CN110204477A - 一种具有抗氧化作用的二萜生物碱及其在制备药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了来源于厚网地藻Dictyota coriacea的一种具有抗氧化作用的二萜生物碱及其在制备药物中的应用，属于医药领域。本发明所提供的二萜生物碱具有新颖的2‑氮杂螺[4,4]壬烷‑1,3‑二酮骨架，命名为网地藻螺旋胺（dictyospiromide）。细胞实验表明，该化合物为优良的抗氧化剂，对神经细胞氧化损伤具有保护作用，可以预防或治疗脑缺血再灌注损伤。

Description

一种具有抗氧化作用的二萜生物碱及其在制备药物中的应用

技术领域

本发明属于药物领域，具体是指一种从厚网地藻Dictyota coriacea中分离得到的具抗氧化作用的二萜生物碱，以及该化合物在制备用于预防和治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的应用。

背景技术

脑中风是危害人类健康的重大疾病之一，其中缺血性脑中风又占脑中风的80%-85%。目前，溶栓是缺血性脑中风的主要治疗手段，但在恢复血流供应时易引起氧化应激而导致脑缺血再灌注损伤。因此，使用抗氧化剂清除活性氧能起到神经保护作用，是防治脑缺血再灌注损伤的重要策略。

网地藻属（Dictyota）海藻在分类学上属于褐藻门（Phaeophyta），褐藻纲（Phaeophyceae），网地藻目（Dictyotales），网地藻科（Dictyotaceae），主要分布于热带和亚热带沿海海域。网地藻属海藻能够代谢产生大量二萜类次生代谢产物，已报道的化合物数量约200余种。这些化合物往往结构新颖，且生理活性显著，有望从中筛选得到新药先导化合物。因此，网地藻属海藻一直受到天然药物化学家的广泛关注。然而，我国海域的网地藻较少开展化学成分研究，资源尚未得到充分开发利用。

近期，我们从采自温州南麂岛海域的厚网地藻D. coriacea中分离得到一种新颖的二萜生物碱，该化合物具有罕见的2-氮杂螺[4,4]壬烷-1,3-二酮骨架，命名为网地藻螺旋胺（dictyospiromide）。细胞实验发现该化合物能够有效抑制H₂O₂对神经元样PC12细胞产生的氧化损伤，即具有神经细胞保护作用，可用于预防或治疗脑缺血再灌注损伤。基于此，提出本项发明申请。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种具有优良抗氧化作用的二萜生物碱及其在制备药物中的应用。

作为本发明的第一个发明，本发明提供一种具有抗氧化作用的新化合物，其技术方案是二萜生物碱，其特征在于：具有2-氮杂螺[4,4]壬烷-1,3-二酮骨架，命名为网地藻螺旋胺（dictyospiromide），如式（Ⅰ）所示：

式（Ⅰ）。

进一步设置是该二萜生物碱提取自厚网地藻D. coriacea。

作为本发明的第二个方面，提供了一种如式（Ⅰ）所述的二萜生物碱在制备神经保护药物中的应用。

作为本发明的第三个方面，提供了一种如式（Ⅰ）所述的二萜生物碱在制备具有预防或治疗脑缺血再灌注损伤疾病功能药物的应用。

此外，本发明还提供一种具有预防或治疗脑缺血再灌注损伤疾病功能的药物组合物，含有治疗有效量的活性成分和药学上可接受的药用辅料；所述的活性成分包含所述的二萜生物碱或其可药用的盐类衍生物。

进一步设置是所述的活性成分还包括有药学上可接受且已上市的抗氧化药物，该抗氧化药物包括且不限于依达拉奉、维生素C和维生素E中的一种及其组合。

进一步设置是所述的药物组合物具有如下制剂形式：注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂和纳米制剂。

本发明中所述“药用辅料”指药学领域常规的药物载体，例如：粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；稀释剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、甘露醇等，填充剂如淀粉、蔗糖等；湿润剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮和干淀粉等；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如聚山梨酯、脂肪酸山梨坦和脂肪酸甘油酯等；着色剂如二氧化钛、日落黄、亚甲蓝、药用氧化铁红等；润滑剂如氢化植物油、滑石粉和聚乙二醇等。包衣材料如丙烯酸树脂、羟丙甲纤维素、聚维酮、纤维醋法酯等；另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述药物的制剂形式包括注片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、滴剂、滴丸剂及纳米制剂等。本发明可以组合物的形式通过经胃肠道给药，注射给药、呼吸道给药、皮肤给药、粘膜给药和腔道给药等方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。

本发明的有益之处是：提供的从厚网地藻D. coriacea中提取的一种具有神经细胞保护作用的二萜生物碱，可应用于预防或治疗脑缺血再灌注损伤疾病。

具体效果见试验例和实验数据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1化合物dictyospiromide的¹H NMR谱；

图2化合物dictyospiromide的¹³C NMR谱；

图3化合物dictyospiromide的HMQC谱；

图4化合物dictyospiromide的HMBC谱；

图5化合物dictyospiromide的COSY谱；

图6化合物dictyospiromide的NOESY谱；

图7化合物dictyospiromide的HR-ESI-MS谱；

图8化合物dictyospiromide对H₂O₂诱导的神经元样PC12细胞氧化损伤的抑制作用的验证图；

图9化合物dictyospiromide对H₂O₂诱导的神经元样PC12细胞中LDH的泄漏率的影响效果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

本发明实施例中，实施例1化合物dictyospiromide的制备

（1）取厚网地藻D. coriacea 干燥粗粉1.6 kg，用95%乙醇4L室温浸泡提取3次，每次浸泡4 h。合并浸出液并减压浓缩至干，得粗浸膏。将浸膏悬浮于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得乙酸乙酯萃取物43.0 g。将乙酸乙酯萃取物用硅胶柱色谱分离，以石油醚/二氯甲烷（v/v，9/1）、石油醚/乙酸乙酯（v/v，9/1）、石油醚/丙酮（v/v，9/1）、二氯甲烷/乙酸乙酯（v/v，9/1）、二氯甲烷/丙酮（v/v，9/1）、二氯甲烷/甲醇（v/v，9/1）、纯甲醇进行梯度洗脱，共得到7个组分（Fr. A-G）。将组分Fr. D（10.4 g）采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱（二氯甲烷/甲醇，v/v，1/1）分离，以脱色素后的洗脱组分合并，共得到7个组分（Fr. D1~D7）。将组分Fr. D5（5.7 g）采用硅胶柱色谱分离，以石油醚/丙酮（v/v，10/1、8/1、6/1、4/1、3/1）洗脱，TLC分析，合并相似组分，共得到10个组分（Fr.D5-1~D5-10）。其中，组分Fr. D5-6 进一步以ODS柱色谱（甲醇/水，v/v，75/25，85/15，90/10）分离，共得到24个组分（Fr. D5-6-1~ D5-6-24）。将组分Fr. D5-6-11（33.3 mg）以半制备HPLC（78%甲醇）纯化，得到化合物dictyospiromide（5.1 mg）。

（2）半制备HPLC色谱分离条件

仪器：安捷伦1100液相色谱仪配G1314A紫外检测器。

色谱柱：YMC C₁₈柱（250 × 15 mm, 5 μm）。

流动相：甲醇/水（v/v，78/22）；流速：2.0 mL/min; 检测波长：210 nm。

收集保留时间为30.126 min的色谱峰，减压浓缩至干，得到化合物dictyospiromide。

化合物dictyospiromide的核磁共振数据和质谱数据如下：

¹H NMR (Acetone-d ₆, 600 MHz): δ 2.78 (1H, dd, J = 10.2, 7.2 Hz, H-3),4.28 (1H, m, H-4), 2.51 (1H, dd, J = 14.4, 7.8 Hz, H-5a), 1.71 (1H, dd, J =14.4, 4.2 Hz, H-5b), 5.93 (1H, dd, J = 16.8, 10.2 Hz, H-7), 4.97 (1H, d, J =16.8 Hz, H-8a), 4.95 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-8b), 7.33 (1H, s, H-9), 1.84 (1H,m, H-10), 1.38 (1H, m, H-11a), 1.12 (1H, m, H-11b), 1.99 (1H, m, H-12a), 1.83(1H, m, H-12b), 4.99 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-13), 1.55 (3H, s, H-15), 1.62 (3H,s, H-16), 0.97 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-17), 1.00 (3H, s, H-20), 4.19 (2H, q, J= 7.2 Hz, OEt), 1.34 (3H, t, J = 7.2 Hz, OEt), 10.13 (1H, br s, NH), 3.79(1H, d, J = 12.0 Hz, OH); ¹³C NMR (Acetone-d ₆, 150 MHz): δ 109.6 (C-1), 65.4(C-2), 51.1 (C-3), 72.1 (C-4), 46.9 (C-5), 53.2 (C-6), 145.9 (C-7), 111.8 (C-8), 155.4 (C-9), 31.7 (C-10), 34.6 (C-11), 26.3 (C-12), 125.3 (C-13), 131.8(C-14), 17.7 (C-15), 25.8 (C-16), 18.5 (C-17), 182.0 (C-18), 171.8 (C-19),22.1 (C-20), 72.0 (OEt), 15.7 (OEt); HR-ESIMS m/z 376.2479 [M +H]⁺ (C₂₂H₃₄NO₄)。结构解析表明该化合物具有如式（1）所示的化学结构。

实施例2化合物对H₂O₂诱导的神经元样细胞PC12氧化损伤的抑制作用测定

取对数生长期的PC12细胞以3000个细胞/孔接种于96孔培养板，每孔100 µL培养基，在37℃含5% CO₂的培养箱中过夜。每孔加入化合物（0.5、1、2、5 μM）或TBHQ（阳性对照，2 μM）预培养18 h，再给予一定浓度的H₂O₂（450 μM）刺激24 h，最后加入MTT溶液（5 mg/mL）20 µL放入培养箱中继续培养。4 h后吸走各个孔中的液体，加入DMSO（120 µL/孔），振荡混匀10min，用酶联免疫检测仪于490 nm波长处测定其吸光度（A值），DMSO组为空白对照B。计算细胞生存率（实验组A值/对照组B值×100%），本实验重复三次。

实验结果如图8所示，化合物dictyospiromide在0.5、1、2、5 μM浓度条件下，对450μM H₂O₂诱导的PC12细胞氧化损伤均有保护作用，且表现出浓度依赖性。化合物dictyospiromide的细胞保护作用与阳性对照TBHQ相当，能够显著提高细胞存活率，可用于脑缺血再灌注损伤的预防或治疗。

实施例3化合物对H₂O₂诱导的神经元样细胞PC12中LDH泄漏率的测定

乳酸脱氢酶（LDH）普遍存在于各个细胞中，是常见的胞内酶，当细胞膜发生破坏时，LDH会泄露到培养液中，因此LDH泄漏率可以表征细胞膜的完整性及细胞活力。取对数生长期的PC12细胞以5000个细胞/孔接种于96孔培养板，每孔100 µL培养基，在37℃含5% CO₂的培养箱中过夜。每孔加入化合物（0.5、1、2 μM）预培养18 h，再给予一定浓度的H₂O₂（450 μM）刺激24 h。药物刺激完毕后，根据LDH检测试剂盒说明书检测LDH的泄漏率。

实验结果如图9所示，与H₂O₂损伤组相比，化合物dictyospiromide能显著降低氧化损伤细胞中LDH的漏出率，且呈剂量依赖性。因此可以证明，化合物dictyospiromide可以降低氧化损伤对PC12细胞膜的破坏，进而抑制LDH的漏出，表现出明显的细胞保护作用。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (8)

1.一种二萜生物碱化合物，其特征在于：具有2-氮杂螺[4,4]壬烷-1,3-二酮骨架，命名为网地藻螺旋胺（dictyospiromide），如式（Ⅰ）所示：

式（Ⅰ）。

2.根据权利要求1所述的二萜生物碱化合物，其特征在于：该化合物提取自厚网地藻Dictyota coriacea。

3.一种如权利要求1所述的二萜生物碱在制备神经保护药物中的应用。

4.一种如权利要求1所述的二萜生物碱在制备具有预防或治疗脑缺血再灌注损伤疾病功能药物的应用。

5.一种具有预防或治疗脑缺血再灌注损伤疾病功能的药物组合物，其特征在于含有治疗有效量的活性成分和药学上可接受的药用辅料；所述的活性成分包含权利要求1所述的二萜生物碱或其可药用的盐类衍生物。

6.根据权利要求5所述的一种具有预防或治疗脑缺血再灌注损伤疾病功能的药物组合物，其特征在于：所述的活性成分还包括有目前药学上可接受且已上市的抗氧化药物。

7.根据权利要求5所述的一种具有预防或治疗脑缺血再灌注损伤疾病功能的药物组合物，其特征在于：所述的抗氧化药物为依达拉奉、维生素C和维生素E中的一种或多种组合。

8.根据权利要求5所述的一种具有预防或治疗脑缺血再灌注损伤疾病功能的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物具有如下制剂形式：注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂和纳米制剂。