CN102335348A

CN102335348A - 一种用于防治帕金森氏病的天麻植物提取物及其制备方法

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Publication number: CN102335348A
Application number: CN201110303629XA
Authority: CN
Inventors: 王珂; 赵大龙; 石建功; 陈明霞; 张猛; 王振辉
Original assignee: BEIJING COLLAB PHARMA Co Ltd
Current assignee: Beijing Collab Pharma Co., Ltd.; Beijing Xiehe No.2 Pharmaceutical Factory
Priority date: 2011-10-09
Filing date: 2011-10-09
Publication date: 2012-02-01

Abstract

本发明公开了一种用于防治帕金森氏病的天麻植物提取物及其制备方法。该天麻植物提取物中派立辛衍生物总含量在35％～99.8％，其制备方法为：1)将天麻粉碎，用水或烷基醇或体积百分含量在0％～100％之间的任意比例烷基醇水溶液提取，浓缩提取液得到浸膏；2)将所述浸膏通过色谱柱，再用洗脱剂洗脱，收集富含派立辛衍生物的洗脱液，浓缩，过滤，干燥，得到天麻植物提取物。通过本发明所述工艺能够得到富含派立辛衍生物的天麻植物提取物，其操作简便，为开发防治帕金森氏病的药物提供了方法。

Description

一种用于防治帕金森氏病的天麻植物提取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及天然药物技术领域，特别涉及一种含派立辛衍生物的天麻植物提取物及其制备方法和在制备防治帕金森氏疾病的药物中的用途。

背景技术

帕金森病(Parkinson disease，PD)，又名震颤麻痹，由英国医生Parkinson于1817年首先描述并由此得名，是一种常见的中老年人神经系统退行性疾病，主要病变是黑质、蓝斑及迷走神经背核等处的细胞变性坏死，多巴胺递质生成障碍，导致多巴胺能与胆碱能神经系统不平衡。临床呈缓慢进展性，以静止性震颤、运动迟缓、肌强直及姿势步态异常为主要特征。随着全球人口老龄化的程度加快，PD等神经退行性疾病在老年人中的发病率居高不下，给社会和家庭带来了沉重负担。

目前临床上常用药物主要有以下几类：1.拟多巴胺药：如左旋多巴，司立吉兰；2.中枢抗胆碱药：如苯海索、苯扎托品(张国柱，盛守权.帕金森病的治疗研究进展[J].基层医学论坛，2011，15(4)：353-354)；这些药物的治疗目标都在恢复多巴胺能和乙酰胆碱能神经系统功能的平衡状态，但多存在疗效不确切或毒副作用大等缺点，并且它们是依据相应发病机理中的某一环节而进行控制，都是治标的方法，不能起有效根治的目的，无法阻止疾病的进展，而且长期使用可引起疗效降低，运动障碍等远期并发症。

PD属于中医学“颤证”、“颤振”、“拘证”等病证的范畴，运用中医药治疗PD是我国临床医学的一个特色，梁遥(梁遥.中药颤复宁对帕金森病的治疗作用分析[J].中国中医药资讯，2009，1(5)：136.)报道了复方中药颤复宁对帕金森病的治疗作用分析，指出中药颤复宁对PD大鼠模型有较好的治疗作用，对体外培养的多巴胺神经元有较强的营养和保护作用，作用机理：一是提高抗氧化指标还原型谷胱甘肽含量，降低氧自由基引起的氧化作用；二是提高神经元钙结合蛋白D28KmRNA的含量，及降低Caspase-3的含量，抑制由钙离子超载引起的细胞凋亡。因此，中药在治疗帕金森病中的功能和作用不容忽视，需要进一步的研究和开发。

天麻别名明天麻、白龙草、赤箭根。为兰科多年生寄生草本植物天麻Gastrodia elata Blume的块茎。多年生植物，生于湿润的林下，现多栽培。在我国主要产自四川、云南、贵州、湖北和陕西等地。在中药中天麻主要用于息风止痉、平肝潜阳、祛风止痛及偏正头痛等。中国专利200510032792.1中公开了含有天麻的中药组合物在治疗帕金森病中的作用，但未见植物天麻有效成分提取物在该病中的作用研究。

派立辛(parishin)是植物天麻中的一种主要化学成分，Dahmen J等人报到了如式I、式II、式III所示派立辛(parishin)A、B、C的结构(DahmenJ.，Leander K.Studies on Orchidaceae glucosides.Part 7.The structure ofparishin，a glucoside from Vanda parishii.Phytochemistry，1976，15(12)：1986-7)，其结构如下：

式I 式II 式III

由于天麻中化学成分复杂，而派立辛类化合物极性有较大差别，利用适合工业化生产的单次色谱分离技术富集含量大于50％的高含量派立辛衍生物有较大难度，目前还没有文献报道得到含量大于50％的高含量派立辛衍生物的天麻植物提取物，也没有报道过利用色谱分离技术实现制备富含派立辛其衍生物的天麻植物提取物的方法，也从未发现含派立辛衍生物的天麻植物提取物具有防治帕金森氏病的作用。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种含有派立辛衍生物的天麻植物提取物和制备方法，及其在制备防治帕金森氏病药物中的用途。

本发明提供的天麻植物提取物为：

一种天麻植物提取物，其中派立辛衍生物总含量为35％～99.8％。

本发明还提供了该天麻植物提取物的制备方法：

步骤1)将天麻粉碎，用水或烷基醇或体积百分含量在0％～100％之间的任意比例烷基醇水溶液提取，浓缩提取液得到浸膏；

步骤2)将所述浸膏通过色谱柱，再用洗脱剂洗脱，收集富含派立辛衍生物的洗脱液，浓缩，过滤，干燥，得到天麻植物提取物。

本发明所述派立辛衍生物可以为派立辛衍生物中任意单体，也可以为派立辛衍生物中任意多种单体化合物的混合物。

作为优选，所述派立辛衍生物为式I～III所示派立辛A、B、C。

派立辛衍生物的结构通式如式IV所示：

式IV

其中，R1，R2和R3各自独立地选自：

或

R4选自氢、C1-C6烷基、C1-C6烷基苯基、对羟基苄基、

其中Glu表示β-D-吡喃葡萄糖基，Me表示甲基；

作为优选，所述C1-C6烷基为甲基、乙基、丙基、乙丙基、丁基或异丁基；

作为优选，所述C1-C6烷基苯基为苄基。

本发明实施例所提供的天麻植物提取物中派立辛衍生物的总含量为35％～99.8％。

作为优选，该天麻植物提取物中派立辛衍生物总含量为50％～99.8％。

本发明还提供了制备含有派立辛衍生物的天麻植物提取物的方法。通过发明人对分离纯化工艺的研究，发现经过实施例中所述的提取、精制工艺可以得到富含派立辛衍生物的天麻植物提取物。该制备工艺方法如下：

a)提取方法：将天麻粉碎，然后用水或烷基醇或体积百分含量在0％～100％之间的任意比例烷基醇水溶液作为溶剂在0℃～溶剂回流的温度下提取，提取液经常压或减压浓缩后得到浸膏。

其中所述溶剂回流的温度即正常大气压下溶剂的沸点。当达到这个温度后，溶剂即使再加热也不会升温，从而变成气体，之后在冷凝系统的装置中被冷凝下来回流到反应体系。

作为优选，所述提取的温度为25℃～溶剂回流的温度。

作为优选，所述烷基醇水溶液的体积百分含量为50％～95％。

作为优选，所述烷基醇为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇中的一种或几种组成的混和溶剂。

更优选地，所述烷基醇为甲醇或乙醇。

b)精制方法：将提取步骤得到的浸膏用色谱方法精制，再用洗脱剂洗脱，收集富含派立辛衍生物的流份，浓缩，过滤，干燥，检测，得到天麻植物提取物。

作为优选，所述色谱方法为大孔吸附树脂色谱、正相硅胶色谱或反相硅胶色谱，或者为它们的组合。

作为优选，所述洗脱剂为水、C1～C6烷基醇、卤代烃、醚类溶剂、酮类溶剂或酯类溶剂，以及由上述溶剂组成的混和溶剂。

更优选地，所述C1～C6烷基醇为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇；所述卤代烃为二氯甲烷或三氯甲烷；所述醚类溶剂为乙醚或甲基叔丁醚；所述酮类溶剂为丙酮或2-丁酮；所述酯类溶剂为乙酸乙酯或甲酸乙酯。

更优选地，当所述色谱方法为大孔吸附树脂方法时，洗脱剂为水和10％～75％的乙醇，或水和10％～75％的甲醇，或水和10％～75％的丙酮；当所述色谱方法为反相硅胶方法时，洗脱剂为水和10％～50％的乙醇，或水和10％～50％的甲醇；当所述色谱方法为正相硅胶方法时，洗脱剂为二氯甲烷、三氯甲烷、甲酸乙酯或乙酸乙酯和90％～100％的乙醇水溶液或甲醇组成的混和溶液，且其比例为10∶1～2∶1。

更优选地，当所述色谱方法为大孔吸附树脂方法时，洗脱剂为水和10％、20％、30％、40％、50％、75％的甲醇水溶液、乙醇水溶液或丙酮水溶液；当所述色谱方法为反相硅胶方法时，洗脱剂为水和10％、50％的甲醇或乙醇溶液；当所述色谱方法为正相硅胶方法时，洗脱剂为体积比9∶1的三氯甲烷-甲醇混合物、体积比7∶1的三氯甲烷-甲醇混合物、体积比5∶1的三氯甲烷-甲醇混合物、体积比10∶1的乙酸乙酯-95％乙醇混合物、体积比3∶1的乙酸乙酯-95％乙醇混合物、体积比2∶1的乙酸乙酯-95％乙醇混合物、体积比9∶1的二氯甲烷-甲醇混合物、体积比5∶1的二氯甲烷-甲醇混合物、体积比10∶1的甲酸乙酯-95％乙醇混合物、体积比5∶1的甲酸乙酯-95％乙醇混合物或体积比3∶1的甲酸乙酯-95％乙醇混合物、体积比9∶1的三氯甲烷-无水乙醇混合物、体积比7∶1的三氯甲烷-无水乙醇混合物、体积比5∶1的三氯甲烷-无水乙醇混合物、体积比10∶1的甲酸乙酯-甲醇混合物、体积比3∶1的甲酸乙酯-甲醇混合物、体积比2∶1的甲酸乙酯-甲醇混合物、体积比9∶1的二氯甲烷-90％乙醇混合物、体积比5∶1的二氯甲烷-90％乙醇混合物、体积比9∶1的乙酸乙酯-甲醇混合物或体积比5∶1的乙酸乙酯-甲醇混合物。

作为优选，所述检测含有派立辛衍生物流份的方法为薄层层析、紫外、高压液相色谱方法。

更优选地，所述检测含有派立辛衍生物流份的方法为高效液相色谱方法。

更优选地，所述检测含有派立辛衍生物流份的方法为高效液相色谱外标法测定，以式I所示派立辛A作标准，计算其中派立辛衍生物的总含量。

本发明的实施例中还提供了含有派立辛衍生物的天麻植物提取物对于抗1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)诱发的小鼠帕金森氏病模型的药效学研究，其中包括行为学检测、纹状体多巴胺水平检测以及黑质多巴胺神经元的免疫组化检测。药效学实验结果表明，含有派立辛衍生物，特别是含有派立辛A、B、C的天麻植物提取物对帕金森氏病模型小鼠行为学有明显改善作用，能够提高模型组小鼠纹状体多巴胺(DA)含量，降低多巴胺代谢产物高香草酸(Homovanillic acid，HVA)、二羟苯乙酸(Dihydroxy-phenyl acetic acid，DOPAC)等的含量，另外还具有降低小鼠黑质MAO-B活性的趋势，对小鼠免疫组织化学检测结果表明，天麻植物提取物可明显提高小鼠黑质酪氨酸羟基化酶(TH)神经元的数量，疗效优于阳性对照药美多芭片。

利用本发明实施例中所述制备方法得到的天麻植物提取物可以与药物上接受的载体一起，按照药学领域的常规生产方法和设备，制成药物制剂。

作为优选，利用本发明实施例中所述方法得到的天麻植物提取物制备的这类药物制剂为口服或肠胃外给药制剂。

更优选地，利用本发明实施例中所述方法得到的天麻植物提取物制备的这类药物制剂为口服或静脉内给药制剂。

具体实施方式

本发明公开了一种用于防治帕金森氏病的天麻植物提取物及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的天麻植物提取物的制备方法为：

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：天麻植物提取物的制备

1)提取：取中药天麻药材1kg，粉碎后加入50％乙醇浸泡提取3次，每次24小时。合并提取液，回收乙醇并浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，离心甩滤，得澄清滤液。

2)精制：上述滤液通过经处理的HPD-100型大孔吸附树脂，用水和10％、20％、30％、40％、50％、75％的乙醇梯度洗脱，HPLC检测，收集20％乙醇洗脱部分的流份，合并，减压浓缩，喷雾干燥即得植物提取物4.48g。经过高效液相色谱法测定，其中派立辛类化合物含量为51.8％。

实施例2：天麻植物提取物的制备

1)提取：取中药天麻药材1kg，粉碎后加入水，50℃温浸泡提取3次，每次6小时。合并提取液，回收溶剂并浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，离心甩滤，得澄清滤液。

2)精制：上述滤液通过经处理的HP-20型大孔吸附树脂，用水和10％、20％、30％、40％、50％、75％的丙酮梯度洗脱，HPLC检测，收集10％丙酮洗脱部分的流份，合并，减压浓缩，喷雾干燥即得植物提取物4.42g。经过高效液相色谱法测定，其中派立辛类化合物含量为52.6％。

实施例3：天麻植物提取物的制备

1)提取：取中药天麻药材1kg，粉碎后加入100％乙醇浸泡过夜后，加热回流提取3次，每次3小时。合并提取液，回收乙醇并浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，离心甩滤，得澄清滤液。

2)精制：上述滤液通过经处理的D101型大孔吸附树脂，用水、10％、20％、30％、40％、50％和75％的甲醇依次梯度洗，HPLC检测，收集30％甲醇洗脱部分的流份，合并，减压浓缩，喷雾干燥即得植物提取物4.68g。经过高效液相色谱法测定，其中派立辛类化合物含量为54.4％。

实施例4：天麻植物提取物的制备

1)提取：取中药天麻药材1kg，粉碎后加入75％甲醇，室温浸提3次，每次24小时。合并提取液，回收甲醇并浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，离心甩滤，得澄清滤液。减压浓缩得浓缩液。

2)精制：浓缩液通过反相硅胶柱(C-18)，用水和10％甲醇溶液洗脱后，再用50％甲醇溶液洗脱，HPLC检测，收集50％甲醇洗脱部分的流份，合并，减压浓缩，干燥得植物提取物2.18g。经过高效液相色谱法测定，其中派立辛类化合物含量为66.2％。

实施例5：天麻植物提取物的制备

1)提取：取中药天麻药材1kg，粉碎后，加入75％异丙醇浸泡过夜后，75℃加热浸提3次，每次6小时。合并提取液，回收异丙醇并浓缩至稠浸膏。

2)精制：浸膏硅胶拌样，通过正相硅胶(100-200目)色谱柱，三氯甲烷-甲醇(9∶1)洗脱后，再用三氯甲烷-甲醇(7∶1)和三氯甲烷-甲醇(5∶1)洗脱，HPLC检测，收集三氯甲烷-甲醇(5∶1)洗脱部分的流份，合并，减压浓缩，干燥得植物提取物1.57g。经过高效液相色谱法测定，其中派立辛类化合物含量为50.3％。

实施例6：天麻植物提取物的制备

1)提取：取中药天麻药材1kg，粉碎后，加入75％正丁醇浸泡过夜后，加热回流提取3次，每次3小时。合并提取液，回收正丁醇并浓缩至稠浸膏。

2)精制：浸膏硅胶拌样，通过正相硅胶(200-300目)柱，乙酸乙酯-95％乙醇(10∶1)洗脱后，再用乙酸乙酯-95％乙醇(3∶1)和乙酸乙酯-95％乙醇(2∶1)依次洗脱，HPLC检测，收集乙酸乙酯-95％乙醇(3∶1)的流份，合并，减压浓缩，干燥得植物提取物1.88g。经过高效液相色谱法测定，其中派立辛类化合物含量为56.0％。

实施例7：天麻植物提取物的制备

1)提取：取中药天麻药材1kg，粉碎后加入95％乙醇0℃浸提3次，每次24小时。合并提取液，回收乙醇并浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，离心甩滤，得澄清滤液。减压浓缩得浓缩液。

2)精制：浓缩液通过反相硅胶(C-18)柱，水和10％乙醇溶液洗脱后，再用50％乙醇溶液洗脱，HPLC检测，收集50％乙醇洗脱部分的流份，合并，减压浓缩，干燥得植物提取物1.69g。经过高效液相色谱法测定，其中派立辛类化合物含量为60.9％。

实施例8：天麻植物提取物的制备

1)提取：取中药天麻药材1kg，粉碎后，加入75％乙醇，75℃温浸提取3次，每次8小时。合并提取液，回收乙醇并浓缩至稠浸膏。

2)精制：浸膏硅胶拌样，通过正相硅胶(100-200目)柱，二氯甲烷-甲醇(9∶1)洗脱后，再用二氯甲烷-甲醇(5∶1)洗脱，HPLC检测，收集二氯甲烷-甲醇(5∶1)洗脱部分的流份，合并，减压浓缩，干燥得植物提取物1.22g。经过高效液相色谱法测定，其中派立辛类化合物含量为55.1％。

实施例9：天麻植物提取物的制备

1)提取：取中药天麻药材1kg，粉碎后，加入95％乙醇和95％甲醇任意比例混合溶液浸泡过夜后，加热回流提取3次，每次4小时。合并提取液，回收溶剂并浓缩至稠浸膏。

2)精制：浸膏硅胶拌样，通过正相硅胶(60-100目)柱，甲酸乙酯-95％乙醇(10∶1)洗脱后，再用甲酸乙酯-95％乙醇(5∶1)和甲酸乙酯-95％乙醇(3∶1)洗脱，HPLC检测，收集甲酸乙酯-95％乙醇(5∶1)洗脱部分的流份，合并，减压浓缩，干燥得植物提取物1.86g。经过高效液相色谱法测定，其中派立辛类化合物含量为55.8％。

实施例10：天麻植物提取物的制备

1)提取：取中药天麻药材1kg，粉碎后加入35％乙醇浸泡提取3次，每次24小时。合并提取液，回收乙醇并浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，离心甩滤，得澄清滤液。

2)精制：上述滤液通过经处理的HPD-100型大孔吸附树脂，用水和70％的乙醇梯度洗脱，HPLC检测，收集70％乙醇洗脱部分的流份，合并，减压浓缩，喷雾干燥即得植物提取物6.34g。经过高效液相色谱法测定，其中派立辛类化合物含量为35.6％。

实施例11：天麻植物提取物的制备

1)提取：取中药天麻药材2kg，粉碎后加入50％乙醇浸泡提取3次，每次24小时。合并提取液，回收乙醇并浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，离心甩滤，得澄清滤液。

2)精制：上述滤液通过经处理的D101型大孔吸附树脂，用水、10％、20％、30％、40％、50％和75％浓度的甲醇依次梯度洗，HPLC检测，收集30％甲醇洗脱部分的流份，合并，减压浓缩，浓缩液通过正相硅胶(100-200目)色谱柱，三氯甲烷-甲醇(9∶1)洗脱后，再用三氯甲烷-甲醇(5∶1)洗脱，HPLC检测，收集三氯甲烷-甲醇(5∶1)洗脱部分的流份，浓缩液通过制备型液相，40％甲醇洗脱，分别收集派立辛A、B、C，得派立辛A 0.8g，派立辛B 0.32g，派立辛C 0.11g。经过高效液相色谱法测定，其中派立辛A含量为99.8％，派立辛B含量为99.5％，派立辛C含量为99.6％。

实施例12：天麻植物提取物的制备

1)提取：取中药天麻药材1kg，粉碎后，加入25％异丙醇浸泡过夜后，回流提取3次，每次2小时。合并提取液，回收异丙醇并浓缩至稠浸膏。

2)精制：浸膏硅胶拌样，通过正相硅胶(100-200目)色谱柱，三氯甲烷-无水乙醇(9∶1)洗脱后，再用三氯甲烷-无水乙醇(7∶1)和三氯甲烷-无水乙醇(5∶1)洗脱，HPLC检测，收集三氯甲烷-无水乙醇(5∶1)洗脱部分的流份，合并，减压浓缩，干燥得植物提取物1.42g。经过高效液相色谱法测定，其中派立辛类化合物含量为52.7％。

实施例13：天麻植物提取物的制备

1)提取：取中药天麻药材1kg，粉碎后，加入10％正丁醇浸泡过夜后，加热回流提取3次，每次1小时。合并提取液，回收正丁醇并浓缩至稠浸膏。

2)精制：浸膏硅胶拌样，通过正相硅胶(200-300目)柱，甲酸乙酯-甲醇(10∶1)洗脱后，再用甲酸乙酯-甲醇(3∶1)和甲酸乙酯-甲醇(2∶1)依次洗脱，HPLC检测，收集甲酸乙酯-甲醇(3∶1)的流份，合并，减压浓缩，干燥得植物提取物1.75g。经过高效液相色谱法测定，其中派立辛类化合物含量为55.3％。

实施例14：天麻植物提取物的制备

1)提取：取中药天麻药材1kg，粉碎后，加入20％乙醇，60℃温浸提取3次，每次8小时。合并提取液，回收乙醇并浓缩至稠浸膏。

2)精制：浸膏硅胶拌样，通过正相硅胶(100-200目)柱，二氯甲烷-90％乙醇(9∶1)洗脱后，再用二氯甲烷-90％乙醇(5∶1)洗脱，HPLC检测，收集二氯甲烷-90％乙醇(5∶1)洗脱部分的流份，合并，减压浓缩，干燥得植物提取物1.29g。经过高效液相色谱法测定，其中派立辛类化合物含量为55.7％。

实施例15：天麻植物提取物的制备

1)提取：取中药天麻药材1kg，粉碎后，加入80％乙醇，40℃温浸提取3次，每次8小时。合并提取液，回收乙醇并浓缩至稠浸膏。

2)精制：浸膏硅胶拌样，通过正相硅胶(100-200目)柱，乙酸乙酯-甲醇(9∶1)洗脱后，再用乙酸乙酯-甲醇(5∶1)洗脱，HPLC检测，收集乙酸乙酯-甲醇(5∶1)洗脱部分的流份，合并，减压浓缩，干燥得植物提取物1.35g。经过高效液相色谱法测定，其中派立辛类化合物含量为54.8％。实施例1-15制备方法数据汇总如表1所示。

表1天麻植物提取物制备方法数据汇总

以下实施例中采用的缩写“CLB”指含有派立辛衍生物的天麻植物提取物。以下实施例采用的实验材料如下：

1.实验药品：

(1)通过实施例1得到样品CLB-1，其中派立辛衍生物含量51.8％。

(2)通过实施例10得到样品CLB-10，其中派立辛衍生物含量35.6％。

(3)通过实施例11得到样品CLB-11，其中派立辛A含量为99.8％。

(4)通过实施例11得到样品CLB-12，其中派立辛B含量为99.5％。

(5)通过实施例11得到样品CLB-13，其中派立辛C含量为99.6％。

样品(1)～(5)用蒸馏水混悬溶解。

2.实验动物：

清洁级C57小鼠，体重24±1g，由北京维通利华实验动物技术有限公司供给，合格证号为scxk(京)2010-0001。实验条件下自然饮食，适应环境三天后进行实验。

3.实验仪器：

转棍仪由中国医学科学院药物研究所研制；光滑不锈钢杆由中国医学科学院药物研究所研制。

实施例16：小鼠模型的建立

模型建立：小鼠提前训练3天，将运动不协调的小鼠剔除，随机分组，每组15只。小鼠每天腹腔注射MPTP(溶于生理盐水)30mg/kg，连续5天。

分组给药：阳性对照药：美多芭片(L-DOPA)。

给药剂量：阳性对照药：美多芭片60mg/kg体重；

给药组给药剂量：

(1)CLB-1(5mg/kg_体重)

(2)CLB-10(7mg/kg_体重)

(3)CLB-11(2.5mg/kg_体重)

(4)CLB-12(2.5mg/kg_体重)

(5)CLB-13(2.5mg/kg_体重)

将实验模型分为正常对照组，MPTP模型组，给药组和阳性对照药美多芭片给药组。美多芭片剂每天现用现配。CLB，阳性对照药美多芭灌胃给药后30min注射MPTP，每天一次。在MPTP注射5天后，CLB和阳性对照药继续给药，每天一次，连续7天。

实施例17：小鼠行为学检测

(1)检测方法

本实验采用转棍法(Rotarod Test)和爬杆法(Rod Climbing Test)两种方法来评价小鼠的运动协调能力。

①转棍法：转棍仪水平金属杆(直径3cm)长约为50cm，用金属板分隔为5段，用挡板隔开动物彼此不受影响(中国医学科学院药物研究所研制)。转棍仪转速设为14r/min恒速旋转，然后将小鼠置于杆上，并开始计时，直到小鼠从杆上掉下为止记为潜伏期(即第一次掉落的时间)，以此表示其运动协调能力。每只小鼠测3次，每次间隔30min。取平均值。小鼠于实验的第3天，5天和12天转棍测试。

②爬杆法：爬杆法用一直径13mm，高760mm的光滑不锈钢杆(中国医学科学院药物研究所研制)，垂直竖立，将小鼠头向下放置在金属杆的顶部，让其沿杆自然爬下，观察动物在下行过程中的行为。小鼠爬下过程中的行为按标准记分，评分标准如下：5分：四肢并用，一步一步协调向下爬行；4分：一步一步向下爬行但兼有后肢滑行行为；3分：爬过一半距离后向下滑行，但可抱紧金属杆；2分：未爬过过半距离即出现滑行行为；1分：爬过一半距离后不能抓杆从杆上掉落；0分：未爬过一半距离即不能抓杆，从杆上掉落。实验前每只小鼠训练两次。每次实验均重复两次记录平均爬下时间及得分情况。小鼠于实验前进行爬杆学习两次。于实验第4天，7天和11天进行爬杆测试，每只小鼠测试2次，按照上述标准进行评分，取平均值。

(2)检测结果

转棍实验结果见表2，结果表明在第3，5和12天的转棍实验中，CLB各组对MPTP诱发的小鼠行为学障碍均有明显的改善作用。

表2.转棍法法检测CLB对PD模型小鼠行为学的改善作用

*P＜0.05，**P＜0.01，与正常对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与模型组比较。

爬杆实验结果见表3，结果表明给药组小鼠于第7天爬杆行为评分于MPTP组相比明显提高，第11天评分提高更加明显，优于阳性对照药L-DOPA，表明CLB对MPTP诱发的小鼠行为学障碍有改善作用。

表3.爬杆法检测CLB对PD模型小鼠行为学的改善作用

*P＜0.05，**P＜0.01与正常对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与模型组比较。

按照上述方法，实施例2-9、12-15制备的天麻植物提取物所得的结果与上述结果相近。

实施例18：小鼠纹状体多巴胺(DA)水平检测

(1)纹状体多巴胺水平检测方法：

采用HPLC-ED检测小鼠纹状体多巴胺(DA)水平。

①色谱条件：流动相：乙酸钠-柠檬酸缓冲液，含柠檬酸85mM，无水乙酸钠100mM，EDTA·Na₂0.2mM，先配成850ml，之后加入150ml的甲醇，如果体积不够1L，补加三蒸水到1L，调节pH＝3.68，抽滤后加入适量SDS(先加90mg，再根据分离情况而定)、正二丁胺(先加15μL)使峰完全分离。

②仪器参数：泵流速1.2mL·min-1，(0.2)检测器检测灵敏度10nA，玻碳工作电极，Ag/AgCl参比电极，检测电位0.76V，柱温25℃，进样量40μl。

③标准品配制：称取DA、DOPAC、HVA、IP、NE、5-HT、5-HIAA分别溶于0.1M HClO₄中，配制成标准品储备液，取储备液定量混合，用0.1MHClO₄稀释使各组分浓度均为0.125μg/ml，IP为0.25μg/ml。

④组织匀浆液的配制：A液：0.6mol/L的高氯酸溶液中加入IP，使IP的终浓度为0.375μg/ml，4℃保存。B液：含柠檬酸钾20mM，磷酸氢二钾300mM，EDTA·Na₂ 2mM，4℃保存。

⑤样品处理：组织样品处理过程均在冰浴条件下进行，遵循低温快速的原则。按照1∶5(W∶V，即1mg组织样品加入5μl A液)的比例加入4℃A液，匀浆，4℃，20000g离心20分钟，吸取一定量上清，加入半体积的B液，冰浴30min，混匀，静置，20000g，4℃离心20分钟，吸取上清，20000g，4℃离心20分钟，吸取上清，4℃保存待测。

(2)纹状体多巴胺水平检测结果

HPLC-ED检测多巴胺(DA)，结果见表4，实验结果表明CLB有增加小鼠纹状体DA的趋势。

表4.HPLC-ED检测小鼠纹状体DA的含量

实施例19：小鼠黑质多巴胺神经元的免疫组织化学检测

(1)免疫组化检测黑质多巴胺神经元的方法

行为学实验后，每组随机取5只小鼠，灌流固定后取脑，用于免疫组织化学检测。

a.溶液的配制

①4％多聚甲醛灌注固定液pH＝7.4(含3％蔗糖)

将40g多聚甲醛，28.64g Na₂HPO₄·12H₂O溶于800mL去离子水中，加盖加热至60℃使溶液澄清。加入30g蔗糖和3.12g NaH₂PO₄·2H₂O，用NaOH调pH值至7.4，加去离子水定容至1000mL，过滤后4℃保存，一周内使用。

②后固定液

4％多聚甲醛灌注固定液(pH＝7.4)1000mL中加入270g蔗糖，溶解即可。

③0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)

将9g NaCl溶于800mL双蒸水中，加入80mL浓度为0.1mol/L的Na₂HPO₄，加入120mL浓度为0.1mol/L的NaH₂PO₄，用HCl或NaOH将pH调至7.4。

④0.01mol/L磷酸盐-Triton洗液(PBST)

取0.01mol/L的PBS 1000mL置于37℃水浴中，边搅拌边缓慢滴加TritonX-100(终浓度0.3％)，使其充分溶解。

⑤DAB显色液

在1mL蒸馏水中顺序加入DAB显色试剂盒中的A、B、C液各1滴，混匀过滤后使用，现用现配。

⑥粘片液

将盛有少量蒸馏水的烧杯放入60-70℃水浴箱，加入5g明胶，溶解后放入0.5g硫酸铬钾，待溶解后定容至1000mL，滤纸过滤，恒温水浴下粘片，粘好的玻片放入烤箱中60℃烤干。

b.脑组织的灌流固定

小鼠用0.5％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，将其仰卧于平台上，伸展固定四肢，开胸腹充分暴露心脏和肝脏。用7号针头从心尖部略偏左处进针插入左心室，调整针尖至升主动脉方向，固定，同时剪开右心耳。先快速灌注温生理盐水至肝脏完全变白、右心耳流出澄清液体后，再换用4℃预冷的4％多聚甲醛(含3％蔗糖，用pH＝7.4的PBS配制)灌流，先快后慢，待小鼠肝脏变硬、肢体僵硬即完成固定。断头，取脑，置于4％多聚甲醛溶液中，4℃过夜后，转入含30％蔗糖4％多聚甲醛的后固定液中，标本与后固定液的体积比约为1∶20。待小鼠脑沉入容器底部后更换一次新的后固定溶液，4℃保存。

c.冰冻切片的制备

将脑组织标本从后固定液中取出，用滤纸吸干表面的残液。用手术刀片修理断面，使其平整，以便固定在冷冻台的标本托上。将修好的标本置于盛有少量异戊烷的冷冻管中，投入液氮速冻10秒左右。在组织固定台上加少许冰水，将速冻后的标本迅速垂直于台面放入预冷至-25℃的冰冻切片机的冷冻台上。在组织与冰面接触周围逐层滴加冰水，使其围绕组织成一冰柱状包埋在标本托上，尽量使其长轴与冰柱平面垂直，便于完整切到整个组织的横断面。标本完全包埋后，在黑质部位行连续冠状面切片，厚度20μm，依次放入装有PBST的24孔板中，用PBST清洗残留的固定液，5分钟×3次。

d.免疫组化染色

3％H₂O₂室温孵育10分钟，去除内源性过氧化物酶活性；吸出H₂O₂；蒸馏水洗，5分钟×3次，至无泡沫；PBST洗，5分钟×3次；用正常羊血清原液室温封闭30分钟，以减少非特异性吸附；吸出封闭血清，加入稀释好的一抗分别以PBST和非免疫正常血清代替一抗建立空白及阴性对照；置于水平摇床中室温下孵育2小时，4℃孵育过夜。吸出一抗；PBST洗，5分钟×3次；加生物素标记的兔抗山羊抗体(二抗，稀释度为1∶300)，室温孵育2小时；吸出二抗；PBST洗，5分钟×3次；加辣根过氧化物酶(HRP)标记链亲合素(三抗，稀释度为1∶300)，室温孵育2小时；吸出三抗，PBST洗，5分钟×3次。用DAB工作液显色2分钟左右；显微镜下控制染色程度，自来水终止显色反应；将显色后的脑切片置于0.01mol/L PBST中。将脑切片固定于用粘片液处理过的载玻片上，自然晾干。75％、80％、90％、95％梯度酒精依次脱水，每次10分钟；100％酒精脱水2次，每次10分钟；二甲苯透明2次，每次5分钟；中性树脂封片。

(2)免疫组化检测黑质多巴胺神经元的结果及分析

光镜下观察小鼠TH神经元的变化。在4倍和20倍物镜下拍照，数黑质致密部TH阳性神经元数目，每只小鼠5张脑片，取平均值。

MAO-B活性结果见表5，结果表明CLB有降低小鼠黑质MAO-B活性的趋势。

表5.小鼠黑质MAO-B活性

免疫组织化学检测结果见表6，实验结果表明CLB可明显提高小鼠黑质酪氨酸羟化酶(TH)神经元的数量，疗效优于阳性对照药L-DOPA。

表6.免疫组化检测小鼠黑质TH神经元数量

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种天麻植物提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述烷基醇水溶液为50％～95％的烷基醇水溶液。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述烷基醇为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇中的一种或几种组成的混和溶剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述烷基醇为甲醇或乙醇。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述提取的温度为0℃～溶剂回流的温度。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述提取的温度为25℃～溶剂回流的温度。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述色谱柱为大孔吸附树脂、正相硅胶色谱柱或反相硅胶色谱柱，或者为它们的组合。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述洗脱剂为水、C1～C6烷基醇、卤代烃、醚类溶剂、酮类溶剂或酯类溶剂，以及由上述溶剂组成的混和溶剂。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述洗脱剂为甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、甲基叔丁醚、丙酮、2-丁酮、乙酸乙酯或甲酸乙酯。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述色谱柱为大孔吸附树脂，所述洗脱液为水和10％～75％的甲醇、乙醇或丙酮水溶液。

11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述色谱柱为反相硅胶柱，所述洗脱液为水和10％～50％的甲醇或乙醇水溶液。

12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述色谱柱为正相硅胶柱，所述洗脱液为二氯甲烷、三氯甲烷、甲酸乙酯或乙酸乙酯和90％～100％的乙醇水溶液或甲醇组成的混和溶剂，其比例为10∶1～2∶1。

13.一种由权利要求1～12所述制备方法制备的天麻植物提取物，其特征在于，派立辛衍生物总含量为35％～99.8％。

14.根据权利要求13所述的天麻植物提取物，其特征在于，所述派立辛衍生物总含量为50％～99.8％。

15.如权利要求13或14所述天麻植物提取物在制备防治帕金森氏病药物中的用途。