CN113004297A

CN113004297A - 二萜生物碱类化合物及其提取方法和应用

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Publication number: CN113004297A
Application number: CN202110249356.9A
Authority: CN
Inventors: 陈丽霞; 李华; 孙德娟; 王亚丽; 陈彦梅
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2021-03-08
Filing date: 2021-03-08
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2041-03-08
Also published as: CN113004297B

Abstract

二萜生物碱类化合物及其提取方法和应用，属于中药提取领域，具体涉及翠雀中分离的一类二萜生物碱类化合物及其提取方法和其在制备心肌保护的药物中的应用。本发明中二萜生物碱类化合物可以抑制H₂O₂诱导的大鼠心肌细胞中活性氧的产生，升高线粒体膜电位，抑制细胞凋亡，可以通过AMPK/Akt/mTOR信号通路抑制心肌细胞死亡，从而对H₂O₂诱导的大鼠心肌细胞损伤发挥保护作用。用于制备预防和治疗心肌细胞损伤药物。

Description

二萜生物碱类化合物及其提取方法和应用

技术领域

本发明属于中药提取领域，具体涉及翠雀中分离的一类二萜生物碱类化合物及其提取方法和在制备心肌保护的药物中的应用。

背景技术

翠雀(Delphinium grandiflorum L.)为毛茛科翠雀属草本植物，生于山坡、草地，分布于云南、山西、河北、宁夏、内蒙古、东北等地。民间多用于根治风热牙痛，疥癣，头虱等。该植物中富含大量的二萜生物碱，二萜生物碱不仅是它们的有效成分和毒性成分，也是其特征的化学成分，大都具有显著的生理活性(Chen N.H.,Zhang Y B,Li W,Li P,Chen L F,Li Y L,Li G Q,Wang G C.Grandiflodines A and B,two novel diterpenoid alkaloidsfrom Delphinium grandiflorum[J].RSC Advances,2017,7:24129-24132.)。国内外学者通过体内、体外实验证实了二萜生物碱的抗炎镇痛(Nesterova Y V,Poveteva T N,Nagornyak Y G,Andreeva T I,Suslov N I.Effects of bioactive substances fromTall delphinium on the development of acute inflammation of different genesis[J].Bulletin of Experimental Biology&Medicine,2008,145(6):724-727.)，抗肿瘤(Hazawa M,Wada K,Takahashi K,Mori T,Kawahara N,Kashiwakura I.Suppressiveeffects of novel derivatives prepared from Aconitum alkaloids on tumor growth[J].Investigational New Drugs,2009,27(2):111-119.)，抗菌(

B,Orhan I,

B.Diterpenoid alkaloids from some Turkish Consolida species and theirantiviral activities[J].Arkivoc,2007,265–272.)，抗氧化(Yin T P,Cai L,Xing Y,YuJ,Li X J,Mei R F，Ding Z T.Alkaloids with antioxidant activities from Aconitumhandelianum[J].Journal of Asian Natural Products Research,2016,18(6),603-610.)，以及心肌保护(Jian X X,Tang P,Liu X X,Chao R B,Chen Q H,She X K,Chen DL,Wang F P,Structure-Cardiac activity relationship of C19-diterpenoidalkaloids[J].Natural Product Communications,2012,7,713.)等作用。为了将翠雀的药用价值发挥到最大，对翠雀地上部分进行了系统的成分研究，提取了新的二萜生物碱类化合物，利用核磁、红外、质谱等手段对化合物的结构进行了确证，并检测其对H₂O₂诱导大鼠心肌细胞(H9C2)损伤的保护作用。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种二萜生物碱类化合物。

本发明的第二个目的是提供一种二萜生物碱类化合物的提取方法。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述二萜生物碱类化合物的药物组合物。

本发明的第四个目的是提供二萜生物碱类化合物或该化合物的异构体、该化合物在药学上可接受的盐或包含该化合物的药物组合物用于制备预防和治疗心肌细胞损伤药物的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种二萜生物碱类化合物，其为如通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或该化合物的异构体、或该化合物在药学上可接受的盐。

所述的通式(I)、(II)及式(III)分别为：

其中：

R₁为H、OH、OMe或＝O；

R₂为H、OH、OMe、OAc或＝O；

R₃为OH、OMe或OAc；

R₄为H、OH或OMe；

R₅为H或＝O；

R₆为Me、CHO或COOH。

进一步的，一种二萜生物碱类化合物，其为结构式1～3所示的化合物中的任一种或该化合物的异构体、或该化合物在药学上可接受的盐。

所述的异构体包括但不限于：立体异构体、几何异构体和互变异构体。

所述的在药学上可接受的盐，是指所述二萜生物碱类化合物的有机盐和无机盐，包括但并不限于：钠盐、钾盐、氨盐、硫酸盐和盐酸盐。

本发明还提供了所述的二萜生物碱类化合物1～3的提取方法，包括如下步骤：

(1)以翠雀干燥全草为原料，加入原料1～5质量倍的体积浓度75％～95％乙醇水溶液，室温浸泡3～5次，每次5～10天，用以提取原料中含有的二萜生物碱类化合物；浸泡液过滤，合并滤液，减压回收溶剂，浓缩后得到含有的二萜生物碱类化合物的总浸膏；其中，所述的原料1～5质量倍，具体指，乙醇水溶液与原料的体积质量比以mL/g计为(1～5):1；

(2)将总浸膏分散到5～10质量倍的水中形成混悬液，加酸调节其pH至2～4，依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取去除部分杂质，然后加碱调节其pH至9～11，用二氯甲烷进行萃取，萃取液减压回收溶剂，得到二氯甲烷层浸膏；

(3)将二氯甲烷层浸膏经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1～0:1的二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集合并体积比为30:1和20:1的馏分，记为D1；

(4)馏分D1浓缩，硅胶柱色谱分离，经制备型液相色谱纯化，分别得到化合物1、2和3。

上述提取方法，其中：

所述步骤(4)中，

馏分D1浓缩后经硅胶柱色谱分离，以体积比为20:1:0.1～3:1:0.1的石油醚-丙酮-二乙胺或石油醚-丙酮-三乙胺为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为7:1:0.1的馏分，记为D2；

馏分D2浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积浓度为50％～70％的甲醇水溶液为流动相，进行分离，得到馏分D3；

馏分D3浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积浓度为50％～60％的甲醇水溶液为流动相，进行分离，得到馏分D4、D5、D6；

馏分D4浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积浓度为40％～50％的甲醇水溶液为流动相，进行纯化，得到化合物2；

馏分D5浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积浓度为20％～30％的甲醇水溶液为流动相，进行纯化，得到化合物1；

馏分D6浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积浓度为30％～50％的甲醇水溶液为流动相，进行纯化，得到化合物3。

一种药物组合物，其包括所述的二萜生物碱类化合物、该化合物的异构体及该化合物在药学上可接受的盐中的一种或多种；还包括药学上可接受的载体、赋形剂及稀释剂中的一种或它们的组合。所述药物组合物的给药途径为口服或注射给药，剂型包括：片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂及针剂。

本发明还提供了所述的二萜生物碱类化合物或该化合物的异构体、该化合物在药学上可接受的盐或包含该化合物的药物组合物在制备预防和治疗心肌细胞损伤药物中的应用。

本发明中二萜生物碱类化合物可以抑制H₂O₂诱导的大鼠心肌细胞(H9C2)中活性氧的产生，升高线粒体膜电位，抑制细胞凋亡，可以通过AMPK/Akt/mTOR信号通路抑制心肌细胞死亡，从而对H₂O₂诱导的大鼠心肌细胞(H9C2)损伤发挥保护作用。

本发明的优点：

本发明的二萜生物碱类化合物、异构体或其药学上可接受的盐或包含该化合物的药物组合物对H₂O₂诱导大鼠心肌细胞(H9C2)损伤具有保护作用，用于制备预防和治疗心肌细胞损伤药物。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行进一步的描述。

实施例1

二萜生物碱类化合物1～3的提取方法，包括如下步骤：

(1)以总干重2.5kg翠雀干燥全草为原料，加入原料4质量倍的体积浓度为95％的乙醇水溶液(10L)，室温浸泡4次，每次7天。浸泡液过滤合并滤液，减压回收溶剂，浓缩后得到430g含有的二萜生物碱类化合物的总浸膏；

(2)将总浸膏分散到10质量倍的水(4.3L)中形成混悬液，用盐酸溶液调节其pH至2，依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，然后用氨水溶液调节其pH至9，用二氯甲烷进行萃取，二氯甲烷萃取液减压回收溶剂，得到25g二氯甲烷层浸膏；

(3)二氯甲烷层浸膏经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集合并体积比为30:1和20:1的馏分，记为D1；

(4)馏分D1浓缩得4.5g浓缩物，硅胶柱色谱分离，经制备型液相色谱纯化，分别得到化合物1、2和3。具体步骤：

4.5g浓缩物经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为20:1:0.1、10:1:0.1、9:1:0.1、7:1:0.1、5:1:0.1、3:1:0.1的石油醚-丙酮-二乙胺为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为7:1:0.1的馏分，记为D2；

馏分D2浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积浓度为65％的甲醇水溶液为流动相，进行分离，得到馏分D3；

馏分D3浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积浓度为55％的甲醇水溶液为流动相，进行分离，得到馏分D4、D5、D6；

馏分D4浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积浓度为45％的甲醇水溶液为流动相，进行纯化，得到37mg化合物2；

馏分D5浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积浓度为25％的甲醇水溶液为流动相，进行纯化，得到14.5mg化合物1；

馏分D6浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积浓度为40％的甲醇水溶液为流动相，进行纯化，得到2.4mg化合物3。

对提取到的二萜生物碱类化合物1～3进行结构鉴定，具体物理化学数据如下：

化合物1：无色针状晶体，

(c 0.10，MeOH)；IR(KBr)ν_max：3475，2928，2850，1676，1465，1367，1089cm^-1；HR-ESI-MS(positive)m/z498.2706[M+H]⁺(calcd forC₂₅H₄₀NO₉，498.2703)；分子式C₂₅H₃₉NO₉；¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)和¹³C-NMR(150MHz，CDCl₃)，数据如表1所示。

化合物2：白色无定型粉末，

(c 0.11，MeOH)；IR(KBr)ν_max：3396，2923，2850，1647，1468，1377，1090，1038cm^-1；HR-ESI-MS(positive)m/z498.2703[M+H]⁺(calcdfor C₂₅H₄₀NO₉，498.2703)；分子式C₂₅H₃₉NO₉；¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)和¹³C-NMR(150MHz，CDCl₃)，数据如表2所示。

化合物3：白色无定型粉末，

(c 0.30，MeOH)；HR-ESI-MS(negative)m/z482.2398[M-H]^-(calcd for C₂₄H₃₆NO₉，482.2396)；分子式C₂₄H₃₇NO₉；¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)和¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)，数据如表3所示。

表1化合物1的碳谱和氢谱数据

表2化合物2的碳谱和氢谱数据

表3化合物3的碳谱和氢谱数据

通过理化数据和现代波谱学手段(HRESIMS和NMR)，结合公开文献相关数据，鉴定化合物的结构，确定化合物1，2和3均为未见文献报道的新化合物。

实施例2

二萜生物碱类化合物1～3的提取方法，包括如下步骤：

(1)以总干重2kg翠雀干燥全草为原料，加入原料5质量倍的体积浓度为75％的乙醇水溶液(10L)，室温浸泡5次，每次5天。浸泡液过滤合并滤液，减压回收溶剂，浓缩后得到344g含有的二萜生物碱类化合物的总浸膏；

(2)将总浸膏分散到8质量倍的水(2.75L)中形成混悬液，用盐酸溶液调节其pH至3，依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，然后用氨水溶液调节其pH至9，用二氯甲烷进行萃取，二氯甲烷萃取液减压回收溶剂，得到20.6g二氯甲烷层浸膏；

(3)二氯甲烷层浸膏经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集合并体积比为30:1和20:1的馏分，记为D1；

(4)馏分D1浓缩后得4.12g浓缩物，硅胶柱色谱分离，经制备型液相色谱纯化，分别得到33mg化合物1、13.3mg化合物2和2.3mg化合物3；具体分离纯化过程同实施例1。

实施例3

二萜生物碱类化合物1～3的提取方法，包括如下步骤：

(1)以总干重2kg翠雀干燥全草为原料，加入原料3质量倍的体积浓度为85％的乙醇水溶液(6L)，室温浸泡3次，每次10天。浸泡液过滤合并滤液，减压回收溶剂，浓缩后得到338g含有的二萜生物碱类化合物的总浸膏；

(2)将总浸膏分散到10质量倍的水(3.4L)中形成混悬液，用盐酸溶液调节其pH至4，依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，然后用氨水溶液调节其pH至11，用二氯甲烷进行萃取，二氯甲烷萃取液减压回收溶剂，得到20.9g二氯甲烷层浸膏；

(4)馏分D1浓缩后得3.9g浓缩物，硅胶柱色谱分离，经制备型液相色谱纯化，分别得到32.1mg化合物1、11.7mg化合物2和2.1mg化合物3；具体分离纯化过程同实施例1。

上述提取到的二萜生物碱类化合物1～3对H₂O₂诱导H9C2损伤模型的保护作用的研究，具体为：

1.细胞培养

大鼠心肌细胞(H9C2)培养于含10％FBS(Gibco)的DMEM培养基(Gibco)中，37℃，5％CO₂的恒温培养箱中孵育生长。

2.CCK8法检测细胞存活率

(1)实验分组：模型对照组(1mM的H₂O₂)、实验组(50μM的二萜生物碱类化合物1～3+1mM的H₂O₂)、空白对照组(不含细胞，其他过程同实验组)。每组均设3个复孔。

(2)实验步骤：

1)取对数生长期的H9C2细胞，胰蛋白酶消化，以8000个/孔接种于96孔板，置于37℃，5％CO₂，培养24h。

2)用10％FBS的DMEM培养液稀释化合物配成终浓度50μM的处理液。

3)弃掉培养基，实验组加入上述处理液，培养24h。

4)实验组和模型对照组分别加含1mM H₂O₂的DMEM，培养1h。

5)弃掉培养基，每孔均加入100μL的含0.5mg/mLCCK8的培养基，培养1h后，酶标仪检测450nm处各孔的OD值并计算存活率。

如表4所示，实验结果表明，二萜生物碱化合物1～3能够使细胞存活率增加，具有较好的心肌保护作用。

表4二萜生物碱化合物1～3对H₂O₂诱导H9C2损伤模型的保护作用

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。

Claims

1.一种二萜生物碱类化合物，其特征在于，其为如下通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或该化合物的异构体、或该化合物在药学上可接受的盐；

其中：

R₁为H、OH、OMe或＝O；

R₂为H、OH、OMe、OAc或＝O；

R₃为OH、OMe或OAc；

R₄为H、OH或OMe；

R₅为H或＝O；

R₆为Me、CHO或COOH。

2.根据权利要求1所述的二萜生物碱类化合物，其特征在于，其为如下结构式1～3所示的化合物中的任一种或该化合物的异构体、或该化合物在药学上可接受的盐；

3.权利要求2所述的二萜生物碱类化合物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以翠雀干燥全草为原料，加入原料1～5质量倍的体积浓度75％～95％乙醇水溶液，室温浸泡3～5次，每次5～10天，用以提取原料中含有的二萜生物碱类化合物；浸泡液过滤，合并滤液，减压回收溶剂，浓缩后得到含有的二萜生物碱类化合物的总浸膏；

(4)馏分D1浓缩，经硅胶柱色谱分离，制备型液相色谱纯化，分别得到化合物1、2和3。

4.根据权利要求3所述的二萜生物碱类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(4)中对馏分D1的具体分离和纯化过程为：

馏分D1浓缩后经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为20:1:0.1～3:1:0.1的石油醚-丙酮-二乙胺或石油醚-丙酮-三乙胺为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为7:1:0.1的馏分，记为D2；

5.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～2任一项所述的二萜生物碱类化合物、该化合物的异构体、该化合物在药学上可接受的盐中的一种或多种；还包括药学上可接受的载体、赋形剂及稀释剂中的一种或它们的组合；所述药物组合物的给药途径为口服或注射给药，剂型包括：片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂及针剂。

6.一种二萜生物碱类化合物或药物组合物的应用，其特征在于，所述二萜生物碱类化合物为权利要求1～2任一项所述的二萜生物碱类化合物；所述药物组合物为权利要求5所述的药物组合物；应用于预防和治疗心肌细胞损伤的药物。