CN108456168A - 一类结构新颖的c19二萜生物碱及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了式Ⅰ所示的化合物、或其光学异构体、或其药学上可接受的盐、或其晶型、或其溶剂合物。药效实验表明，本发明化合物对神经细胞具有较好的保护作用，能有效抑制氧化应激对神经细胞造成的损伤，抑制神经细胞凋亡，效果显著，且无明显的细胞毒性，安全性高，是一种潜在的防治帕金森病等神经退行性疾病的药物。本发明化合物可以从乌头属植物中提取分离得到，药物来源广泛，具有广阔的临床应用前景及市场前景。

Description

一类结构新颖的C19二萜生物碱及其用途
技术领域
本发明涉及一类结构新颖的C19二萜生物碱及其用途，属于医药领域。
背景技术
神经退行性疾病是由神经元和(或)其髓鞘的丧失所致，随着时间的推移而恶化，以致出现功能障碍。临床上常见的有阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)等。这类疾病的脑病理改变主要为细胞凋亡引起的大量神经元丢失，或者神经系统没有明显细胞胞体数量减少，但神经细胞出现结构和功能的进行性、退行性变性。随着我国老年人口的不断增加，神经退行性疾病的发病率也逐年提高。然而，目前仅有为数不多的几种药物可用于神经退行性疾病的治疗。
大量研究表明，神经退行性疾病的发生和发展是涉及较为复杂的病理过程，与神经组织的氧化应激、线粒体功能障碍、细胞凋亡等因素密切相关。氧化应激是由于超氧阴离子(O2-·)等自由基过度产生和(或)得不到及时清除，致使机体的细胞和组织被损伤；在神经退行性疾病如AD、PD、ALS中均发现有神经组织的氧化损伤。此外，神经退行性疾病患者的神经元减少、认知功能降低多由于神经细胞凋亡所致；研究发现，AD患者脑中细胞凋亡速率是正常对照组的50多倍。
由于神经退行性疾病的病理机制复杂，现有的治疗手段非常有限。目前临床上对于PD均采用对症治疗，尚无有效的方法能够恢复变性神经元；对于AD的治疗，迄今FDA仅批准了5种对症治疗药物，影响疾病进程的药物还处于初步研究阶段。不仅如此，神经退行性疾病治疗药物大多具有明显的副作用，比如，作为PD治疗基础用药的左旋多巴会出现症状波动、开关现象以及运动障碍等不良反应，限制其广泛使用。因此，亟需开发出对神经退行性疾病疗效确切且安全性良好的治疗药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一类结构新颖的C19二萜生物碱及其用途。
本发明公开了式Ⅰ所示的化合物、或其光学异构体、或其药学上可接受的盐、或其晶型、或其溶剂合物：
其中，R1、R2、R3独立选自氢、C1～C6烷基、C1～C6烷酰基或式Ⅱ所示的取代基：
X、Y独立选自-O-或-NH-，R4为C1～C6烷基，R5为氢、C1～C6烷基或C1～C6烷酰基，A、B独立选择自5元或6元芳基。
进一步地，所述C1～C6烷基为未被取代或卤素取代的烷基。
进一步地，所述C1～C6烷酰基为未被取代或苯基取代的烷酰基。
进一步地，R1、R2、R3独立选自氢、甲基、乙基、苯甲酰基、乙酰基、异丁酰基或式Ⅱ所示的取代基。
进一步地，R1、R2、R3中仅1个为式Ⅱ所示的取代基。
进一步地，R3为式Ⅱ所示的取代基。
进一步地，R4为甲基、乙基、正丙基或异丙基，R5为氢、甲基、乙基、苯甲酰基、乙酰基或异丁酰基。
进一步地，A、B独立选择自苯基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基或吡嗪基。
进一步地，式Ⅱ所示的取代基为：
其中，R6～R13独立选自氢、卤素、C1～C6烷基或C1～C6烷氧基。
进一步地，所述C1～C6烷氧基为未被取代或卤素取代的烷氧基。
进一步地，R6～R13独立选自氢、氟、氯、溴、甲基、三氟甲基、甲氧基或三氟甲氧基。
进一步地，所述化合物选自：
本发明提供了一种所述化合物的制备方法，包括如下步骤：
a、取毛茛科乌头属植物，乙醇提取，浓缩提取液得到浸膏；
b、浸膏用水溶解，调节pH值至2.8～3.5，用石油醚、乙酸乙酯萃取；
c、将水溶液的pH值调节至9.4～10.0，用二氯甲烷萃取，浓缩二氯甲烷萃取液，得到总生物碱；
d、总生物碱利用正相硅胶柱层析，由CH2Cl2：CH3OH(1:0-0:1)进行梯度洗脱，收集洗脱条件CH2Cl2：CH3OH(25:1)的洗脱液记为A7部分，洗脱条件CH2Cl2：CH3OH(15:1)的洗脱液记为A8部分；
e、A7部分经过正相硅胶柱层析进一步分离纯化，由CH2Cl2：CH3OH(30:1-0:1)进行梯度洗脱，以CH2Cl2：CH3OH(9:1)为展开剂，收集Rf值为0.70的组分得到化合物2，收集Rf值为0.65的组分得到化合物3；
f、A8部分经过正相硅胶柱层析进一步分离纯化，由CH2Cl2：CH3OH(20:1-0:1)进行梯度洗脱，以CH2Cl2：CH3OH(9:1)为展开剂，收集Rf值为0.62的组分得到化合物1、收集Rf值为0.58的组分得到化合物4，收集Rf值为0.52的组分得到化合物5。
进一步地，a步骤提取原料为空茎乌头Aconitum apetalum.块根，乙醇提取条件为：用95％乙醇提取四次，每次浸泡4天；b步骤用10％w/w盐酸水溶液调pH值至3.0；c步骤用24％w/w氨水调pH值至9.4。
本发明提供了所述化合物、或其光学异构体、或其药学上可接受的盐、或其晶型、或其溶剂合物在制备治疗和/或预防神经退行性疾病的药物中的用途。
进一步地，所述的药物是治疗和/或预防帕金森病、阿尔茨海默病的药物。
本发明提供了所述化合物、或其光学异构体、或其药学上可接受的盐、或其晶型、或其溶剂合物在制备保护神经细胞的药物中的用途。
进一步地，所述的药物是抑制氧化损伤的药物。
进一步地，所述的药物是抑制细胞凋亡的药物。
进一步地，所述的神经细胞为SH-SY5Y细胞。
本发明提供了一种防治神经退行性疾病的药物组合物，它是以所述化合物、或其光学异构体、或其药学上可接受的盐、或其晶型、或其溶剂合物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
术语的定义：
碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀Ca～Cb烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，C1～C6烷基是指包含1～6个碳原子的烷基。
术语“烷基”是直链或支链的饱和烃基的基团。C1～C6烷基的实例包括甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、异丙基(C3)、正丁基(C4)、叔丁基(C4)、仲丁基(C4)、异丁基(C4)、正戊基(C5)、3-戊基(C5)、戊基(C5)、新戊基(C5)、3-甲基-2-丁基(C5)、叔戊基(C5)和正己基(C6)。除非另外指明，否则烷基的每种情况独立地任选被取代，即未被取代或被一个或多个取代基取代。“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。在一些实施方案中，所述C1～C6烷基是被卤素(氟、氯、溴、碘)取代的C1～C6烷基。在C1～C6烷基被取代基取代的情况中，不将取代基的碳原子数计算在内。
术语“烷氧基”是指基团-OR，其中R是被取代或未被取代的烷基。C1～C6烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基和1,2-二甲基丁氧基。在一些实施方案中，R是被卤基(氟、氯、溴、碘)取代的烷基。所述C1～C6烷氧基在R被取代基取代的情况中，不将取代基的碳原子数计算在内。
术语“芳基”是指在芳族环系中包含或不包含杂原子的4n+2芳族环系的基团，其中杂原子独立地选自氮、氧和硫。除非另外指明，否则芳基的每种情况独立地任选被取代，即未被取代或被一个或多个取代基取代。
术语“烷酰基”是指基团-C(O)R，其中R是氢、如本文所定义的被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的芳基。C1～C6烷酰基的实例包括(但不限于)甲酰基(-CHO)、乙酰基(-C(＝O)CH3)、苯甲酰基(-C(＝O)Ph)、苄基羰基(-C(＝O)CH2Ph)等。在某些实施方案中，R是被卤基(氟、氯、溴、碘)取代的烷基。所述C1～C6烷酰基在R被取代基取代的情况中，不将取代基的碳原子数计算在内。
术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。
术语“药学上可接受的盐”是指上述化合物或其立体异构体，与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物，或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。本发明中所述盐可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。
术语“光学异构体”包括立体中心(例如带有4个不同取代基的碳)、轴不对称例如有关键、平面不对称及其混合物的存在。
“溶剂合物”是指通常通过溶剂分解反应与溶剂或水缔合的化合物形式(也称为“水合物”)。这种物理缔合包括氢键键合。常规的溶剂包括水、乙醇、乙酸等。本发明化合物可例如以结晶形式制备并且可为溶剂化或水合的。合适的溶剂化物包括药学上可接受的溶剂化物，例如水合物，并且还包括化学计量的溶剂化物和非化学计量的溶剂化物。在某些情况下，例如当一个或多个溶剂分子并入结晶固体的晶格中时，溶剂化物将能够分离。“溶剂合物”涵盖溶液相和可分离的溶剂化物。代表性溶剂化物包括水合物、乙醇化物和甲醇化物。
本发明的某些实施方式中，本发明包括了同位素标记的化合物，所述同位素标记化合物是指与本文中所列化合物相同，但是其中的一个或多个原子被另一个原子取代，该原子的原子质量或质量数不同于自然界中常见的原子质量或质量数。可以引入本发明化合物中的同位素包括氢、碳、氮、氧、硫，即2H,3H、13C、14C、15N、17O、18O、35S。含有上述同位素和/或其它原子同位素的本发明化合物及其立体异构体，以及该化合物、立体异构体的可药用的盐均应包含在本发明范围之内。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明所述药学上可接受的辅料，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质。
本发明所述药学上可接受的辅助性成分，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述药物组合物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明药物组合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。
本发明提供了一类结构新颖的C19二萜生物碱。药效实验表明，本发明化合物对神经细胞具有较好的保护作用，能有效抑制氧化应激对神经细胞造成的损伤，抑制神经细胞凋亡，效果显著，且无明显的细胞毒性，安全性高，是一种潜在的防治帕金森病等神经退行性疾病的药物。本发明化合物可以从乌头属植物中提取分离得到，药物来源广泛，具有广阔的临床应用前景及市场前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为化合物Apetaldine A高分辨质谱图；
图2为化合物Apetaldine A红外光谱图；
图3为化合物Apetaldine A 1H NMR谱图；
图4为化合物Apetaldine A 13C NMR谱图；
图5为化合物Apetaldine B高分辨质谱图；
图6为化合物Apetaldine B红外光谱图；
图7为化合物Apetaldine B 1H NMR谱图；
图8为化合物Apetaldine B 13C NMR谱图；
图9为化合物Apetaldine C高分辨质谱图；
图10为化合物Apetaldine C红外光谱图；
图11为化合物Apetaldine C 1H NMR谱图；
图12为化合物Apetaldine C 13C NMR谱图；
图13为化合物Apetaldine D高分辨质谱图；
图14为化合物Apetaldine D红外光谱图；
图15为化合物Apetaldine D 1H NMR谱图；
图16为化合物Apetaldine D 13C NMR谱图；
图17为化合物Apetaldine E高分辨质谱图；
图18为化合物Apetaldine E红外光谱图；
图19为化合物Apetaldine E 1H NMR谱图；
图20为化合物Apetaldine E 13C NMR谱图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1本发明化合物的制备
取毛茛科乌头属植物空茎乌头Aconitum apetalum.块根4.3kg，在室温条件下，将空茎乌头的干燥根用95％乙醇提取四次，每次浸泡4天，减压浓缩后得到浸膏(360g)。
浸膏用50℃水溶解，先用10％w/w盐酸溶液pH值到3.0，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取。而后水溶液再用24％w/w浓氨水调节pH值到9.4，再用二氯甲烷萃取，减压浓缩二氯甲烷部分得到总的生物碱(40g)。
利用正相硅胶柱层析，由CH2Cl2：CH3OH(1:0-0:1)进行梯度洗脱，通过薄层层析检测，按序合并流份，依次得到八部分：A1(900mg),A2(5.5g),A3(3.2g),A4(4.6g),A5(4.5g),A6(4.3g),A7(1.5g)and A8(4.2g)。
收集洗脱条件CH2Cl2：CH3OH(25:1)洗脱液记为A7部分，A7部分经过正相硅胶柱层析进一步分离纯化，流动相为CH2Cl2：CH3OH(30:1-0:1)，分别得到两种化合物，经NMR、HR-ESIMS、IR等光谱法鉴定二者分别为化合物2(以CH2Cl2：CH3OH(9:1)为展开剂，收集Rf值为0.70的组分，15mg)、化合物3(以CH2Cl2：CH3OH(9:1)为展开剂，收集Rf值为0.65的组分，20mg)。
收集洗脱条件CH2Cl2：CH3OH(15:1)洗脱液记为A8部分，A8部分经过正相硅胶柱层析进一步分离纯化，流动相为CH2Cl2：CH3OH(20:1-0:1)，分别得到三种化合物，经NMR、HR-ESIMS、IR等光谱法鉴定三者分别为化合物1(以CH2Cl2：CH3OH(9:1)为展开剂，收集Rf值为0.62的组分，40mg)、化合物4(以CH2Cl2：CH3OH(9:1)为展开剂，收集Rf值为0.58的组分，18mg)、化合物5(以CH2Cl2：CH3OH(9:1)为展开剂，收集Rf值为0.52的组分，7mg)。
发明人将化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5分别命名为ApetaldineA、Apetaldine B、Apetaldine C、Apetaldine D、Apetaldine E。
以上化合物均为C19型二萜生物碱，经Scifinder检索发现均为未见文献报道的新化合物，其物理化学常数如下：
Apetaldine A，白色无定形粉末，末碘化铋钾反应显阳性。(c 0.25,CHCl3)；IR(KBr)vmax:3408,3305,2924,2852,1688,1697,1666,1581,1519,1264,1093,759cm-1；1H NMR(600MHz,CDCl3)数据见表1；13C NMR(150MHz,CDCl3)数据见表2。HR-ESIMSat m/z 732.3857[M+H]+(calcd.for C41H54N3O9,732.3860)。
Apetaldine B，白色无定形粉末，碘化铋钾反应显阳性。(c 0.50,CHCl3)；IR(KBr)vmax:3445,3300,2968,2929,1740,1689,1665,1581,1519,1439,1262,1093,758cm-1；1H NMR(600MHz,CDCl3)数据见表1；13C NMR(150MHz,CDCl3)数据见表2。HR-ESIMS at m/z 774.3962[M+H]+(calcd.for C43H56N3O10,774.3966)。
Apetaldine C，白色无定形粉末，碘化铋钾反应显阳性。(c 0.50,CHCl3)；IR(KBr)vmax:3446,3300,2924,2854,1741,1689,1581,1439,1263,1093,757cm-1；1HNMR(600MHz,CDCl3)数据见表1；13C NMR(150MHz,CDCl3)数据见表2。HR-ESIMS at m/z788.4127[M+H]+(calcd.for C44H58N3O10,788.4122)。
Apetaldine D，白色无定形粉末，碘化铋钾反应显阳性。(c 0.50,CHCl3)；IR(KBr)vmax:3446,3305,2969,2928,1727,1689,1666,1582,1521,1438,1264,1093,759cm-1；1H NMR(600MHz,CDCl3)数据见表1；13C NMR(150MHz,CDCl3)数据见表2。HR-ESIMS at m/z 816.4073[M+H]+(calcd.for C45H58N3O11,816.4071)。
Apetaldine E，白色无定形粉末，碘化铋钾反应显阳性。(c 0.50,CHCl3)；IR(KBr)vmax:3435,3302,2969,2926,1689,1666,1521,1438,1263,1093,758cm-1；1HNMR(600MHz,CDCl3)数据见表1；13C NMR(150MHz,CDCl3)数据见表2。HR-ESIMS at m/z760.4178[M+H]+(calcd.for C43H58N3O9,760.4173)。
表1：化合物Apetaldine A～E的氢谱数据(600MHz，CDCl3，δH in ppm，J in Hz)
表2：化合物Apetaldine A～E的碳谱数据(150MHz，CDCl3，δH in ppm，J in Hz)
以下通过药效实验证明本发明的有益效果。
实验例1本发明化合物对SH-SY5Y细胞氧化损伤的抑制作用
将冻存于液氮里的SH-SY5Y细胞株取出，迅速置于37℃水浴中振摇，使之融化。取出，移至超净工作台，用75％酒精擦洗消毒，无菌条件下取出细胞悬液，注入消毒离心管，再补充适量的含10％胎牛血清的DMEM完全培养液，1000r/min，离心5min，吸去上清液，再加上述培养液离心1次。SH-SY5Y细胞用含10％胎牛血清的DMEM完全培养液稀释成每1mL含1×105个细胞的细胞悬液，接种于细胞培养瓶中。接种完毕后，将培养瓶置于37℃，5％CO2条件的CO2培养箱中培养。次日更换培养液1次，以后按常规培养，即3d传代1次。
将SH-SY5Y细胞按每1mL含8×105个细胞的浓度接种至96孔板，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h后，细胞生长汇合率达80％左右时，分为空白对照组、模型组，ApetaldineA，Apetaldine B，Apetaldine C，Apetaldine D，Apetaldine E，每个浓度设5个复孔。空白组与模型组加等量培养基，各给药组加浓度为50μM的含药培养基，与细胞一起培养24h后，加入150μmol/L的H2O2建立SH-SY5Y细胞损伤模型(空白对照组除外)。H2O2作用4h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养2h充分进行显色反应，然后吸去原培养液，每孔加入100％DMSO 200μL，待孔内物质完全溶解后，用酶联免疫检测仪测定450nm处的吸光度(OD)值。根据以下公式计算Apetaldine A，Apetaldine B，Apetaldine C，Apetaldine D，ApetaldineE对H2O2致SH-SY5Y细胞氧化损伤的抑制率，结果见表3：
抑制率(％)＝(OD空白对照组-OD本发明药物组)/(OD空白对照组-OD模型组)*100％
表3本发明化合物对SH-SY5Y细胞氧化损伤的抑制率(％)
以上结果表明，经本发明化合物给药后，SH-SY5Y细胞增殖量甚至高于空白对照组，说明其对于SH-SY5Y细胞氧化损伤具有极显著的抑制作用，且无明显的细胞毒性，安全性高。
实验例2本发明化合物对MPP+诱导凋亡SH-SY5Y细胞的保护作用
SH-SY5Y细胞用含10％胎牛血清的Basic DMEM培养基培养，孵育在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中，待细胞生长至适宜密度，胰蛋白酶消化传代。SH-SY5Y细胞消化接种在96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，加入浓度为1.8mM的MPP+和被DMSO溶解的测试样品Apetaldine A，Apetaldine B，Apetaldine C，Apetaldine D，Apetaldine E(给药浓度见表4)，空白对照组仅加PBS对照。每个样品设置三个平行孔，利用自动校正分光光度计通过埃尔曼法测定各样品的抑制活性，计算保护率，检测不同浓度的Apetaldine A，ApetaldineB，Apetaldine C，Apetaldine D，Apetaldine E对SH-SY5Y细胞的保护作用。
相关公式：生存率％＝100％-抑制率％
保护率％＝(生存率本发明药物组-生存率模型组)/生存率模型组*100％
表4本发明化合物对MPP+诱导凋亡SH-SY5Y细胞的保护率(％)
以上结果表明，本发明化合物对受损SH-SY5Y细胞具有显著的保护作用，浓度为50μM时保护率可达到77％。
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)发病率在神经退行性疾病中占第二位。PD患者中脑黑质区多巴胺能神经元丢失导致运动神经元重要神经递质多巴胺合成和释放都急剧下降，使病人出现少动、震颤、强直等运动障碍症状。如何抑制多巴胺能神经元的减少和增加脑内多巴胺含有量是治疗PD的主要方案，而与多巴胺替代治疗相比，保护多巴胺能神经元和减少多巴胺能神经元的凋亡是更加根本性的治疗。
SH-SY5Y细胞具有合成多巴胺和多巴胺受体的特征，1-甲基-4苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridiniumion，MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞凋亡模型已经被广泛应用于研究PD发病的分子机制和药效学评价。
综合以上实验结果，本发明化合物对神经细胞具有较好的保护作用，能有效抑制氧化应激对神经细胞造成的损伤，抑制神经细胞凋亡，效果显著，且无明显的细胞毒性，安全性高，是一种潜在的防治帕金森病等神经退行性疾病的药物。

Claims (21)

1.式Ⅰ所示的化合物、或其光学异构体、或其药学上可接受的盐、或其晶型、或其溶剂合物：
其中，R1、R2、R3独立选自氢、C1～C6烷基、C1～C6烷酰基或式Ⅱ所示的取代基：
X、Y独立选自-O-或-NH-，R4为C1～C6烷基，R5为氢、C1～C6烷基或C1～C6烷酰基，A、B独立选择自5元或6元芳基。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征是：所述C1～C6烷基为未被取代或卤素取代的烷基。
3.如权利要求1所述的化合物，其特征是：所述C1～C6烷酰基为未被取代或苯基取代的烷酰基。
4.如权利要求1所述的化合物，其特征是：R1、R2、R3独立选自氢、甲基、乙基、苯甲酰基、乙酰基、异丁酰基或式Ⅱ所示的取代基。
5.如权利要求1所述的化合物，其特征是：R1、R2、R3中仅1个为式Ⅱ所示的取代基。
6.如权利要求5所述的化合物，其特征是：R3为式Ⅱ所示的取代基。
7.如权利要求1所述的化合物，其特征是：R4为甲基、乙基、正丙基或异丙基，R5为氢、甲基、乙基、苯甲酰基、乙酰基或异丁酰基。
8.如权利要求1所述的化合物，其特征是：A、B独立选择自苯基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基或吡嗪基。
9.如权利要求1所述的化合物，其特征是：式Ⅱ所示的取代基为：
其中，R6～R13独立选自氢、卤素、C1～C6烷基或C1～C6烷氧基。
10.如权利要求9所述的化合物，其特征是：所述C1～C6烷氧基为未被取代或卤素取代的烷氧基。
11.如权利要求9所述的化合物，其特征是：R6～R13独立选自氢、氟、氯、溴、甲基、三氟甲基、甲氧基或三氟甲氧基。
12.如权利要求1所述的化合物，其特征是：所述化合物选自：
13.一种权利要求1～12任意一项所述化合物的制备方法，其特征是：包括如下步骤：
a、取毛茛科乌头属植物，乙醇提取，浓缩提取液得到浸膏；
b、浸膏用水溶解，调节pH值至2.8～3.5，用石油醚、乙酸乙酯萃取；
c、将水溶液的pH值调节至9.4～10.0，用二氯甲烷萃取，浓缩二氯甲烷萃取液，得到总生物碱；
d、总生物碱利用正相硅胶柱层析，由CH2Cl2：CH3OH(1:0-0:1)进行梯度洗脱，收集洗脱条件CH2Cl2：CH3OH(25:1)的洗脱液记为A7部分，洗脱条件CH2Cl2：CH3OH(15:1)的洗脱液记为A8部分；
e、A7部分经过正相硅胶柱层析进一步分离纯化，由CH2Cl2：CH3OH(30:1-0:1)进行梯度洗脱，以CH2Cl2：CH3OH(9:1)为展开剂，收集Rf值为0.70的组分得到化合物2，收集Rf值为0.65的组分得到化合物3；
f、A8部分经过正相硅胶柱层析进一步分离纯化，由CH2Cl2：CH3OH(20:1-0:1)进行梯度洗脱，以CH2Cl2：CH3OH(9:1)为展开剂，收集Rf值为0.62的组分得到化合物1、收集Rf值为0.58的组分得到化合物4，收集Rf值为0.52的组分得到化合物5。
14.如权利要求13所述的制备方法，其特征是：a步骤提取原料为空茎乌头Aconitumapetalum.块根，乙醇提取条件为：用95％乙醇提取四次，每次浸泡4天；b步骤用10％w/w盐酸水溶液调pH值至3.0；c步骤用24％w/w氨水调pH值至9.4。
15.权利要求1～12任意一项所述化合物、或其光学异构体、或其药学上可接受的盐、或其晶型、或其溶剂合物在制备治疗和/或预防神经退行性疾病的药物中的用途。
16.如权利要求15所述的用途，其特征是：所述的药物是治疗和/或预防帕金森病、阿尔茨海默病的药物。
17.权利要求1～12任意一项所述化合物、或其光学异构体、或其药学上可接受的盐、或其晶型、或其溶剂合物在制备保护神经细胞的药物中的用途。
18.如权利要求17所述的用途，其特征是：所述的药物是抑制氧化损伤的药物。
19.如权利要求17所述的用途，其特征是：所述的药物是抑制细胞凋亡的药物。
20.如权利要求17所述的用途，其特征是：所述的神经细胞为SH-SY5Y细胞。
21.一种防治神经退行性疾病的药物组合物，其特征是：它是以权利要求1～12任意一项所述化合物、或其光学异构体、或其药学上可接受的盐、或其晶型、或其溶剂合物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
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