CN115227703A - 獐牙菜苦苷在制备预防放射性肠损伤的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了獐牙菜苦苷在制备预防放射性肠损伤的药物中的用途。本发明探究了獐牙菜苦苷对辐照后的肠上皮细胞以及小鼠的保护作用，证实其可以降低小鼠血液中炎性因子，减轻细胞内的活性氧以及超氧阴离子水平，减轻辐射后导致的肠上皮细胞中DNA损伤程度，并可以提高辐照后小鼠的生存率，在制备预防放射性肠损伤的药物中具有潜在应用价值。

Description

獐牙菜苦苷在制备预防放射性肠损伤的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及獐牙菜苦苷在制备预防放射性肠损伤的药物中的用途。

背景技术

放疗是盆腔腹部肿瘤的常规防治方法。然而，对于接受腹盆放疗的患者，小肠的位置限制了允许的照射剂量。而且，小肠对辐射非常敏感，大约五分之一接受放射治疗的患者会出现并发症：放射性肠损伤，造成功能丧失的后遗症和长期的患者生活质量损害。

放射性肠损伤表现为肠梗阻、便血、吸收和营养不良等临床症状。其病理表现以炎性反应为主，故也有临床医师称之为放射性肠炎，但实际上，放射性肠损伤的发病机制和病理改变均有别于细菌、病毒导致的肠道炎性反应，是由于直接或间接的放射线作用导致的细胞损伤，直接损伤主要是由于细胞直接吸收高量的辐射能造成，而间接损伤常是由于放射线与组织细胞内的水分子相互作用，产生自由基并引起DNA损伤和复制障碍导致的。

随着放疗的广泛应用，迫切需要放射性防护药物，以防止辐射引起的肠道损伤。不幸的是，相比辐射诱导的造血损伤，目前有效的预防放射性肠损伤的方法相对较少。因此发现一种副作用小的放射性肠损伤防护剂至关重要。

龙胆科獐牙菜属植物在全世界约有170多种，其中做药用的约有35种。獐牙菜苦苷(Swertimarin)为龙胆科(Gentianaceae)獐牙菜属(Swertia L.)植物中的主要成分之一，属于裂环环烯醚萜苷类化合物，结构如下。其主要来源于青叶胆(S.mileensis T.N.Ho etW.L.shi)和川西獐牙菜(Swertia davidi Franch)的干燥全草。

獐牙菜苦苷为淡黄色结晶，味极苦，在空气中有吸湿性。熔点113-114℃，旋光度-127°(c＝1，96％乙醇)。易溶于甲醇、乙醇、水，不溶于氯仿、石油醚。研究发现，獐牙菜苦苷有很好的抗炎作用，且具有预防糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、关节炎、疟疾和腹部溃疡等多种疾病的功效。然而，迄今为止还没有关于獐牙菜苦苷预防放射性肠损伤的系统研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供獐牙菜苦苷的新用途。

本发明提供了獐牙菜苦苷在制备预防放射性肠损伤的药物中的用途。

进一步地，上述獐牙菜苦苷的纯度不低于45％。

更进一步地，上述獐牙菜苦苷的纯度不低于95％。

进一步地，上述獐牙菜苦苷是：獐牙菜加乙醇回流提取，浓缩后，加水浸提得到的提取液干燥所得。

进一步地，上述獐牙菜苦苷是：獐牙菜加乙醇回流提取，浓缩后，加乙酸乙酯萃取，经硅胶柱洗脱纯化，干燥所得。

更进一步地，上述硅胶柱洗脱纯化所用的流动相为三氯甲烷和甲醇的混合液，三氯甲烷和甲醇体积比3:1。

进一步地，上述药物是以式I化合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

更进一步地，上述制剂是口服制剂。

进一步地，上述药物是抑制放射线引起的肠道细胞氧化应激、DNA损伤和/或减轻炎症的药物。

本发明的有益效果：本发明通过建立放射性肠损伤细胞和动物模型，从而探究獐牙菜苦苷对辐照后的肠上皮细胞以及小鼠的保护作用及可能的机制；在经电离辐照过后，獐牙菜苦苷可以降低小鼠血液中炎性因子，减轻细胞内的活性氧以及超氧阴离子水平，减轻辐射后导致的肠上皮细胞中DNA损伤程度，并可以提高辐照后小鼠的生存率，在制备预防放射性肠损伤的药物中具有潜在应用价值。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为獐牙菜苦苷对照品和45％獐牙菜苦苷提取物的HPLC谱图。

图2为獐牙菜苦苷对照品和95％獐牙菜苦苷提取物的HPLC谱图。

图3为獐牙菜苦苷显著降低ROS的水平图。

图4为獐牙菜苦苷显著降低超氧阴离子的水平图。

图5为獐牙菜苦苷显著降低DNA损伤的水平图。

图6为獐牙菜苦苷和其他药物对比的水平图。

图7为獐牙菜苦苷显著提高辐照后小鼠生存期的水平图。

图8为獐牙菜苦苷显著减轻辐照后小鼠小肠结构损伤的水平图。

图9为獐牙菜苦苷显著减轻辐照后小鼠血清中炎性因子的水平图。

具体实施方式

本发明獐牙菜苦苷可以是在市售厂商购买所得：商品化獐牙菜苦苷(Sigma,SMB00080,≥95％LC/MS-ELSD)，记作獐牙菜苦苷(Sigma)。

也可以按照如下方法制备：

1、取川西獐牙菜(Swertia davidi Franch)的干燥全草1000g，加8倍量90％乙醇浸泡60min，回流提取3次，每次1小时，乙醇量均为药材量的8倍，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，浓缩至浸膏(相对密度1.2，60℃)，2～8℃冷藏24小时，取出，加5倍量水搅拌，静置，5000rpm离心30min，取上清液，喷雾干燥，得到提取物，为淡黄色粉末，味苦，有吸湿性。

HPLC检测并确认提取物中獐牙菜苦苷的含量为45％(即獐牙菜苦苷纯度45％)，记作45％獐牙菜苦苷。

HPLC图谱如图1所示。

2、取干燥川西獐牙菜(Swertia davidi Franch)的干燥全草1000g，加8倍量90％乙醇浸泡60min，回流提取3次，每次1小时，乙醇量均为药材量的8倍，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，浓缩至浸膏(相对密度1.2，60℃)，2～8℃冷藏24小时，取出，加3倍量乙酸乙酯，搅拌，静置，过滤，取滤液，减压回收乙酸乙酯，得稠膏，加2倍量硅胶G，拌和均匀，烘干，上硅胶柱，三氯甲烷：甲醇＝3:1洗脱，TLC检查，收集洗脱液，减压回收混合溶剂，干燥，即得提取物，为淡黄色粉末，味苦，有吸湿性。

HPLC检测并确认提取物中獐牙菜苦苷的含量为95％(即獐牙菜苦苷纯度95％，能够达到市售产品的纯度标准)，记作95％獐牙菜苦苷或獐牙菜苦苷。

HPLC图谱如图2所示。

其余原料与设备除另有说明外均为已知产品，通过购买市售产品所得。

实施例1、本发明獐牙菜苦苷溶液剂的制备

取45％獐牙菜苦苷加生理盐水溶解，配制为溶液剂。

实施例2、本发明獐牙菜苦苷溶液剂的制备

取95％獐牙菜苦苷加生理盐水溶解，配制为溶液剂。

实施例3、本发明獐牙菜苦苷溶液剂的制备

取商品化獐牙菜苦苷(Sigma,SMB00080,≥95％LC/MS-ELSD)加生理盐水溶解，配制为溶液剂。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、獐牙菜苦苷对放射性肠损伤的预防作用

1、实验方法

1.1放射性损伤模型建立

制作放射性细胞损伤模型组：通过培养肠上皮细胞(HIEC)，在细胞融合度达70％-80％时通过X-RAD225生物辐照仪进行不同剂量辐照(剂量率2.0Gy/min，源靶距30cm)；制作放射性小鼠肠损伤模型组：给予12Gy钴60射线(58.9cGy/min)单次照射C57BL/6小鼠腹部。

1.2实验分组及给药

细胞实验：

(1)分为正常组、单纯辐照组、95％獐牙菜苦苷(自行提取的纯度95％獐牙菜苦苷和商品化市售的獐牙菜苦苷(sigma，纯度95％)，DMSO溶解，浓度50μg/mL)组。正常组：对细胞不做任何处理；单纯辐照组：通过X-RAD225生物辐照仪进行不同剂量辐照；95％獐牙菜苦苷(自行提取的95％獐牙菜苦苷和商品化市售的獐牙菜苦苷(sigma，纯度95％)，DMSO溶解，浓度50μg/mL)组：95％獐牙菜苦苷处理24h后，通过X-RAD225生物辐照仪进行不同剂量辐照；

(2)空白组(非辐照组)、辐照组(10Gy)、预防组(95％獐牙菜苦苷+10Gy)，氨磷汀组(氨磷汀+10Gy)，茶多酚组(茶多酚+10Gy)，白藜芦醇组(白藜芦醇+10Gy)(辐照剂量率均为200cGy/min)；

动物实验：

分为正常组、单纯辐照组、95％獐牙菜苦苷组(以实施例2的溶液剂给药，给药剂量以95％獐牙菜苦苷计100mg/kg)、45％獐牙菜苦苷组(以实施例1的溶液剂给药，给药剂量以45％獐牙菜苦苷计100mg/kg)。正常组：每天给小鼠灌胃200μL生理盐水；单纯辐照组；连续5天生理盐水灌胃处理后通过钴60进行辐照；95％獐牙菜苦苷组：连续5天獐牙菜苦苷灌胃处理后通过钴60进行辐照；45％獐牙菜苦苷组：连续5天獐牙菜苦苷灌胃处理后通过钴60进行量辐照。

1.3检测

1.3.1ROS检测：

取对数生长期细胞，将密度调整为3×10⁵个/孔接种至6孔板内，放入培养箱过夜至细胞贴壁完全。分组后对细胞进行辐照。辐照后24h，每个样品中加入1mLPBS清洗细胞后，每个孔加入1mL含有10μM的DCFH-DA探针的无血清培养基，摇匀，用锡箔纸包裹避光，放置在培养箱中孵育30min，每隔5min轻轻摇晃一次。孵育结束后，弃上清，加入1mLPBS清洗细胞，用胰酶消化细胞3min，随后终止消化，将细胞悬液移入1.5mLEP管内，室温离心4000g×4min，弃上清，加入300μLPBS重悬细胞，进行流式检测。

1.3.2超氧阴离子检测：

取对数生长期细胞，将密度调整为3×10⁵个/孔接种至6孔板内，放入培养箱过夜至细胞贴壁完全。分组后对细胞进行辐照。每个样品中加入1mLPBS清洗细胞后，每孔加入1mL含有1μL的

RedCM-H2Xros探针的无血清培养基，摇匀，用锡箔纸包裹避光，放置在培养箱中孵育30min，每隔5min轻轻摇晃一次。孵育结束后，弃上清，加入1mLPBS清洗细胞，用胰酶消化细胞3min，随后终止消化，将细胞悬液移入1.5mLEP管内，室温离心5000g×3min，弃上清，加入200μLPBS重悬细胞，进行流式检测。

1.3.3细胞DNA损伤水平检测：

细胞处理后，不同时间用激光共聚焦显微镜检测细胞DNA损伤水平，并进一步用Werstern Blot检测相关蛋白C-gas、Sting、p-Sting表达水平：细胞经95％獐牙菜苦苷处理及辐照后，收集细胞，lysisbuffer裂解提取蛋白，BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白含量，并统一稀释后在沸水中煮10min，室温冷却后，-80℃冰箱保存备用；根据待测蛋白分子的大小制备适宜浓度的SDS凝胶，加入蛋白样品及标准蛋白标志物，电泳分离蛋白质后，转印蛋白于硝酸纤维素膜。载有蛋白的硝酸纤维素膜经5％脱脂牛奶封闭后，加入C-gas、Sting、p-Sting及内参照β-Tubulin等一抗4℃过夜，经PBS换洗后，加相应二抗孵育，再经PBS换洗后曝光拍照。

1.3.4利用试剂盒检测经10Gy剂量X射线照射后，加药组与辐照组细胞内氧自由基ROS的水平；通过免疫荧光实验测定经辐照后不同时间点，空白组、加药预处理组和单纯辐照组小肠细胞内γH2AX的数量，确定不同处理条件下小肠细胞内的DNA损伤情况；利用WesternBlot检测X射线照射后加药组与单纯辐照组细胞内cGAS-STING通路的相关蛋白表达量。(*P<0.05,*P<0.01,***P<0.001)。

1.3.5辐照方式：12Gy钴60射线(58.9cGy/min)单次照射C57BL/6小鼠腹部。辐照后每天记录小鼠死亡情况。

1.3.6辐照方式：15Gy X(200cGy/min)射线单次照射C57BL/6小鼠腹部。辐照后24h断颈处死小鼠，解剖取小肠组织样本，通过石蜡包埋切片、HE染色、组化染色观察肠组织结构的变化。

1.3.7辐照方式：15Gy X(200cGy/min)射线单次照射C57BL/6小鼠腹部。我们通过采集小鼠血液，并分离出血清，利用ELISA试剂盒检测X射线照射后95％獐牙菜苦苷预防组与单纯辐照组血清中的IL-8，TNF-α，IL-6，IL-1炎性因子的水平变化。

2、实验结果

2.1獐牙菜苦苷对X线辐照的小肠组织细胞ROS的影响

图3表明，不同剂量X射线辐照后，95％獐牙菜苦苷预防组细胞内ROS水平显著比单纯辐照组低(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)，其中，图3A为前述自行提取得到的含有獐牙菜苦苷的提取物(獐牙菜苦苷纯度95％)的结果；图3B为商品化獐牙菜苦苷(Sigma,SMB00080,≥95％LC/MS-ELSD)的结果，结果提示无论是自行提取制备的还是购买的市售獐牙菜苦苷，均可以抑制X线辐照引起的氧化应激。

2.2獐牙菜苦苷对X线辐照的小肠组织细胞超氧阴离子的影响

图4表明，不同剂量X射线辐照后，95％獐牙菜苦苷预防组细胞内超氧阴离子水平显著比单纯辐照组低(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)，提示獐牙菜苦苷可以抑制X线辐照引起的氧化应激。

2.3獐牙菜苦苷对X线辐照后HIEC细胞DNA损伤的影响

由图5可以看出，辐照后细胞DNA损伤增加，C-gas、Sting、p-Sting的相对表达水平增加。而95％獐牙菜苦苷处理组细胞DNA损伤减少，其中，图5A为自行提取得到的含有獐牙菜苦苷的提取物(獐牙菜苦苷纯度95％)的结果；图5B为商品化獐牙菜苦苷(Sigma,SMB00080,≥95％LC/MS-ELSD)的结果。与辐照组相比，獐牙菜苦苷处理组C-gas、Sting、p-Sting的相对表达水平减少。提示无论是自行提取制备的还是购买的市售獐牙菜苦苷，均可以减少辐照引起的HIEC细胞的DNA损伤(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

2.4獐牙菜苦苷和其他药物的效果对比：图6A表明，不同剂量X射线辐照后，加药组细胞内ROS水平显著比单纯辐照组低；图6B表明加药预处理组在经辐照后0h和1h时，细胞内γH2AX的数量显著的少于单纯辐照组，且单纯辐照组细胞内γH2AX数量随着辐照后时间的增加而呈现减少的趋势，这说明可能在辐照后1小时细胞自身的修复机制开始发挥作用，对DNA进行了一定程度的修复。图6C表明X射线照射后加药组细胞内cGAS-STING通路中的重要蛋白C-gas、Sting表达量与单纯辐照组相比，呈现为显著降低的趋势，氨磷汀组，茶多酚组，白藜芦醇组磷酸化Sting表达量有所升高。

2.5獐牙菜苦苷对钴60辐照的小鼠生存期的影响

图7表明在辐照之后，单纯辐照组30天的生存率为20％；45％獐牙菜苦苷组30天的生存率为78％；95％獐牙菜苦苷组30天生存率为61％(n＝小鼠只数)。加药组的生存率要明显高于单纯辐照组(*P<0.05,*P<0.01,***P<0.001)。

2.6獐牙菜苦苷对X线辐照的小鼠肠组织的影响

图8A表明经15Gy X射线辐照后，95％獐牙菜苦苷预防组小肠表现出炎性浸润，绒毛变短，绒毛结构受损的程度显著低于单纯辐照组；图8B表明辐照后，獐牙菜苦苷预防组小鼠肠组织Ki67的表达量显著高于单纯辐照组。

2.7图9表明经15GyX射线辐照后95％獐牙菜苦苷预防组血清内IL-8，TNF-α，IL-6水平(图9A，B，C)显著低于单纯辐照组，血清内IL-1水平并没有明显趋势(图9D)。说明獐牙菜苦苷可以延缓经辐照导致的炎性反应(图9；(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

综上，本发明通过建立放射性肠损伤细胞和动物模型，从而探究獐牙菜苦苷对辐照后的肠上皮细胞以及小鼠的保护作用及可能的机制；在电离辐照条件下，獐牙菜苦苷可以降低小鼠血液中炎性因子，减轻细胞内的活性氧以及超氧阴离子水平，减轻辐射后导致的肠上皮细胞中DNA损伤程度，并可以提高辐照后小鼠的生存率，在制备预防放射性肠损伤的药物中具有潜在应用价值。

Claims (9)

1.獐牙菜苦苷在制备预防放射性肠损伤的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述獐牙菜苦苷的纯度不低于45％。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述獐牙菜苦苷的纯度不低于95％。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述獐牙菜苦苷是：獐牙菜加乙醇回流提取，浓缩后，加水浸提得到的提取液干燥所得。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述獐牙菜苦苷是：獐牙菜加乙醇回流提取，浓缩后，加乙酸乙酯萃取，经硅胶柱洗脱纯化，干燥所得。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述硅胶柱洗脱纯化所用的流动相为三氯甲烷和甲醇的混合液，三氯甲烷和甲醇体积比3:1。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是以式I化合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述制剂是口服制剂。

9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是抑制放射线引起的肠道细胞氧化应激、DNA损伤和/或减轻炎症的药物。

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