KR20080033705A - 캄페롤-3-o-루티노사이드의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 캄페롤-3-O-루티노사이드(kaempferol-3-O-rutinoside)를 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식물 추출물에서 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체로부터 효소 또는 미생물을 이용하여 선택적으로 당을 제거하는 가수분해를 통해 하기 화학식 1의 캄페롤-3-O-루티노사이드를 분리하는 것을 특징으로 하는 캄페롤-3-O-루티노사이드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 방법을 이용하면, 식물 추출물로부터 주요한 생리활성물질인 캄페롤-3-O-루티노사이드를 대량으로 생산할 수 있다.
Figure 112006074000977-PAT00001
캄페롤-3-O-루티노사이드, 식물, 카멜리아시드, 추출물, 효소, 녹차 종자

Description

캄페롤-3-O-루티노사이드의 제조방법{Process for preparing Kaempferol-3-O-rutinoside}
본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 캄페롤-3-O-루티노사이드를 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식물 추출물에서 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체로부터 효소 또는 미생물을 이용하여 선택적으로 당을 제거하는 가수분해를 통해, 캄페롤-3-O-루티노사이드를 분리하는 방법에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112006074000977-PAT00002
상기 화학식 1로 표현되는 캄페롤-3-O-루티노사이드는 플라보노이 드(flavonoid) 중의 하나인 플라보놀(flavonol)의 대표적인 성분 중의 하나로 식물의 꽃 또는 잎에 널리 분포되어 있다(Redox report, 4, 13-16, 1999). 특히, 캄페롤-3-O-루티노사이드는 항산화(Redox Report, Vol. 4, No. 3, 1999), 혈행개선(Biol. Pharm. Bull. 25(4) 505-508, 2002) 등의 생리활성이 뛰어난 물질로 다양한 효능이 연구되고 있으며, 다양한 분야로의 적용이 이루어지고 있다. 그러나, 현재 사용되고 있는 캄페롤-3-O-루티노사이드는 대부분 식물 추출물에 미량 함유된 형태로, 그 함량이 수 ppm에서 수 십 ppm 정도이기 때문에 캄페롤-3-O-루티노사이드의 실질적인 효능이 발현된다고 보기 어렵다. 또한, 캄페롤-3-O-루티노사이드를 다량으로 함유한 식물을 찾기 어렵고, 고함량의 캄페롤-3-O-루티노사이드를 제조하기 위한 분리정제도 경제성을 감안할 때 큰 장점이 없어 캄페롤-3-O-루티노사이드의 대량생산에 대한 연구는 거의 없는 실정이다.
녹차는 전 세계의 가장 오래된 역사를 가지고 있는 음료로, 최근 녹차에 대한 관심이 높아지면서 차의 성분과 그 약리 효과에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다. 하지만, 이러한 다양한 효능을 가지고 있는 녹차는 대부분 잎을 사용하고 있으며 유사한 효능 물질을 함유하고 있는 녹차 종자는 재배 목적 외에 특별히 사용되고 있지 못하다.
따라서 본 발명자들은 녹차 중 특별한 용도로 사용되지 못하고 있는 녹차 종자에서 카멜리아시드 A, 카멜리아시드 B 등의 배당체들(glycosides)이 다량 함유되어 있음을 발견하고, 이로부터 생리활성이 뛰어난 캄페롤-3-O-루티노사이드를 대량생산 할 수 있는 방법을 연구한 결과, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 화장품 및 식품 소재로서 활용이 가능한 고순도 캄페롤-3-O-루티노사이드를 대량으로 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 하기 화학식 1로 표현되는 캄페롤-3-O-루티노사이드를 제조하는 방법에 있어서, 식물 추출물로부터 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체로부터 선택적 당제거가 가능한 효소 또는 미생물을 이용한 가수분해를 통해 상기 캄페롤-3-O-루티노사이드를 수득하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112006074000977-PAT00003
본 발명에 의한 캄페롤-3-O-루티노사이드를 제조하는 방법은, 물 또는 유기용매를 이용하여 식물추출물을 수득하고, 이 추출물로부터 효소 또는 미생물을 이 용하여 선택적으로 당을 제거함으로써 캄페롤-3-O-루티노사이드를 분리하는 것을 특징으로 한다.
상기 추출물은 캄페롤-3-O-루티노사이드 또는 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체, 특히 카멜리아시드 A 또는 카멜리아시드 B가 함유되어 있는 것임을 특징으로 한다.
또한, 상기 유기용매로서는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기용매 또는 이들과 물의 혼합물, 바람직하게는 80% 에탄올을 사용할 수 있다.
상기 효소는 당 결합을 분해하는 효소로서 미생물 등으로부터 얻을 수 있는 효소이다. 이 효소는 상업적으로 시판되는 것을 사용하거나 필요에 따라 제조하여 사용할 수 있다. 이 효소는 특히, 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체로부터 당을 선택적으로 제거하는 것을 통해 캄페롤-3-O-루티노사이드를 분리하는 활성을 갖는 효소임을 특징으로 한다.
또한, 상기 효소는 더욱 바람직하게는 글루코시다제(glucosidase), 자일로시다제(xylosidase), 자일라나아제(xylanase), 셀룰라제(cellulase), 갈락토시다제(galactosidase), 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase) 및 나린지나아제(naringinase)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 미생물은 아스퍼질러스(aspergillus)속, 바실러스(bacillus)속, 페니실리움(penicillium)속, 리조푸스(rhizopus)속, 리조무코르(rhizomucor)속, 탈라로마이세스(talaromyces)속, 비피도박테리움(bifidobacterium)속, 모르티에렐 라(mortierella)속, 크립토코커스(cryptococcus)속 및 마이크로박테리움(microbacterium)속으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 제거되는 당은 카멜리아시드 A의 갈락토피라노스(galactopytanose) 그룹 또는 카멜리아시드 B의 자일로피라노스(xylopyranose) 그룹인 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 하기와 같다.
녹차 종자로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체, 특히 카멜리아시드 A 또는 카멜리아시드 B를 함유하는 식물 추출물을 수득하기 위하여, 녹차 종자에 약 1 내지 6배, 바람직하게는 약 3배의 유기용매를 넣고, 상온에서 1 내지 5회 교반하면서 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 식물에 약 1 내지 8배, 바람직하게는 약 4배의 물 또는 유기용매를 넣고, 1 내지 5회 환류 추출한 후, 10 내지 20℃에서 1 내지 3일간 침적시킨 후, 여과와 원심분리를 통하여 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압 농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 등을 이용하여 색소를 제거한 다음, 수층을 유기용매를 사용하여 1 내지 5회 추출한 후, 수득한 유기용매 층을 감압 농축하여 유기용매 엑기스를 얻은 다음, 이를 소량의 메탄올 등에 녹인 후, 대량의 에틸아세테이트 등을 추가하여 생성된 침전물을 건조시켜, 본 발명의 상기 추출물을 수득할 수 있다.
이렇게 제조된 상기 녹차 종자 추출물 중의 카멜리아시드 A 또는 B로부터 효 소 또는 미생물을 이용하여 캄페롤-3-O-루티노사이드를 제조한다.
카멜리아시드 A로부터 캄페롤-3-O-루티노사이드를 제조하는 반응은 하기 반응식 1과 같다.
Figure 112006074000977-PAT00004
카멜리아시드 B 로부터 캄페롤-3-O-루티노사이드를 제조하는 반응은 하기 반응식 2와 같다.
Figure 112006074000977-PAT00005
이 때, 효소 또는 미생물의 반응시의 pH는 4.0 내지 5.5의 범위가 적절하며, pH 4미만이면 반응 속도가 느려지고 pH 5.5를 초과하면 수율이 떨어지는 문제점이 있다. 또한 효소 또는 미생물의 반응시의 온도는 30 내지 50℃가 바람직하며, 상기 온도가 30℃ 미만이면 반응 속도가 느려지고 반응 온도가 50℃가 초과하면 효소의 반응 선택성이 떨어지는 문제점이 있다.
한편, 상기 기질로서 녹차 종자 추출물의 농도는 5 내지 20% 범위가 바람직하며, 상기 범위를 벗어날 경우 효소 또는 미생물의 사용량 대비 경제성이 떨어지거나 반응 속도가 너무 느려지는 문제점이 있다. 이때 반응 시간은 48 내지 76시간이 바람직하다.
마지막으로, 반응액을 박층크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수(80 ~ 100℃) 내에서 5 내지 15분 동안 가열하여 반응을 종료시킨다. 반응액을 감압 농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 알코올을 가하여 1 내지 5회 교반시킨 후, 침전된 염들을 여과를 통하여 제거하고, 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수득하고, 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올 = 8:1 ~ 4:1)로 분리하여 순수한 캄페롤-3-O-루티노사이드 수득할 수 있다.
이하, 제조예, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.
[제조예 1] 녹차 종자 추출물의 제조
녹차 종자 2㎏에 헥산 6ℓ를 넣고, 상온에서 3회 교반 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 녹차 종자 1kg에 80% 메탄올 4ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 후, 15℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압 농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 1ℓ로 5회 추출하여 색소를 제거하고, 수층을 1-부탄올 500㎖로 3회 추출하였다. 이로부 터 얻은 총 1-부탄올층을 감압 농축하여 1-부탄올 엑기스를 얻고, 이를 소량의 메탄올에 녹인 다음, 대량의 에틸아세테이트에 추가하여, 생성된 침전물을 건조함으로써, 녹차 종자 추출물 250g을 수득하였다.
[실시예 1] 카멜리아시드 A를 선택적으로 가수분해하는 효소의 선별
상기 제조예 1에서 수득한 녹차 종자 추출물 10g을 100㎖의 0.1M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 효소 1.5g을 첨가하여 37℃ 수욕상에서 24 및 48시간동안 반응시켰다. 반응의 전환율 분석은 HPLC를 이용하여 C18 역상 칼럼(reverse phase column)에서 아세토니트릴:물(40:60)을 이동상으로 하여 UV 파장 270nm에서 분석하였다. 실험에 사용된 효소의 종류와 전환율의 결과를 하기 표 1에 나타냈다.
효소(Enzyme) 출처(Origin) 생성율(%)
24시간 48시간
아밀라아제 Aspergillus oryzae 12 32
베타-글루코시다제 Almond 44 65
아밀로글루코시다제 Aspergillus niger 43 56
셀룰라제-T Trichoderma reesei - -
셀룰라제-A Aspergillus niger 34 65
베타-갈락토시다제 Aspergillus oryzae 70 84
베타-자일로시다제 Aspergillus niger 13 23
자일라나아제 Trichoderma viride 17 31
펙티나제 Rhizopus sp - -
나린지나아제 Penicillium decumbens 7 12
헤스페리디나제 Aspergillus niger 5 11
상기 표 1에서 일정시간 경과후의 생성율이 50% 전후인 효소는 반응 선택성이 높을 가능성이 있는 효소를 의미한다고 볼 수 있다. 따라서, 베타-글루코시다제, 아밀로글루코시다제, 셀룰라제-A 및 베타-갈락토시다제는 상기 선택적 당 제거 반응에 있어서 선택성이 높은 후보군임을 예측할 수 있다.
[실시예 2] 카멜리아시드 B를 선택적으로 가수분해하는 효소의 선별
상기 제조예 1에서 수득한 녹차 종자 추출물 10g을 100㎖의 0.1M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 효소 1.5g을 첨가하여 37℃ 수욕상에서 24시간 및 48시간동안 반응시켰다. 반응의 전환율 분석은 HPLC를 이용하여 C18 역상 칼럼(reverse phase column)에서 아세토니트릴:물(40:60)을 이동상으로 하여 UV 파장 270nm에서 분석하였다. 실험에 사용된 효소의 종류와 전환율의 결과를 하기 표 2에 나타냈다.
효소(Enzyme) 출처(Origin) 생성율(%)
24시간 48시간
아밀라아제 Aspergillus oryzae - -
베타-글루코시다제 Almond - -
아밀로글루코시다제 Aspergillus niger - -
셀룰라제-T Trichoderma reesei 11 24
셀룰라제-A Aspergillus niger - -
베타-갈락토시다제 Aspergillus oryzae - -
베타-자일로시다제 Aspergillus niger 64 77
자일라나아제 Trichoderma viride 53 64
펙티나제 Rhizopus sp - -
나린지나아제 Penicillium decumbens 48 69
헤스페리디나제 Aspergillus niger 4 10
상기 표 2에서 일정시간 경과후의 생성율이 50% 전후인 효소는 반응 선택성이 높을 가능성이 있는 효소를 의미한다고 볼 수 있다. 따라서, 베타-자일로시다제, 자일라나아제 및 나린지나아제는 상기 선택적 당 제거 반응에 있어서 선택성이 높은 후보군임을 예측할 수 있다.
[실시예 3] 온도에 따른 캄페롤-3-O-루티노사이드의 생성율 변화
상기 제조예 1에서 수득한 녹차 종자 추출물 10g을 100㎖의 0.1M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 상기 후보 효소 중 베타-갈락토시다제 1.5g을 첨가하여 다양한 온도에서의 캄페롤-3-O-루티노사이드의 생성율을 확인하였다.
반응 온도(℃) 생성율(%)
25 79
30 92
35 98
40 97
45 94
50 91
30 내지 50℃에서 캄페롤-3-O-루티노사이드가 원활하게 전환되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 30℃나 40℃보다는 35℃도에서 더욱 높은 전환율을 보였는데, 이는 온도에 따라 효소의 반응성이 증가된 결과이다. 하지만 45℃ 이상의 온도에서는 생성율이 낮아지는 현상을 보였는데, 이것은 온도증가에 따른 효소의 불안정성에서 기인된 것으로 파악된다.
[실시예 4] 반응 시간에 따른 캄페롤-3-O-루티노사이드의 생성율 변화
상기 제조예 1에서 수득한 녹차 종자 추출물 10g을 100㎖의 0.1M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 상기 후보 효소 중 베타-갈락토시다제 1.5g을 첨가하여 37℃ 수욕상에서 반응 시간에 따른 캄페롤-3-O-루티노사이드의 생성율을 확인하였다.
반응 시간(hr) 생성율(%)
12 33
24 68
48 91
72 98
96 98
120 98
반응 시작 후 72시간 경과 후에 98% 의 생성율을 보였고, 그 이상의 반응 시에도 유사한 생성율을 보였다.
[실시예 5] 반응 pH에 따른 캄페롤-3-O-루티노사이드의 생성율 변화
상기 제조예 1에서 수득한 녹차 종자 추출물 10g을 100㎖의 0.1M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 상기 후보 효소 중 베타-갈락토시다제 1.5g을 첨가하여 37℃ 수욕상에서 완충용액의 pH에 따른 캄페롤-3-O-루티노사이드의 생성율을 확인하였다.
반응 pH 생성율(%)
4.0 93
4.5 98
5.0 95
5.5 90
6.0 84
6.5 77
7.0 75
7.5 78
8.0 80
8.5 82
9.0 83
상기 결과에 따르면 pH 4.0 내지 5.5 범위에서 90% 이상의 높은 생성율을 보였으며 pH 4.5에서 98% 의 최고 생성율을 보였다.
[실시예 6] 기질 농도에 따른 캄페롤-3-O-루티노사이드의 생성율 변화
상기 제조예 1에서 수득한 녹차 종자 추출물을 5 내지 50%로 조정하고 여기에 상기 후보 효소 중 베타-갈락토시다제 1.5g을 첨가하여 37℃ 수욕상에서 캄페롤-3-O-루티노사이드의 생성율을 확인하였다.
기질 농도(%) 생성율(%)
5.0 97
10.0 98
15.0 95
20.0 91
25.0 87
30.0 83
35.0 76
40.0 71
45.0 63
50.0 55
상기 결과에 따르면 기질농도는 5 내지 20% 범위에서 90% 이상의 높은 전환율을 보였으며 10%에서 98%의 최고 전환율을 보였다.
[실험예 1] 캄페롤-3-O-루티노사이드의 동정
상기 실시예 1 내지 6에서 제조된 생성물은 하기와 같은 특성을 나타내어 캄페롤-3-O-루티노사이드로 동정(Varian Gemini 2000 300MHz, Varian사)하였다.
<캄페롤-3-O-루티노사이드의 물리화학적 성상>
성상 : 연한 녹황색의 미세 결정
양성(Positive) FAB-MS : 595[M+H]+
1H NMR : 6.31(1H, d, 2, H6), 6.63(1H, d, 2, H8), 7.03(2H, d, 8, H3',5'), 8.21(2H, d, 8, H2',6'), 12.04(1H, s, 5-OH), 1.10(3H, d, 4, Me-rha), 4.61(1H, br s, H1-rha), 5.20(1H, d, 8, H1-glc),
13C-NMR : 156.6, 133.5, 177.5, 161.3, 98.9, 164.2, 93.8, 156.9, 104.2, 121.1, 130.9, 115.2, 159.9, 115.2, 130.9, 101.6, 74.4, 76.7, 70.9, 76.0, 67.1, 100.8, 70.5, 70.2, 72.1, 68.3, 17.7
이상에서 설명한 바와 같이, 녹차 종자에 다량 함유되어 있는 카멜리아시드 A, 카멜리아시드 B를 추출한 후 효소 또는 미생물을 이용한 선택적 당 제거를 통해, 특히, 카멜리아시드 A의 갈락토피라노스 그룹과 카멜리아시드 B 의 자일로피라노스 그룹을 선택적으로 제거하는 것을 통해 주요한 생리활성물질의 하나인 캄페롤-3-O-루티노사이드를 대량으로 생산할 수 있다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표현되는 캄페롤-3-O-루티노사이드를 제조하는 방법에 있어서, 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체로부터 선택적 당제거가 가능한 효소 또는 미생물을 이용한 가수분해를 통해 캄페롤-3-O-루티노사이드를 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
    [화학식 1]
    Figure 112006074000977-PAT00006
  2. 제1항에 있어서, 상기 캄페롤-3-O-루티노사이드를 제조하는 방법은
    물 또는 유기용매를 이용하여 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체를 함유하는 식물 추출물을 수득하는 제 1 단계; 및
    효소 또는 미생물을 이용하여 상기 추출물에서 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체로부터 선택적으로 당을 제거하는 가수분해를 통해 캄페롤-3-O-루티노사이드를 분리하는 제 2 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 캄페롤-3-O-루티노사이드 제조 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체는 카멜리아시드 A 또는 카멜리아시드 B임을 특징으로 하는 캄페롤-3-O-루티노사이드 제조 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 캄페롤-3-O-루티노사이드는 카멜리아시드 A로부터 갈락토피라노스 그룹의 당을 선택적으로 제거하거나 카멜리아시드 B로부터 자일로피라노스 그룹의 당을 선택적으로 제거하여 수득하는 것을 특징으로 하는 캄페롤-3-O-루티노사이드 제조 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 카멜리아시드 A로부터 당을 제거하기 위한 효소는 글루코시다제, 셀룰라제, 갈락토시다제 및 아밀로글루코시다제로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상이고, 카멜리아시드 B로부터 당을 제거하기 위한 효소는 자일로시다제, 자일라나아제 및 나린지나아제로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상임을 특징으로 하는 캄페롤-3-O-루티노사이드 제조 방법.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 미생물은 아스퍼질러스(aspergillus)속, 바실러스(bacillus)속, 페니실리움(penicillium)속, 리조푸스(rhizopus)속, 리조무코르(rhizomucor)속, 탈라로마이세스(talaromyces)속, 비피도박테리움(bifidobacterium)속, 모르티에렐라(mortierella)속, 크립토코커 스(cryptococcus)속 및 마이크로박테리움(microbacterium)속으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 캄페롤-3-O-루티노사이드 제조하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 또는 미생물의 반응은 pH는 4.0 내지 5.5에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 캄페롤-3-O-루티노사이드 제조 방법.
  8. 제 1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 또는 미생물의 반응 시 온도는 30 내지 50℃인 것을 특징으로 하는 캄페롤-3-O-루티노사이드 제조 방법.
  9. 제 1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 또는 미생물의 반응 시간은 48 내지 76시간인 것을 특징으로 하는 캄페롤-3-O-루티노사이드 제조 방법.
  10. 제 2항에 있어서, 상기 캄페롤-3-O-루티노사이드 배당체를 함유하는 식물 추출물은 녹차 종자 추출물임을 특징으로 하는 캄페롤-3-O-루티노사이드 제조 방법.
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