CN102618593B - 一种利用黑曲霉水解灯盏乙素制备野黄芩素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用黑曲霉水解灯盏乙素制备野黄芩素的方法，利用黑曲霉水解灯盏乙素葡萄糖醛酸基，制备野黄芩素。包括如下步骤：利用黑曲霉（ Aspergillusniger AS3.795）对底物灯盏乙素进行生物转化，利用乙酸乙酯对发酵液中的转化产物进行萃取，并利用D101大孔吸附树脂柱色谱和重结晶对转化产物进行纯化。所制得的转化产物，其纯度根据高效液相色谱检测可达到99%以上。本发明克服了葡萄糖醛酸苷难以水解的缺点，能够在常温、常压等较为温和的条件下大量制备野黄芩素，有利于环境保护，降低了生产成本，适合于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于天然产物的微生物转化和提取分离技术领域，特别涉及到利用黑曲霉将灯盏乙素转化为野黄芩素。
背景技术
灯盏花，又名灯盏细辛，是植物短葶飞蓬（Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz）的干燥全草，主要分布在云南、广西等地，味辛、微苦，性温，具有祛风除湿、温络止痛、散寒解表之功效。现代药理学研究表明，灯盏细辛提取物具有降低血浆粘度、舒张血管、降低血管阻力、抑制缺血后血小板聚集、抗缺血再灌注损伤及改善脑功能等作用（中草药，2006，37（8）：附9-附11），由此引起了人们对灯盏细辛有效成分进行研究的广泛兴趣。经过多年研究，人们从灯盏细辛中分离得到了黄酮类化合物、咖啡酸酯类化合物、氨基酸及多糖类等多种化学成分，并发现灯盏乙素是灯盏花提取物的主要活性成分。研究表明，灯盏乙素还具有抗肿瘤、抗病毒、抗肝纤维化、抗老年痴呆等多种药理作用。但是，有关灯盏乙素的药代动力学研究表明，灯盏乙素口服给药后，灯盏乙素的血药浓度很低，即生物利用度很低，认为口服几乎不吸收（中国医药工业杂志，2003，34（12）：618-620），这极大地制约了其临床疗效的发挥。近年来，有关灯盏乙素的体内代谢研究表明，野黄芩素为灯盏乙素的主要代谢产物（Planta Med 2007, 73: 363-365），而且，野黄芩素比灯盏乙素具有更高的生物利用度（中国药学杂志，2007，42（18）：1418-1421）。因此，野黄芩素的研究、开发与利用受到了人们的关注。当前，仅在少数几种植物中发现有天然的野黄芩素存在，而且含量极低，因此，试图从植物中提取获得大量的野黄芩素是不现实的。为了大量制备野黄芩素，以往通常采用酸性条件下水解灯盏乙素获得，但酸水解法反应条件不易控制，转化率低，同时会对环境造成污染，应用范围受到限制。
发明内容
本发明为了解决现有技术存在的反应条件不易控制、转化率低、环境污染严重等技术问题，提供了一种条件温和、利于环保、适合工业化生产的制备野黄芩素的方法。
本发明的技术解决方案是：一种利用黑曲霉水解灯盏乙素制备野黄芩素的方法，利用黑曲霉水解灯盏乙素葡萄糖醛酸基，制备野黄芩素。即利用黑曲霉（Aspergillus niger AS 3.795）对底物灯盏乙素进行生物转化，利用乙酸乙酯对发酵液中的转化产物进行萃取，并利用D101大孔吸附树脂柱色谱和重结晶对转化产物进行纯化。
具体步骤如下：
a）土豆液体培养基的配制：取新鲜土豆，去皮，切成2cm3小块，加入5倍量水煮沸，保持沸腾状态30分钟，用纱布过滤残渣，滤液加水定容（每200克土豆配制1升培养液），定容后加入2%葡萄糖。将配好的培养液进行分装，250mL的锥形瓶可装入60mL培养液，500mL锥形瓶可装入200mL培养液。用纱布及牛皮纸将瓶口封好，放入高压灭菌锅中灭菌。灭菌条件为115oC灭菌30min。
b）微生物的培养：将黑曲霉（Aspergillus niger AS 3.795）从PDA固体培养基上接种至上述配制好的土豆液体培养基中，置于摇床中于160rpm，26oC条件下培养两天。
c）加入底物：将底物灯盏乙素用适量乙醇溶解，配成5.0mg/mL的乙醇溶液。加入到已培养两天的微生物发酵液中，在相同条件下继续培养四天。
d）发酵液的处理：发酵液抽滤后收集滤液，减压条件下低温浓缩至小体积，用等体积乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并浓缩至干，获得粗浸膏。
e）转化产物的分离纯化：将步骤d）得到的粗浸膏利用D101大孔吸附树脂柱色谱进行分离，分别用50%、60%和95%乙醇水溶液洗脱，得到Ql-1、Ql-2和Ql-3三个流分，Ql-2在60%乙醇水溶液中反复重结晶，得到转化产物野黄芩素。其纯度经高效液相色谱检测达到99%以上。
该转化产物具有以下理化数据：yellow amorphous powder；UV λMeOH maxnm：281，336；FeCl3显色呈阳性；ESI-MS m/z：285[M-H]-；1H-NMR (DMSO-d 6) δ: 6.73 (1H, s, H-3), 6.56 (1H, s, H-8), 7.90 (2H, d, J=8.6 Hz, H-2’, 6’), 6.91 (2H, d, J=8.6 Hz, H-3’, 5’), 12.78 (1H, s, 5-OH). 13C-NMR(DMSO-d 6) δ: 163.6(C-2), 102.4(C-3), 182.1(C-4), 147.1(C-5), 129.2(C-6), 153.4(C-7), 93.9(C-8), 149.7(C-9), 104.1(C-10), 121.6(C-1’), 128.4(C-2’,6’), 116.0(C-3’,5’), 161.1(C-4’)。
本发明是利用黑曲霉水解灯盏乙素葡萄糖醛酸基，制备野黄芩素。克服了现有技术存在的反应条件不易控制、转化率低、环境污染严重等技术问题，提供了一种条件温和、利于环保、适合工业化生产的制备野黄芩素的方法。
具体实施方式
本发明可以通过下面两个实施例比较加以说明。
实施例1：通过酸水解法制备野黄芩素（周荣光，野黄芩素的制备、纯化与结构表征。光谱实验室，2011,28（5）：2402-2406）
称取灯盏乙素15.0g于1000mL圆底烧瓶中，加入100mL乙二醇、100mL水和10mL浓盐酸，于90℃加热搅拌反应5 h。TLC方法监测反应进程，反应结束后，向反应瓶中加入500mL水，有大量沉淀析出，室温静置8 h后，过滤，过滤物水洗至中性，置60℃真空干燥箱中干燥48 h，得野黄芩素粗品7.3 g。
将上述野黄芩素粗品溶于适量甲醇中，用20g硅胶（100-140目）拌样，通风橱中挥去溶剂。然后，利用硅胶柱色谱（100cm×4cm；柱床硅胶100g，200-300目）对其进行纯化，先后用乙酸乙酯、乙酸乙酯-丙酮（4∶1，V/V）洗脱。收集乙酸乙酯-丙酮（4∶1，V/V）段洗脱液组分，减压回收溶剂后，用70%甲醇-水溶液重结晶，得到浅黄色晶体5.8g，转化率为62.5%。其纯度经高效液相色谱检测达到98%。
实施例2：通过黑曲霉制备野黄芩素
a）土豆液体培养基的配制：取新鲜土豆2kg，去皮，切成2cm3小块，加入10L水煮沸，保持沸腾状态30分钟，用纱布过滤残渣，滤液加水定容至10L，定容后加入200g葡萄糖。将配好的培养液分装至500mL的锥形瓶中，每瓶装200mL培养液，大约可分装50瓶。将上述50瓶培养液用纱布及牛皮纸将瓶口封好，分批放入高压灭菌锅中灭菌。灭菌条件为115oC灭菌30min。
b）微生物的培养：将黑曲霉（Aspergillus niger AS 3.795）从PDA固体培养基上接种至上述配制好的土豆液体培养基中，置于摇床中于160rpm，26oC条件下培养两天。
c）加入底物：将1g灯盏乙素用200mL乙醇溶解，配成5.0mg/mL的乙醇溶液，将该溶液加入到步骤b）所述的发酵液中，每瓶发酵液加入4ml，然后在相同条件下继续培养四天。
d）发酵液的处理：发酵液抽滤后收集滤液，减压条件下低温浓缩至4-5L，用等体积乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并浓缩至干，获得粗浸膏2.1g。
e）转化产物的分离纯化：将步骤d）得到的粗浸膏利用D101大孔吸附树脂柱色谱进行分离，分别用50%、60%和95%乙醇水溶液洗脱，得到Ql-1、Ql-2和Ql-3三个流分，Ql-2在60%乙醇水溶液中反复重结晶，得到转化产物野黄芩素480mg，转化率为77.5%。其纯度经高效液相色谱检测达到99%以上。
Claims (3)
1.一种利用黑曲霉水解灯盏乙素制备野黄芩素的方法，其特征在于：利用黑曲霉对底物灯盏乙素进行生物转化，利用乙酸乙酯对发酵液中的转化产物进行萃取，并利用D101大孔吸附树脂柱色谱和重结晶对转化产物进行纯化，其具体的试验方法为：
a）土豆液体培养基的配制；
b）微生物的培养：将黑曲霉从PDA固体培养基上接种至上述配制好的土豆液体培养基中，置于摇床中于160rpm，26oC条件下培养两天；
c）加入底物：将1g灯盏乙素用200mL乙醇溶解，配成5.0mg/mL的乙醇溶液，将该溶液加入到步骤b）所述的发酵液中，每瓶发酵液加入4ml，然后在相同条件下继续培养四天；
d）发酵液的处理：发酵液抽滤后收集滤液，减压条件下低温浓缩，用等体积乙酸乙酯萃取，萃取液合并浓缩至干，获得粗浸膏；
e）转化产物的分离纯化：将步骤d）得到的粗浸膏利用D101大孔吸附树脂柱色谱进行分离，分别用50%、60%和95%乙醇水溶液洗脱，得到Ql-1、Ql-2和Ql-3三个流分，Ql-2在60%乙醇水溶液中反复重结晶，得到转化产物野黄芩素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：转化产物为（1）所示的野黄芩素
。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所制得的转化产物，其纯度可达到99%以上，转化率为77.5%。
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| 灯盏乙素和葛根素的微生物转化研究;丁雅光;《中国优秀硕士学位论文全文数据库-黑龙江中医药大学》;20130131;39 * |
| 灯盏花的生物转化及产物活性初步研究;戴德标;《万方学位论文-云南中医学院》;20090429;10 * |
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