CN113262229B - 诸葛菜碱d在制备抗辐射损伤的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了诸葛菜碱D在制备抗辐射的药物中的应用，诸葛菜碱D的分子式为C16H18O4N6，化学结构式如式(1)所示：

Description

诸葛菜碱D在制备抗辐射损伤的药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及诸葛菜碱D在制备抗辐射损伤的药物中的应用。
背景技术
辐射与人们的日常工作和生活关系越来越密切，辐射给环境、人体造成直接或间接的放射污染或危害越来越不容忽视。
肿瘤已成为人类健康的头号杀手，放疗(放射治疗)是治疗恶性肿瘤的重要方法之一。据统计，约70％的恶性肿瘤患者在治疗过程中需接受放疗。然而，放射治疗的 选择性弱，放射线在杀伤肿瘤细胞的同时，往往也会对周围组织的正常细胞造成损伤， 甚至产生严重的毒副作用，继而累及造血系统、免疫系统、神经系统等。临床上，也 常因正常组织对放射线耐受剂量的限制导致放射线对肿瘤治疗失败，从而严重影响肿 瘤病人的治疗效果。为了加强放射治疗对肿瘤病人的治疗效果，其中一个途径是提高 正常组织对放射线的耐受剂量(从而能提高放射治疗中放射线的剂量以提高对肿瘤细 胞的杀伤作用)，研究和开发抗辐射损伤药物是提高正常组织对放射线耐受剂量的一 种解决方式。已有的抗辐射药物如氨巯基类抗辐射药物，代表药物即是氨磷汀，该药 物治疗时间窗窄，存在低血压、头昏、呕吐等严重不良反应，限制了其临床应用；激 素类辐射损伤防治药物如尼尔雌醇，疗效好，但是激素类药物对性器官的影响巨大， 长期多次使用，可引起女性月经失调，男性睾丸萎缩，生精细胞抑制等副作用，限制 了其临床上的应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供诸葛菜碱D在制备抗辐射损伤的药物中的应用，诸葛菜碱D的分子式为C16H18O4N6，化学结构式如式(1)所示：
Figure BDA0003075723660000011
所述诸葛菜碱D是从诸葛菜的种子中提取得到的生物碱类化合物。
所述诸葛菜碱D是从包含诸葛菜碱D的植物中提取得到的生物碱类化合物。
诸葛菜碱D通过修复辐射损伤的细胞发挥抗辐射损伤作用，所述辐射损伤为造血系统损伤。
所述药物为含有所述诸葛菜碱D、其几何异构体、其药学上可接受的盐、其水合 物或溶剂化合物以及可药用载体或赋形剂的药物组合物。
所述药物为散剂、片剂、丸剂、颗粒剂、滴丸剂、胶囊剂、包衣剂、口服液、乳 剂、散剂、注射剂、混悬剂、酊剂、栓剂等。
所述药物的给药剂量以诸葛菜碱D计，为0.1-500mg/kg体重，优选为1-100mg/kg体重，更优选为5-50mg/kg体重。
所述药物的给药方式为口服；优选的，在辐照前24h和30min给予所述药物各一次。
所述诸葛菜碱D促进外周血白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板计数(PLT)、 血红蛋白含量(HGB)至少提前4天开始修复；优选的，所述诸葛菜碱D促进外周血白 细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板计数(PLT)至少提前8天开始修复。
给予所述药物后，人脐带静脉内皮细胞的照射后存活率在80％以上。
给予所述药物后，小鼠经8.0Gy的60Coγ射线照射后存活率在70％以上。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了作为保肝护肝药物的诸葛菜碱D在制备抗辐射损伤的药物中的用途。本发明发现诸葛菜碱D具有较好的辐射防护活性，包括显著提高HUVECs(人脐带 静脉内皮细胞)的辐照后存活率、有效提高C57/BL小鼠的辐照后存活率并改善其血象 指标。由这些实验结果可以揭示诸葛菜碱D可用作辐射防护药物，适用于防护辐射对 机体造成的损伤。
诸葛菜碱D具有高效低毒、防治兼备、质量稳定、服用方便、口服注射均有效等 特点，能直接对抗辐射所致的多系统损伤(如造血系统损伤),有效减轻急性放射病的 症状(如白细胞、血小板降低等)，这为急性放射病后续的综合救治赢得了宝贵的时 机。诸葛菜碱D能应用于高效安全的辐射防护药物制备中。
附图说明
图1所示为诸葛菜碱D对L02细胞的毒性作用柱状图；
图2所示为诸葛菜碱D对HUVEC细胞的毒性作用柱状图；
图3所示为诸葛菜碱D动物实验的小鼠存活率变化曲线。
具体实施方式
本发明提供诸葛菜碱D在制备抗辐射损伤药物中的应用。这里提到的诸葛菜碱D，是从诸葛菜的种子中提取得到的一种生物碱类化合物，分子式为C16H18O4N6，结构式如 式(1)所示，1H-NMR与13C-NMR核磁数据见表1，在公开号为CN111377933A的专利文 献中公开：
Figure BDA0003075723660000031
表1诸葛菜碱D的1H-NMR与13C-NMR核磁数据(DMSO-d6)
Figure BDA0003075723660000032
从诸葛菜的种子中提取诸葛菜碱D的方法，具体包括以下步骤：
步骤1、取干燥的诸葛菜种子(含水量1-10％)，采用乙醇水混合溶剂(乙醇和水 的体积为(1-10)：(1-10))在65-90℃(优选70-85℃)下回流提取0.5-5h；然后 减压浓缩(压力-0.1MPa)至无乙醇味，放至室温，得回流提取液备用；种子与混合溶 剂的加入比例是质量比(1-6)：(1-6)；
步骤2、将步骤1得到的回流提取液用正丁醇反复萃取(回流提取液与正丁醇的混合比例为(1-5)：(1-5)，一般萃取5-8次)，减压回收正丁醇至压力为-0.1MPa、 50℃下没有正丁醇馏分产出，得到正丁醇萃取物；
步骤3、将步骤2得到的正丁醇萃取物经硅胶柱层析，依次用三氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到若干洗脱部位，经薄层色谱检测，乙醇-浓硫酸加热显色，合并薄层色谱中显色 比移值相同的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩，得到一次柱层析分离物备 用；
步骤4、将步骤3中所得的一次柱层析分离物经ODS(十八烷基硅烷键合硅胶)柱层析分离，采用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱检测，乙醇-浓硫酸 加热显色，合并薄层色谱中显色比移值相同的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压 浓缩，得到二次柱层析分离物备用；
步骤5、将步骤4中所得的二次柱层析分离物经Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶) 层析分离，采用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(体积比为(1-5)：(1-5)：(1-5))溶 剂系统洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱检测，乙醇-浓硫酸加热显色，合并薄层 色谱中显色比移值相同的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩，得到三次柱层 析分离物
步骤6、将步骤5中所得的三次柱层析分离物进行半制备高效液相色谱分离，以甲醇-水作为流动相进行洗脱，收集电脑显示器显示出峰时的洗脱液，经减压浓缩，得到 黄色粉末。
结构鉴定
黄色无定型粉末，mp296.0～298.0℃，易溶于甲醇、丙酮、二甲亚砜，微溶于乙 醇、水，比旋光度[α]D＝-12.0(c＝0.1，MeOH)。薄层硅胶板在紫外254nm下有暗 斑，碘显色为棕黄色，乙醇-浓硫酸加热不显色。紫外光谱在295nm处有最大吸收。 综合红外光谱、HR-ESI-MS(高分辨质谱图)、1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)谱、 13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)谱、1H–1H COSY谱(1H-1H Correlated Spectrometry，氢氢 化学位移相关谱)、NOESY谱(NuclearOverhauser Effect Correlation Spectrometry， 核欧沃豪斯效应谱)、HMBC谱(Heteronuclear Multiple Bond Coherence，异核多 键相关谱)、HSQC图谱(Heteronuclear Single-Quantum Coherence，异核单量子相 关谱)和X射线-单晶衍射(107.65K，Cu靶，CCDC序列号：1814448)方法推断出该 黄色无定形粉末的结构式如式(1)所示，命名为诸葛菜碱D。
Figure BDA0003075723660000041
在对诸葛菜碱D的进一步研究过程中发现诸葛菜碱D能够保护因受辐射而损伤的细胞，从而发挥抗辐射作用，即：诸葛菜碱D可用于制备抗辐射损伤的药物(即，辐 射防护药物)。该抗辐射药物的活性成分为诸葛菜碱D，还可以包括药学上可接受的 载体或赋形剂，如溶剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、 乳化剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、 着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂、和/或抗氧化剂。 该抗辐射药物为散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、注射剂、乳剂、混悬剂或酊剂 中的任意一种剂型。各种剂型的药物均按照药学领域的常规方法制备。
以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。
下列实验的分组和数据计算分析均按照统计学方法处理。所有辐射照射(细胞和小鼠)均使用中国人民解放军军事医学研究院辐射医学研究所8.0Gy 60Coγ或6.5Gy 60Coγ照射装置。
实验例一：诸葛菜碱D的体外细胞毒性实验
1、主要材料
1.1、药品和试剂：诸葛菜碱D，纯度为98～99％，精密称取，用DMSO溶解得到 不同浓度的诸葛菜碱D溶液；RPMI-1640培养基：购自美国Gibco公司；胎牛血清、 胰蛋白酶：购自美国Sigma公司；青霉素：购自山东新华制药有限责任公司；链霉素： 购自华北制药有限责任公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)：购自美国Sigma公司；二甲亚 砜(DMSO)：购自美国Sigma公司。
1.2、细胞株：人正常肝细胞L02和人脐静脉内皮细胞HUVEC(来源于美国ATCC细 胞库)。
1.3、分组：实验分为实验组(含有细胞的培养基、DMSO和药物)；对照组(含有细 胞的培养基和DMSO)；空白组(含有细胞的培养基)。
2、实验方法
2.1细胞培养
向RPMI-1640培养基中加入终浓度为l0％(v/v)的胎牛血清和l％(v/v)的抗生 素(含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)，置于5％CO2培养箱37℃条件下培养，当细 胞贴壁生长至密度达到80％时，按1/2的比例传代，传代时用0.25wt％的胰蛋白酶于 培养箱中消化2～3min，取对数生长期状态良好的细胞进行实验。
2.2细胞毒性实验
用MTT法测试诸葛菜碱D对L02和HUVEC细胞存活率的影响。
(1)细胞接种：取对数生长期状态良好的细胞，经0.25％的胰蛋白酶消化后配制成细胞悬液，以5×103个/孔，100μL的细胞悬液均匀地接种于96孔板中(实验孔周 边以无菌PBS填充)，于培养箱中培养。
(2)药物处理：接种12h后，取出96孔板，实验组分别加入1μL不同浓度的诸葛 菜碱D溶液(每孔诸葛菜碱D的终浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM、 6.25μM)，对照组加入1μLDMSO，于培养箱中继续培养。
(3)检测：加药处理48h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL继续恒温培养4h， 弃去培养液，每孔加入100μL DMSO，混合均匀后，用酶标仪在540nm处测定每孔吸 光值，测得的光密度值反映细胞活性和数量多少，以空白组吸光值为存活率100％。
(4)计算各组细胞相对存活率，细胞相对存活率＝(OD实验组-OD空白组)/(OD 对照组-OD空白组)×100％。独立重复实验三次，结果如图1和图2所示。
从图1和图2可以看出，在各浓度下的诸葛菜碱D对L02细胞和HUVEC细胞的细 胞相对存活率与空白组均无显著差异。由该结果可知，诸葛菜碱D在浓度为100μM 以下时，对L02细胞和HUVEC细胞未显示有明显的细胞毒性。
实验例二：诸葛菜碱D的细胞抗辐射实验
1、主要材料
1.1药品和试剂：同实验例一。
1.2细胞株：人脐静脉内皮细胞HUVEC(来源于美国ATCC细胞库)。
1.3分组：实验分为空白组(不辐照、不给药)、对照组(辐照、不给药)、阳性药 组(辐照、给尼尔雌醇)和实验组(辐照、给诸葛菜碱D)。
2、实验方法
2.1细胞抗辐射实验
取实验例一中2.1所培养的对数生长期状态良好的细胞，经0.25％胰蛋白酶消化后配制成细胞悬液，以5×103个/孔，100μL的细胞悬液均匀地接种于96孔板中(实 验孔周边以无菌PBS填充)；于培养箱中培养12h后，取出96孔板，对照组加入1μL DMSO，阳性药组加入1μL尼尔雌醇溶液(每孔尼尔雌醇的终浓度分别为50μM和 12.5μM)，实验组加入1μL不同浓度的诸葛菜碱D溶液(每孔诸葛菜碱D的终浓度分 别为50μM和12.5μM)，于培养箱中继续培养24h后，除空白组外，其余各组同时给 予60Coγ射线一次性照射，照射剂量为8Gy；照射24h后，以MTT法显色；4h后用酶 标仪测定波长540nm处的OD值。计算各组细胞相对存活率，细胞相对存活率的计算方 法同实验例一中的2.2。
2.2数据处理
使用GraphPad Prism 5软件对数据进行作图分析，实验组同对照组间数据比较进行显著性差异检验，P<0.05认为差异有统计学意义，实验结果见表2。
表2诸葛菜碱D及尼尔雌醇照射后的细胞相对存活率
Figure BDA0003075723660000071
表2中的数据表明，诸葛菜碱D在浓度为50μM、12.5μM时，均能显著提高HUVECs 细胞的照后存活率(与对照组相比，P＜0.05)；其中，浓度为50μM时，诸葛菜碱D 与尼尔雌醇的辐射防护作用相当，浓度为12.5μM时，辐射防护作用显著优于尼尔雌 醇(P＜0.05)。
实验例三：小鼠存活实验
1、实验动物
雄性C57/BL小鼠作为受试动物，小鼠体重为18.0～22.0g，购自斯贝福(北京) 生物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0002。实验动物在军事医学 研究院动物中心SPF实验室内饲养，每笼5只小鼠，饲以专门为小鼠配制的饲料，自 由饮水，动物中心SPF实验室内温度保持在25℃左右，相对湿度保持在40～70％，每日 光照12小时。
2、存活实验
小鼠随机分为5组，每组10只，分别为辐射对照组(含5wt‰CMCNa水溶液)， 阳性对照组(尼尔雌醇5mg/kg)，化合物低、中、高剂量组(诸葛菜碱D剂量分别为 12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)。化合物低、中、高剂量组以灌胃方式，分别于辐照 前24h、30min各给药一次；阳性对照组按照常规方式于辐照前24h灌胃给药一次。各 组小鼠使用60Coγ射线照射，照射剂量为8.0Gy(致死剂量)，以辐照当天为第0 天计算，从辐照后第1天到第30天，每天观察并记录小鼠体重和存活情况，结果见表 3和图3。
表3小鼠存活实验中的小鼠体重变化表
Figure BDA0003075723660000072
Figure BDA0003075723660000081
表3结果可以看出，辐照后第10天到第30天，尼尔雌醇组和化合物高中低三组 的小鼠体重明显高于(P＜0.05)辐射对照组；与尼尔雌醇组相比，化合物高中低三组仅 在照后第18-22天的体重与阳性对照组差异显著，其它时间都与阳性对照组相当。
图3的存活情况显示：照射后30天，辐射对照组存活率为0％，尼尔雌醇组存活 率100％，化合物高中低三个剂量组存活率分别为100％、80％和70％。与辐射对照 组相比，尼尔雌醇组和化合物高中低三组均能明显提高小鼠辐照后存活率，效果显著， 呈剂量依赖关系；与尼尔雌醇组相比，诸葛菜碱D在高剂量与阳性对照的效果相当。
以上说明诸葛菜碱D对小鼠有较好的辐射防护作用。
实验例四：小鼠血象测定实验
1、实验动物
同实验例三中1的实验动物。
2、血象测定
小鼠随机分为5组，每组10只，分别为辐射对照组(含5wt‰CMCNa水溶液)， 阳性对照组(尼尔雌醇5mg/kg)，化合物低、中、高剂量组(诸葛菜碱D剂量分别为 12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)。化合物低、中、高剂量组以灌胃方式，分别于照前 24h、30min各给药一次；阳性对照组按照常规的方式于辐照前24h灌胃给药一次。各 组小鼠使用60Coγ射线照射，照射剂量为6.5Gy(非致死剂量)，以辐照当天为第0 天计算，从照后第1天到第30天，每天观察并进行血象测定。血象测定具体为：小鼠 尾静脉采血，以照射当天为0天计算，分别于照射前，照射后1，4，7，10，14，18， 22，30天由尾静脉取血，检测外周血白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板计数(PLT)、 血红蛋白含量(HGB)，结果分别见表4-表7。
表4照后1d-30d的小鼠白细胞计数表
Figure BDA0003075723660000091
从表4可以看出，照后第4天到第14天，尼尔雌醇组和化合物高中低三组的小鼠 白细胞计数明显高于(P＜0.05)辐射对照组，效果显著，表明本发明化合物至少提前 10天(14-4＝10)促进白细胞开始修复，对小鼠有较好的辐射防护作用。化合物组高 中低三个剂量组提升小鼠白细胞计数水平与阳性药相当，能达到阳性药相当的抗辐射 作用。
一般的，在小鼠受到非致死剂量的射线照射后，会发生血液系统损伤，也就是骨髓性放射病，即：辐射对照组照射后，小鼠各项血液指标开始逐步恶化，同时，小鼠 自身造血系统也在慢慢恢复，照后开始第14-18天为极期，在这个时间点，小鼠各项 生理机能最差。照后第18天或22天后小鼠各项血液指标逐渐恢复直至正常，因此在 18或22天及以后，各组的血液指标无显著差异。化合物组和阳性对照组能够促进各 细胞提前修复，即表明对辐射损伤有防护作用。
表5-7也有同样的规律，不再一一赘述。
表5照后1d-30d的小鼠红细胞计数
Figure BDA0003075723660000092
Figure BDA0003075723660000101
从表5可以看出，照后第10到18天，尼尔雌醇组和化合物高中低三组的小鼠红 细胞计数明显高于(P＜0.05)辐射对照组，且效果显著，表明本发明化合物至少提前8 天(18-10＝8)促进红细胞开始修复，对小鼠有较好的辐射防护作用。化合物组高中低 三个剂量组提升小鼠红细胞计数水平与阳性药相近，能达到阳性药相当的抗辐射作用。
表6照后1d-30d的小鼠血小板计数
Figure BDA0003075723660000102
从表6可以看出，照后第10到18天，尼尔雌醇组和化合物高中低三组的小鼠血 小板计数明显高于(P＜0.05)辐射对照组，且效果显著，表明本发明化合物至少提前8 天(18-10＝8)促进血小板开始修复，对小鼠有较好的辐射防护作用。化合物组高中低 三个剂量组提升小鼠血小板计数水平与阳性药相近，能达到阳性药相当的抗辐射作用。
表7照后1d-30d的小鼠血红蛋白含量
Figure BDA0003075723660000111
Figure RE-GDA0003144666130000111
通过上述小鼠照后的血象各指标分析，照后1-14天，辐射对照组小鼠的白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和血小板计数显著降低，说明在此期间，辐照对小鼠的造 血系统造成了严重损伤。给予了诸葛菜碱D的小鼠，在辐照后10-14天，这四项指标 明显升高，显著高于(P＜0.05)辐射对照组，与阳性对照组相当，说明诸葛菜碱D 能减轻因辐射引起的细胞损伤，使细胞提前开始修复，缓解由辐射引起的造血毒性， 具有良好的辐射防护作用。
以上实验例证明了诸葛菜碱D能提高HUVECs辐照后的存活率，能有效提高C57/BL小鼠辐照后的存活率并改善其血象指标，表明诸葛菜碱D能作为抗辐射药物应用。
由以上实验确定的有效剂量可推知，给予有需要的对象的剂量以诸葛菜碱D计为0.1-500mg/kg体重，优选为1-100mg/kg体重，更优选为5-50mg/kg体重，再优选为 25mg/kg体重。诸葛菜碱D可以是以诸葛菜碱D单体的形式给予的，也可以是以包含 诸葛菜碱D的植物提取物的形式给予的，还可以是以包含诸葛菜碱D的诸葛菜种子提 取物的形式给予的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进 和润饰也应视为本发明的内容。

Claims (16)

1.诸葛菜碱D在制备抗辐射损伤的药物中的应用，其特征在于，诸葛菜碱D的分子式为C16H18O4N6，化学结构式如式(1)所示：
Figure FDA0004034552830000011
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述诸葛菜碱D是从诸葛菜的种子中提取得到的生物碱类化合物。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述诸葛菜碱D是从包含诸葛菜碱D的植物中提取得到的生物碱类化合物。
4.根据权利要求1或2或3所述应用，其特征在于，所述诸葛菜碱D通过修复辐射损伤的细胞发挥抗辐射损伤作用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述辐射损伤为造血系统损伤。
6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物为含有所述诸葛菜碱D、其几何异构体、其药学上可接受的盐以及可药用载体或赋形剂的药物组合物。
7.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物为散剂、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、乳剂、注射剂、混悬剂、酊剂、栓剂。
8.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物的给药剂量以诸葛菜碱D计，为0.1-500mg/kg体重。
9.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物的给药剂量以诸葛菜碱D计，为1-100mg/kg体重。
10.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物的给药剂量以诸葛菜碱D计，为5-50mg/kg体重。
11.根据权利要求8-10任一所述应用，其特征在于，所述药物的给药方式为口服。
12.根据权利要求11所述应用，其特征在于，在辐照前24h和30min给予所述药物各一次。
13.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述诸葛菜碱D促进外周血白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板计数(PLT)、血红蛋白含量(HGB)至少提前4天开始修复。
14.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述诸葛菜碱D促进外周血白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板计数(PLT)至少提前8天开始修复。
15.根据权利要求1所述应用，其特征在于，给予所述药物后，人脐带静脉内皮细胞的照射后存活率在80％以上。
16.根据权利要求1所述应用，其特征在于，给予所述药物后，小鼠经8.0Gy的60Coγ射线照射后存活率在70％以上。
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