는 33종에 이르며, 진세노이드의 종류에 따라 약리효과가 달라 특정 진세노이드의 함량을 강화시킨 인삼추출물의 개발이 요구되고 있으며, 본 발명에서는 암세포 증식억제, 암세포 재분화 유도촉진, 암세포 침윤억제, 종양증식 억제작용, 항암제의 항암활성 증대작용, 항알러지효과, 항염증 효과 등을 나타내는 진세노사이드 Rh2의 함량이 증가된 인삼추출물 배양액을 제조하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 인삼분말의 메탄올 농축액을 멸균한 후, Lactobacillus alimentarius을 접종한 후 배양한 배양액에 250nm의 자외선 파장의 자외선을 10분, 30분 및 60분간 조사한 결과, Rb1, Rb2, Rc, Rg1, Re, Rg3 및 Rh2의 함량이 증가하였으며, 특히, 진세노사이드 Rh2의 함량이 10.2 중량%에서 29.2 중량% 3배 가까이 증가한 것을 확인하였다.

따라서 본 발명은 (a) 인삼분말 또는 인삼에 알코올을 첨가하여 진세노사이드를 함유하는 인삼추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 인삼추출액에 유산균을 첨가한 후 배양하여 인삼추출물 배양액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 인삼추출물 배양액을 자외선 처리하는 단계.를 포함하는 진세노사이드가 강화된 인삼추출액물 배양액의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 속, 비피도박테리움 속 및 스트렙토코쿠스속으로 구성된 군에서 선택되는 균주인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 자외선 처리는 100~300nm의 파장을 처리하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 150~250nm의 파장을 처리하는 것이 바람직하며, 180~220nm의 파장을 처리하는 것이 더더욱 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 자외선 처리는 5~300분 동안 처리하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 10~120분 동안 처리하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 30~60분 동안 처리하는 것이 더더욱 바람직하다.

본 발명에 의하면 진세노사이드 인삼 추출물 발효액에 함유된 Rb1, Rb2, Rc, Rg1, Re, Rg3 및 Rh2의 함량이 증가하는 것을 확인하였으며, 특히, 진세노사이드는 Rh2의 함량이 현저히 증가하는 것을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 인삼추출물 발효액의 제조

5g의 인삼분말에 30배의 80% 메탄올을 넣고 80℃에서 1시간 동안 추출한 후 여과하였다. 여과하고 남은 분말에 다시 20배의 80% 메탄올을 넣고 추출한 후 다시 여과하였다. 동일한 방법으로 한번 더 반복 추출한 후 메탄올을 모두 제거하였고(evaporator, Lab. Companion; Jeiotech, Kimpo, Korea), 여기에 10배의 물을 가하여 인삼 추출물을 제조하였다.

상기 인삼추출물을 121℃, 1.5 기압 하에서 15분간 고온 가압 처리하여 멸균하였다. 이어, 멸균된 인삼 농축액에 유산균을 접종하였다.

유산균으로는 Lactobacillus alimentarius (ATCC 29647), Lactobacillus bulagricus(ATCC6675), Streptococcus thermophilus(ATCC6780), Bifidobacterum breve(ATCC 6783)을 사용하였다.

접종량은 인삼 농축액의 전체 부피에 대하여 1%(v/v) 접종 후, 30℃에서 120시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 본 발명의 유산균 균주에 의해 생물전환된 진세노사이드 Sh2를 분석하였다.

컬럼에 물로 팽윤시킨 HP-20(Diaion사, 일본)을 충진하고 여기에 상기 발효 결과물을 로딩하여 HP-20에 흡착시켰다. 이어, 충진제의 2-3배의 물을 첨가하여 세척함으로써, 흡착된 사포닌 이외의 성분을 제거한 후 흡착된 사포닌을 주정으로 탈착하여 회수하였다. 회수한 추출물을 농축한 후 부탄올을 이용하여 층 분리를 하고 부탄올 층을 감암농축하였다. 상기 부탄올 층을 HPLC로 분석 하였다. HPLC 분석은, Jasco LC-2000Plus Series HPLC(Jasco, 일본)를 사용하여 실시하였고, 컬럼은 Merck Chromolith Performance RP-18e(4.6 x 100mm, 2micron), 컬럼의 오븐 온도는 30℃, 샘플의 로딩양은 10 ㎕로 하였다. 이동상으로는 100% 물과 100% 아세트니트릴로 75분간 농도구배 하여 얻었다. 유속은 분당 2.5 ml로 하였으며, 203 nm에서 검출하였다.

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 인삼추출물보다 유산균을 배양한 인삼추출물의 발효액에서 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rg1 및 Re는 감소하였고, Rg3 및 Rh2는 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 L.alimentarius를 배양한 배양액에서 높은 Rh2 함량을 확인할 수 있었다.

성분명	인삼추출물(중량%)	L.bulagricus 인삼추출물 발효액(중량%)	S.thermophilus 인삼추출물 발효액(중량%)	B.breve 인삼추출물 발효액(중량%)	L.alimentarius 인삼추출물 발효액(중량%)
Rb1	10.02	4.33	3.31	2.8	2.41
Rb2	6.01	4.22	3.01	3.00	2.02
Rc	5.98	2.11	1.92	2.31	0.62
Rg1	2.82	1.64	1.81	1.23	1.02
Re	5.52	2.89	2.13	1.88	0.96
Rg3	1.03	4.22	4.99	6.01	7.23
Rh2	2.33	4.99	4.21	5.24	10.20

실시예 2: 인삼추출물 발효액의 자외선 처리

실시예 1에서 제조한 인삼추출물 발효액 중 L.alimentarius 인삼추출물 발효액을 100nm, 200nm 및 300nm의 자외선 파장을 내는 램프라 장착된 조사기에 넣고, 30분간 자외선을 조사한 후, 실시예 1과 동일한 방법으로 진세노사이드의 함량을 측정하였다.

그 결과, 표 2에 나타난 바와같이, 자외선 처리에 의하여 진세노사이드 Rg3 및 Rh2의 함량이 대폭 증가하는 것을 확인하였으며, 특히, 200nm 파장에서 가장 높은 함량을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

성분명	인삼추출물 발효액(중량%)	자외선 처리 100mn	자외선처리 200nm	자외선 처리 250nm
Rb1	2.41	2.98	3.67	3.25
Rb2	2.02	2.33	3.12	2.66
Rc	0.62	0.87	1.22	1.11
Rg1	1.02	1.23	1.46	1.99
Re	0.96	1.34	2.13	1.98
Rg3	7.23	7.95	10.0	8.51
Rh2	10.20	14.14	29.21	21.22

L.alimentarius 인삼추출물 발효액에 200nm 램프를 이용하여, 자외선을 시간별로 10분, 30분 및 60분 조사한 후, 실시예 1과 동일한 방법으로 진세노사이드의 함량을 측정하였다.

그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 자외선 조사시간에 따라 Rh2 함량이 증가하는 것을 확인하였다.

성분명	인삼추출물 발효액(중량%)	자외선 처리 10분	자외선처리 30분	자외선 처리 60분	자외선 처리 120분
Rh2	10.2	13.22	28.35	30.24	32.01

이상으로, 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 진세노사이드 Rh2가 강화된 인삼추출액물 배양액의 제조방법:
(a) 인삼분말 또는 인삼에 알코올을 첨가하여 진세노사이드를 함유하는 인삼추출물을 제조하는 단계;
(b) 상기 인삼추출액에 유산균을 첨가한 후 배양하여 인삼추출물 배양액을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 인삼추출물 배양액을 자외선 처리하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 속, 비피도박테리움 속 및 스트렙토코쿠스속으로 구성된 군에서 선택되는 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유산균은 Lactobacillus alimentarius (ATCC 29647)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 자외선 처리는 100~300nm 파장에서 5~300분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.