KR20100111591A - 희귀생리활성 물질 아스트라갈린의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아스트라갈린의 제조방법에 관한 것으로 아스트라갈린 전구체로 부터 효소반응에 의하여 아스트라갈린을 생성하는 공정 및 그 반응조건에 관한 것을 특징으로 한다. 아스트라갈린은 플라보노이드의 일종으로 식물체에서 수 mg 정도 함유될 정도로 희귀한 것이나, 그 생리활성이 매우 높은 것으로 알려지고 있어 보편적인 생산공정의 개발이 필요하였다. 본 발명은 녹차씨에서 분리하여 얻어진 녹차씨 유래 사포닌을 원료로 하여 효소로서 아밀라아제를 첨가하고, 반응시켜 얻어지는 것을 특징으로 하는 아스트라 갈린의 제조공정에 관한 것이다.

녹차씨, 아스트라갈린, 아밀라아제, 플라보노이드

Description

희귀생리활성 물질 아스트라갈린의 제조방법{Preparation method for rare bioactive material, astragalin}

본 발명은 아스트라갈린의 효소적 제조방법에 관한 것으로서 카멜리어사이드(Camelliaside)를 기질로 하여 효소반응을 통하여 아스트라갈린을 생성하는 방법에 관한 것이다.

아스트라갈린은 플라보노이드의 배당체로 플라보노이드인 캄페롤(kaempferol)에 1개의 당이 결합된 형태를 가지고 있다. 이를 하기 도 1에 보였다.

플라보노이드는 대부분의 식물체에서 발견되며 통상 당이 결합된 형태인 글리코사이드의 형태를 이룬다. 그러나, 당이 제거된 형태인 어글리콘 타입의 플라보노이드가 생리활성이 높다는 것이 알려지면서 배당체 형태에서 당을 제거하는 연구가 많이 진행되고 있다.

당을 제거하는 방법으로는 화학적인 방법으로 가수분해를 이용하는 방법이 있을 수 있는데 이는 반응의 조절이 어렵고, 수율이 저하되며, 반응의 정확성이 떨 어져 높은 수율의 아스트라갈린을 얻을 수 없다는 단점이 있다. 다음으로 효소를 이용하는 방법이 있을 수 있는데 이는 많은 배당체에서 당을 제거하는 방법으로 널리 효소가 이용되고 있어 효소의 활성, 반응성, 가격 등에 의하여 경제성이 결정되고 공정의 효율성이 좌우되는 결과를 가져오므로 적절한 효소의 선정 및 값싼 원료의 확보는 경제성을 결정하는 매우 중요한 지표가 된다.

[문헌1]한국특허 제 10-0716887호에서는 녹차씨 유래의 카멜리어사이드 A,B를 함유하는 추출물을 이용하여 글루코시다제, 아라비오시다제, 람노시다제, 자일로시다제, 셀룰라제, 헤스페리디나제, 나린지나제, 글루쿠로니다제, 펙티나제, 갈락토시다제 및 아밀로글루코시다제 중에서 선택되어지는 효소를 이용한 캄페롤의 제조공정을 주장하고 있다. 이는 카멜리어사이드 A,B가 플라보노이드인 캄페롤에 3개의 당이 결합되어 있는 배당체인 점에 착안하여 이를 효소로 가수분해 하여 당을 제거하고 어글리콘 타입의 캄페롤을 제조하는 것을 그 특징으로 하고 있는 것으로서, 효소를 이용하여 3개의 당을 완전히 분해하는 것을 주요 특징으로 하고 있다. 또한, 녹차잎 또는 녹차씨에서 물, 유기용매로 추출한 추출물을 대상으로 하는 것으로서, 중간단계에서 본 발명의 목적물인 아스트라 갈린의 생성이 있은 후 최종 산물인 캄페롤이 생성되게 되는 바, 이를 조절하는 방법을 제공하지 못하여 아스트라갈린의 제조와는 관련이 없음을 명백히 알 수 있다. 따라서 [문헌1]은 녹차씨의 추출물을 원료로 하여 효소반응을 이용하는 측면은 동일하나, 최종 목적물이 [문헌1]에서는 캄페롤이나, 본 발명의 경우 아스트라 갈린이라는 점에서 발명의 구성에 차이가 확연히 존재한다.

[문헌2]대한민국 특허출원 10-2006-0119932호에서는 효소반응을 이용한 아스트라갈린을 제조하는 방법을 제시하고 있으며, 캄페롤 배당체로서 녹차씨에서 카멜리아사이드A 또는 B를 함유하는 분획을 수득하고 여기에 자일로시다제, 셀룰라제, 헤스페리디나제, 나린지나제, 글루쿠로니다제, 펙티나제, 갈락토시다제 로 구성되는 군 중에서 선택되어지는 효소를 이용한 아스트라갈린의 제조방법을 주장하고 있다. 이는 다음과 같은 점에서 본 발명과는 차이가 존재한다. 사용하는 효소에 있어 본 발명은 아밀라아제를 사용한다는 점에서 사용효소에 차이가 있고, 반응조건에 있어서도 본 발명은 섭씨60도를 초과하는 온도에서 섭씨65도까지의 온도범위라는 점에서 차이가 있으며, 반응시간에 있어 본 발명은 12시간 이내인 점이 비교발명[문헌2]와 차이가 존재한다.

[문헌3]J. Agricultural and Food Chemistry, 54(8), 2951-2956 (2006) 에서는 Tea seed cake을 원료로하여 효소반응 후 캄페롤을 제조하는 방법을 기술하고 있다. 이는 캄페롤 배당체에서 중간단계로 2개의 당을 가진 배당체인 니코티플로린을 생성하고, 다시 추가적인 반응의 진행에 의하여 1개의 당을 가진 아스트라갈린을 생성하며 역시, 지속적인 당분해 반응을 통하여 최종적으로 당이 완전히 제거된 캄페롤을 생성하는 것을 제시하고 있다. [문헌3]은 캄페롤배당체에서 캄페롤을 제조하기까지의 공정이 당을 분해하여 제거하는 공정으로서, 공정의 운전조건 및 적절한 효소의 사용으로 니코티플로린, 아스트라갈린 그리고 최종적으로 캄페롤까지 생성되는 것을 확인가능하며, 공정의 조건을 조절하는 방법에 의하여 중간산물을 얻을 수 있음을 제시하고 있다. 따라서, [문헌3]은 [문헌2]의 방법에 대한 일반적 인 방법을 미리 제시하고 있음을 알 수 있다. 본 발명은 사용하는 효소 및 반응조건에 있어 [문헌3]과는 확연한 차이가 존재하며 본 발명의 아스트라갈린 제조공정은 지금까지 알려진 공정에 비하여 고효율, 저원가의 제조공정이며, 또한 기존의 발명과는 사용효소, 운전조건, 최적의 반응시간에 있어 전혀 다르며, 기존의 반응에 비하여 단시간에 아스트라갈린을 고수율로 생산할 수 있다는 점에 매우 개선된 제조공정을 제공한다고 할 수 있다.

본 발명자들은 녹차씨케익에 다량으로 존재하는 카멜리아사이드 A, B를 원료로하여 효소반응을 통하여 이들 캄페롤 배당체에서 2개의 당을 제거하여 최종적으로 1개의 당을 가진 배당체인 아스트라갈린의 생성하는 방법을 개발하고자 하였다.

지금까지의 아스트라갈린의 생산방법은 식물체에서 아스트라갈린을 추출하고 이를 재결정하여 얻는 방법, 칼럼을 통하여 정제하는 방법이 알려져 있었으며, [문헌2]에서는 녹차씨 추출물을 이용한 효소반응을 통하여 아스트라갈린을 생성하는 방법이 제시되어 있다. [문헌2]는 녹차씨에서 물 또는 유기용매로 추출물을 제조하고 여기에 사용 효소로서 자일로시다제, 셀룰라제, 헤스페리디나제, 나린지나제, 글루쿠로니다제, 펙티나제, 갈락토시다제 로 구성되는 군 중에서 선택되어지는 효소를 이용한 아스트라갈린의 제조방법을 제시하는 것으로서, 이는 녹차씨에서 추출 물을 제조하여야 하며, 반응의 시간이 10~60시간으로 제시되어 있고, 바람직하게는 40~50시간, 온도가 섭씨30~60도로 규정되어 있다.

따라서 본 발명에서는 아스트라갈린을 생산하기 위한 방법으로 그 원료로서 녹차씨 착유박(차종실박)을 사용하여 원가를 절감하며, 값싸며 고효율의 효소를 사용하고, 고온에서 단시간에 반응시키는 제조공정을 개발하여 아스트라갈린의 생산비를 현저히 절감하여 경제성을 높이고자 하였다.

기존의 아스트라갈린의 제조공정이 녹차씨에서 추출물을 제조하여야 하는 점, 효소반응임에도 불구하고, 반응시간이 지나치게 길다는 점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 원료 및 효소를 검색하여 가장 경제적인 효소를 선별하였으며, 그 과정에서 반응시간을 획기적으로 단축하고, 원료로서 별도의 추출이 불필요한 부산물을 이용할 수 있는 공정을 개발하였다.

본 발명의 아스트라갈린의 제조방법에 의하면 고도의 생리활성을 가진 아스트라갈린을 저렴한 비용으로 높은 생산성으로 제조가능하게 되어 아스트라갈린의 생산단가를 현저히 낮출 수 있어 아스트라갈린의 산업적 응용을 촉진할 수 있게 된다.

아스타라갈린의 효율적 제조를 위하여 본 발명자들은 다음과 같은 부분으로 나누어서 접근하였다. 첫째는 원료, 둘째는 효소 그리고 셋째는 반응조건이었다. 먼저, 원료로서 가장 많은 캄페롤배당체를 함유한 것으로 알려진 녹차씨를 그 원료로 선정하였으며, 기존의 발명에서 녹차씨 추출물을 대상으로 한 것과는 달리 녹차씨가 기름을 생산하기 위하여 재배, 수확되는 점을 이용하여, 녹차씨에서 착유하고 남은 부산물인 녹차씨케익(차종실박)을 효소반응의 원료로 사용하였다. 이 경우 기존의 발명에서 녹차씨에서 물 또는 유기용매로 추출하여야 하는 공정을 제외할 수 있어 공정의 효율이 향상되게 된다.

둘째로 효소반응을 위한 효소로서, 아밀라아제를 선별하였으며, 효소의 반응조건이 섭씨60도 이상의 고온에서 반응이 단시간에 진행되는 장점이 있어 최적의 반응시간을 현저히 단축할 수 있는 점이 있었으며, 생성되는 아스트라갈린의 수율에 있어 기존의 효소와는 달리 전환율이 99% 이상으로 매우 높아 전체 생산공정의 효율을 획기적으로 향상시킬 수 있게 되었다.

본 발명의 효소반응을 다음의 화학식으로 나타내었다.

본 발명은 아스트라갈린을 제조하기 위한 원료로서 [문헌2]에서는 녹차씨에서 헥산으로 추출하고, 이를 다시 80% 메탄올로 추출하였던 부분을 공정의 효율화를 위하여 녹차씨를 이용하여 녹차씨유를 제조하는 공정에서 특히, 녹차씨를 제조하기 위한 차나무의 경우 Camellia sinensis와 Camellia oleifera의 종이 있는데 이 중 Camellia oleifera종에서 얻어진 것만을 주요 원료로 하여 차종실유를 얻고 남은 박을 아스트라갈린을 생산하기 위한 원료로 사용하였다. 그 이유는 Camellia sinensis에서 얻어진 녹차씨의 경우 아스트라갈린을 얻기 위한 기질인 카멜리아사이드 A, B의 함량이 매우 낮아 효소반응을 통한 아스트라갈린의 생산이 경제성이 없기 때문이다.

사용하는 효소는 아밀라아제(Amylase)로서 Aspergillus aculeatus를 배양하여 얻어진 배양액을 원심분리하여 세포를 제거한 다음, 이를 2배수의 에탄올을 가하여 침전되는 단백질 성분을 여과하여 회수한 다음 이를 물에 재용해하여 효소로 사용하였다. 아밀라아제는 일반적으로 고분자의 당을 분해하는 것으로 알려져 있으며, 본 발명에서는 다수의 아밀라아제 중 Aspergillus aculeatus가 생산하는 아밀라아제가 아스트라갈린으로의 전환 효율을 극대화 할 수 있어 이를 주요 효소생산균주로 사용하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

녹차씨 또는 차종실로서 Camellia oleifera에서 얻어진 씨앗을 원료로하여 차종실유를 생산하고, 남은 부산물인 Tea seed cake을 이용하여 차종실 박 무게의 5~20배수의 물을 가하고 온도를 섭씨50~80도로 하여 물에 현탁시키고, 여기에 효소의 생산을 위한 균주로서 Aspergillus aculeatus를 배양하여 얻어진 배양액을 원심분리하여 세포를 제거한 다음, 이를 상온에서 2~4배수 부피의 에탄올을 가하여 서서히 저어주면서 침전되는 단백질 성분을 여과하여 회수한 다음, 이를 물에 재용해 하여 미리 준비한 차종실 액에 첨가하고, 반응을 위한 온도로서 섭씨 60~65도로 유지하고, 반응시간으로서 12시간을 넘지 않도록 하면서 저어주면서 반응을 진행시킨다. 효소반응을 위한 기질로서는 차종실박을 직접이용할 수도 있으며, 이를 물을 가하고 추출한 다음 불용성 물질을 여과하여 제거하고, 얻어진 추출액을 사용할 수 있다. 반응을 위한 pH는 차종실 박의 현탁액을 사용하는 것으로서 별도의 pH를 조 절할 필요는 없다. 사용하는 효소의 농도는 기질의 양을 기준으로 하여 무게비로 0.001~1.0%(w/w)의 범위가 적당하며, 특히 무게비를 기준으로 0.5%(w/w)이 적절하다. 반응온도는 섭씨 60~65도가 가장 좋으며 더욱 좋게는 섭씨 62도가 좋다. 반응온도는 효소의 활성에 직접적인 영향을 미치는 것으로서 섭씨 65도를 넘어갈 경우 아스트라갈린의 생성을 지나 캄페롤로의 반응이 진행되어 캄페롤이 검출되는 경우가 생기며, 반응온도가 섭씨 60도 이하의 경우 반응시간이 지나치게 길어지면서 동시에 반응의 정확성이 저하되어 중간산물인 니코티플로린, 아스트라갈린, 캄페롤이 혼합하여 생성되는 문제점이 있다. 또한, 지나치게 오랜 반응으로 효소의 활성이 저하되어 효소의 첨가량이 증가하는 영향을 초래하게 된다.

반응액은 일시적으로 가온하여 섭씨80도까지 처리하여 효소의 활성을 제거한 다음 여과하여 아스트라갈린이 함유된 액을 회수한다. 열처리과정이 없을 경우 지속적인 반응이 전개되어 일시적으로 캄페롤이 형성되는 경우가 발생할 수 있다. 반응액은 진공농축하여 분말화 하여 이를 다시 알콜로 재용해 하여 알콜 가용성분만을 회수하게 되며 이 과정에서 생성된 아스트라갈린을 95%이상 회수가능하다. 알콜분획의 아스트라갈린의 순도는 55~85%(w/w)으로 이를 실리카컬럼을 이용하여 재처리하거나, 메탄올을 이용하여 재결정할 경우 최종적으로 얻어지는 아스트라갈린의 순도는 90%(w/w)이상으로 고순도의 아스트라갈린을 얻을 수 있다.

아스트라갈린의 수율은 원료 차종실박을 기준으로 할 경우 1~5%(w/w)이며 이는 기존의 식물추출물에 함유된 양과 비교할 때 10~100배에 해당하는 양이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예로서 상술하고자 한다. 다만, 하기의 실시예 가 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

제조예 1. 반응용 원료의 준비

차종실 박 1Kg에 물을 10L의 물을 가하고, 섭씨 80도에서 3시간 동안 저어주면서 가용성분을 추출하여 서서히 냉각시킨다.

효소반응을 위한 효소의 준비는 아밀라아제를 생산하는 균주인 Aspergillus aculeatus를 5L 발효조에서 배양하고, 원심분리하여 균체를 제거하고, 얻어진 발효액에 3배수의 에탄올을 가하여 천천히 저어주면서 침전으로 형성되는 단백질을 여과하여 회수하였다. 이를 동결건조하여 Crude enzyme으로서 5.1g의 분말상의 단백질을 얻었다.

실시예 1. 아스트라갈린의 생산을 위한 효소반응

실시예 1에서 얻어진 차종실박 용액 1L에 얻어진 0.3g을 물에 완전 용해하여 첨가하고 이를 섭씨 62도에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응의 종료는 효소반응의 기질인 Camelliaside A,B가 완전히 사라지는 점을 기준으로 하였으며, 시간에 따른 아스트라갈린의 생성을 조사한 결과를 다음의 표1에 보였다.

시간	0	1	2	4	6	7	8	9	10	11	12
전환율(%)	0	5	15	30	50	65	80	90	95	97	99

실시예 2. 반응온도별 아스트라갈린의 전환율(%)

상기 실시예1에서와 같이 시료를 준비하고 이를 반응온도별로 섭씨30, 40, 50, 55, 60, 62, 65, 70도로 구분하고 반응하여 아스트라갈린으로의 전환율을 조사하였다. 그 결과를 다음의 표2에 보였다.

온도(℃)	30	40	50	55	60	62	65	70
전환율(%)	8	15	23	65	89	99	91	80

실험예 1. 아스트라갈린의 확인

상기 효소반응의 결과 얻어진 아스트라갈린은 액체분석크로마토그래피를 이용하여 시그마-알드리치사에서 판매중인 표준물질을 사용하여 동일한 시간대에서 피크를 확인하는 방법으로 아스트라갈린을 정량 및 확인하였다.

실시예 3. 생성된 아스트라갈린의 정제

상기 실시예1에서 얻어진 반응액 1L를 여과하여 불순물을 완전히 제거하고, 이를 동결건조하여 수분을 제거하였다. 얻어진 분말은 132g이었다. 여기에 메탄올을 1,300ml가하고 섭씨 50도에서 가열하여 가용성분을 용해시킨 다음 여과하여 불용성분을 제거하고, 얻어진 여액을 진공농축하여 결정성의 노란색 분말 23g을 얻었다. 이 분말은 HPLC로 아스트라갈린 정략분석한 결과 순도 82%(w/w)였다.

본 발명은 다양한 생리활성을 가진 아스트라갈린의 효소적 제조방법에 관한 것으로서 자연계에서 희귀한 아스트라갈린을 효소반응을 이용하여 손쉽게 제조하는 방법을 제공함으로써 아스트라갈린을 이용한 산업적 응용분야를 다양하게 제공할 수 있는 근거가 될 수 있으며, 다양한 형태의 제품으로 개발 될 수 있는 가능성을 확보할 수 있게 한다.

도1은 아스트라갈린의 화학적 구조식을 나타낸 것이다.

Claims (6)

1. 녹차씨에서 착유하고 남은 박을 원료로 무게대비 5~20배수의 물을 가하고, 온도를 섭씨50~80도로 한 다음, 섭씨 60~65도에서, 아밀라아제를 가하여, 반응시간 12시간을 넘지 않도록 반응시키는 방법에 의하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 아스트라갈린의 제조방법
2. 제 1 항에서 아밀라아제를 생산하는 균체가 Aspergillus aculeatus인 것을 특징으로 하는 아스트라갈린의 제조방법
3. 제 1 항에서 첨가하는 Crude 아밀라아제의 양이 고형분을 기준으로 0.001 ~ 1.0%(w/w)인 것을 특징으로 하는 아스트라갈린의 제조방법
4. 제 1 항에서 얻어진 효소반응액을 여과하여 여액을 얻고, 수분을 제거하여 분말화 한 다음, 여기에 메탄올을 가하여 가용성분을 용해하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 아스트라갈린의 정제방법.
5. 제 4 항에서 얻어진 아스트라갈린 조성물로서 순도 80%(w/w)이상인 것을 특징으로 하는 아스트라갈린 조성물.
6. 제 1 항에서 녹차씨를 제공하는 차나무가 Camellia oleifera인 것을 특징으로 하는 아스트라갈린의 제조방법

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