具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1天麻派立辛提取物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用
1、实验药品
天麻派立辛提取物:根据专利号为CN201110303629.X所述的制备方法制备而得,选用派立辛衍生物含量分别为50%、70%的天麻提取物为实验药物,分别简称为50%派立辛衍生物、70%派立辛衍生物;
派立辛、派立辛B、派立辛C单体;
上述天麻派立辛提取物及派立辛A、B、C单体,用生理盐水混悬溶解后备用;
依达拉奉,购自江苏先声药业集团;
红四氮唑(TTC),由上海生物工程公司提供。
2、实验方法
健康SD大鼠,体重240-300g,SPF级,雌雄不拘,随机分为假手术组、模型对照组(以下简称对照组)、依达拉奉阳性对照组、派立辛、派立辛B、派立辛C治疗组和50%派立辛衍生物组、70%派立辛衍生物组,每组25只大鼠。
采用插线法栓塞右侧大脑中动脉闭塞模型:用3.5%水合氯醛1ml/kg腹腔麻醉大鼠后,取右侧颈部直切口,暴露并结扎右侧颈总动脉和颈外动脉,在颈总动脉近颈内、颈外动脉分叉处剪一小口,将栓塞线插入到大脑中动脉的起始处,结扎颈总动脉分叉的插线处固定栓塞线,尼龙线外留约1cm,缝合皮肤。2h后轻轻拔出栓塞线,实现大脑中动脉再灌注,则造模完成。假手术组仅分离颈内动脉、颈外动脉及大脑中动脉。动物苏醒后按Bederson评分标准立即进行神经功能缺失评分,有体征者入选。
派立辛、派立辛B、派立辛C治疗组按分别按0.5mg/g给药,50%派立辛衍生物组、70%派立辛衍生物组按0.5mg/kg给药,对照组予以等量生理盐水,依达拉奉组按0.5mg/kg给药,均于造模后6h内经尾静脉注入。以后每天1次连续5d。
神经功能缺损评分:进行两次神经功能缺损评分,即造模成功后第一天进行神经功能缺损评分,治疗5天后再进行一次。按Bederson评分标准,即0分:无神经功能缺失症状;1分:提大鼠尾,见瘫痪侧前肢回收屈曲不能正常伸向地面;2分:向瘫痪侧推时感阻力较对侧明显降低;3分:大鼠爬行时向瘫痪侧旋转;4分:伴有意识障碍。
脑梗死体积测定:于造模5d后,随机取10只大鼠,麻醉后断头取脑,去掉嗅球、小脑和低位脑干,剩下的部分立即冠状切成5片,置于2%的TTC溶液中染色,梗塞区为苍白色,正常为玫瑰紫红色。用TD2000图像分析系统测出各层的梗塞面积,总面积之和乘以层厚即为体积(mm3)。
脑含水量的测定:采用干湿重法测脑组织含水率:于造模5d后,随机取10只大鼠,麻醉后断头取脑立即切成左右两半,用电子天平称取病灶侧半球的重量,然后置于100℃烤箱内烤24h,用同一天平再次称重,以[(湿重-干重)/湿重×100%]即为相对含水量。
组织病理学观察:每组取5只大鼠,4%的多聚甲醛灌流固定,切为5μm的石蜡切片,常规HE染色,封片,光镜下观察病灶区组织病理变化。
统计学处理:所得结果以x±s表示,应用SSPS11.0 for-windows统计学软件进行统计处理。神经功能缺损评分采用非参数检验中的Mann-Whitney U方法,脑梗死体积及脑含水量比较采用单因素方差分析one-way ANOVA方法统计,其中两两比较采用Student-Newman-Keuls方法。
3、实验结果
(1)对大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积和脑含水量的影响,实验结果见表1。
表1、对大鼠神经行为、脑梗死体积和脑含水量的影响
*表示与模型对照组的相应指标相比,P<0.01。
表1结果显示,造模后第一天,模型对照组、依达拉奉组、派立辛各治疗组以及天麻派立辛提取物组,其神经功能缺损评分无显著性差异,P>0.05;经过治疗后第五天(即造模后第五天),依达拉奉组及派立辛各治疗组以及天麻派立辛提取物组的神经功能缺损评分明显降低,脑梗死体积及脑组织含水量也明显降低,与模型对照组比较差异显著(P<0.01)。
由以上结果可得:派立辛单体及天麻派立辛提取物对于脑组织缺血有明显的保护作用,且派立辛B、C组,以及含70%派立辛衍生物的天麻提取物组的脑保护作用强于依达拉奉。
(2)光镜下组织病理学变化
假手术组:大鼠皮层各层细胞排列整齐,神经元结构完整,神经基质无水肿,神经纤维无损坏;
模型对照组:大脑皮层细胞排列紊乱,神经细胞水肿,胞核淡染,核固缩,尼氏小体减少或消失,树突轴突减少、血管周围间隙增宽等变化;
派立辛单体以及天麻派立辛提取物治疗组:大脑皮层锥体细胞和脑实质神经细胞结构清楚,核固缩、核溶解程度较对照组明显减轻,轻度水肿,病变范围明显缩小。
由以上结果可知:派立辛单体以及天麻派立辛提取物可以保护脑缺血再灌注损伤的大脑皮层细胞。
实施例2天麻派立辛提取物对N-甲基D-门冬氨酸所致大鼠神经细胞损伤的保护作用
1、实验材料
天麻派立辛提取物:根据专利号为CN201110303629.X所述的制备方法制备而得,选用派立辛衍生物含量分别为50%、70%的天麻提取物(分别简称为50%派立辛衍生物组、70%派立辛衍生物组),用时以生理盐水稀释至合适浓度;多赖氨酸为sigma公司产品;DMEM培养基为Gibco公司产品;其余试剂均为分析纯。
N-甲基D-门冬氨酸(NMDA):
实验动物:普通级Sprague Dawley大鼠18只,体重250-280g,山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供,合格证号:鲁动质字20100515号。
2、实验方法
2.1神经细胞原代培养
怀孕15d大鼠水合氯醛麻醉,75%乙醇消毒胸腹部,在无菌条件下取出胎鼠,剥出,分离两侧皮层组织,用手术刀切成糜状,移入含0.125%胰蛋白酶的磷酸缓冲液中消化30min(37℃)后弃去消化液,加入含10%胎牛血清,10%马血清,100U/ml青霉素,100U/ml链霉素的DMEM培养液,用小口径吸管反复吹打分散,200目细胞筛过滤后,以DMEM调整细胞浓度至106个/ml,接种至预先涂有0.01%多聚赖氨酸的35mm培养皿中,每皿2ml,置CO2培养箱中37℃孵育,于培养第3天在培养液中加入细胞分裂抑制剂阿糖胞普储备液(6μl/皿)以抑制非神经元细胞的过度增殖,作用48h后换新鲜培养液,以后每周换液2次,每次更换半量液。
2.2NMDA诱导神经细胞质损伤
将正常培养的上述神经细胞随机分为正常对照组,NMDA组,50%派立辛衍生物治疗组和70%派立辛衍生物治疗组;
NMDA组:将细胞培养至14天后,换以含50μmol/L NMDA的低血清DMEM(5%胎牛血清,5%马血清,30mmol/L HEPES)继续培养,孵育12h后,观察细胞形态,计算死亡率;
50%派立辛衍生物治疗组:将细胞培养至14天后,换以50%派立辛衍生物含量分别为10μmol/L、100μmol/L的低血清DMEM(5%胎牛血清,5%马血清,30mmol/L HEPES)继续培养6h,再加NMDA使其终浓度为50μmol/L,孵育12h后,观察细胞形态,计算死亡率;
70%派立辛衍生物治疗组:将细胞培养至14天后,换以70%派立辛衍生物含量分别为10μmol/L、100μmol/L的低血清DMEM(5%胎牛血清,5%马血清,30mmol/LHEPES)继续培养6h,再加NMDA使其终浓度为50μmol/L,孵育12h后,观察细胞形态,计算死亡率。
2.3统计学处理
数据用x±SD表示,组内给药前后,组间均以参比差值法(ANOVA)进行统计学处理。
3、实验结果
3.1对培养神经细胞形态变化的影响
正常对照组:正常神经细胞培养至14天时,生长良好,胞体呈锥开或三角形,突触粗而长,呈树根状交织成网;
NMDA组:细胞出现肿胀,轮廓模糊,神经元突触断裂,消失,甚至细胞崩解;
50%派立辛衍生物治疗组(10μmol/L和100μmol/L)、70%派立辛衍生物治疗组(10μmol/L和100μmol/L):细胞损伤程度明显减轻,细胞形态保持完整,细胞密度有所降低,仍可见突触断裂等现象;
以上结果表明:天麻派立辛提取物对NMDA诱导的大鼠神经细胞损伤有显著的保护作用。
3.2对培养神经细胞死亡率的影响
对上述各组神经细胞进行台盼蓝染色,计算细胞死亡率。
表2、对神经细胞死亡率的影响
##表示与正常对照组相比,p<0.001;*表示与NMDA组相比,p<0.01.
由表2结果可得,天麻派立辛提取物可明显降低NMDA所致神经细胞损伤的神经细胞死亡率。
实施例3天麻派立辛提取物对小鼠闭合性脑外伤的保护作用
1、实验材料
天麻派立辛提取物:根据专利号为CN201110303629.X所述的制备方法制备而得,选用派立辛衍生物含量分别为50%、70%的天麻提取物(分别简称为50%派立辛衍生物组、70%派立辛衍生物组),用时以生理盐水稀释至合适浓度;
跳台实验自动记录仪,中国医学科学院药物所仪电室;荧光分光光度计,日本HITACHI公司;酶标仪,美国Molecula;
实验动物:清洁级昆明小鼠,体重20-22g,山东省天然药物工程技能研究中心实验动物中心提供,合格证号:鲁动质字20100515号。
2、实验方法
取小鼠40只,随机分为正常对照组、模型对照组、50%派立辛衍生物组、70%派立辛衍生物组,每组10只。禁食16小时后按文献[宋亚颀,王汉东,闫伟.叔丁基对苯二酚预处理对大鼠创伤性脑损伤的保护作用研究[J].2010,4(23):365-367]所述方法造成小鼠闭合性脑外伤模型,各组静脉给药,24小时后剥取鼠脑,称量湿重,70度烘干24小时,称干重,计算脑含水量,脑含水量高于正常值表示脑部水肿。
3、实验结果
天麻派立辛提取物对闭合性脑外伤小鼠脑水肿的影响结果见表3
表3、天麻派立辛提取物对闭合性脑外伤小鼠脑组织含水量的影响(n=10)
与模型对照组比较*P<0.05,**P<0.01
由表3可知,闭合性脑外伤造成小鼠脑严重水肿,给予天麻派立辛提取物后,小鼠脑水肿有不同程度的减轻,且呈剂量依赖性;表明:天麻派立辛提取物对小鼠闭合性脑外伤有明显的保护作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。