CN109238797A - 一种蝴蝶兰冰冻切片处理方法 - Google Patents

Abstract

本申请植物组织解剖技术领域，具体涉及一种蝴蝶兰冰冻切片处理方法。该方法包括包括组织采样、组织预处理、液氮快速冷冻、冷台固定、冰冻切片、展片、染色、观察和拍照等操作步骤。初步应用效果表明，利用本申请所提供冷冻切片方法进行实际操作时，可获得组织显微结构较完整的切片，并可获得较清晰的蝴蝶兰叶、根、花器官等组织切片图，从而为蝴蝶兰组织结构的观察和研究、以及原位杂交及亚细胞定位等分子技术的应用奠定基础。本申请相关预处理方式的改进，较好降低了冷冻处理过程中植物组织冰晶产生几率。本申请也为其他兰科植物组织的冷冻切片处理方法提供了较好借鉴和参考。

Description

一种蝴蝶兰冰冻切片处理方法

技术领域

本申请植物组织解剖技术领域，具体涉及一种蝴蝶兰冰冻切片处理方法。

背景技术

蝴蝶兰（Phalaenopsis）为兰科蝴蝶兰属，单子叶植物，其叶片较大、稍肉质，腹面近墨绿色。具有圆润粗大的根，其较粗的根既有吸收环境中营养和水分的作用，还能进行生长和光合作用。蝴蝶兰茎很短，常被叶鞘所包，称为假鳞茎。花序侧生于茎的基部，花序柄绿色，常具数朵由基部向顶部逐朵开放的花。花苞片卵状三角形，长3-5毫米。中萼片近椭圆形，长2.5-3厘米，宽1.4-1.7厘米，先端钝，基部稍收狭，具网状脉。侧萼片歪卵形，先端钝，基部收狭并贴生在蕊柱足上，具网状。花瓣菱状圆形，长2.7-3.4厘米，宽2.4-3.8厘米，先端圆形，基部收狭呈短爪，具网状脉。唇瓣3裂，基部具爪，侧裂片直立，倒卵形，先端圆形或尖锐，基部收狭，具红色斑点或细条纹，在两侧裂片之间和中裂片基部相交处具一枚黄色肉突。中裂片似菱形，先端渐狭且具有卷须，基部契形。蕊柱粗壮，长约1厘米，具有宽的蕊柱足，花粉团2个，近球形，雌雄同株，花期4-6月。

对蝴蝶兰的形态解剖研究表明，其叶脉为平行脉序，维管束与上、下表皮之间发育成厚壁细胞，这些厚壁组织构成机械组织。其根的基本结构包括表皮、皮层、中柱三部分；表皮为多层，构成根被；紧挨根被的是外皮层，由排列紧密的薄壁细胞组成；表皮脱落后，外皮层栓质化起保护作用；往内是中皮层，由排列疏松的皮层薄壁细胞组成的；紧挨内皮层细胞的是一层似“马蹄形’的凯氏带，有少数通道细胞细胞壁的木质化不加厚，进行皮层和维管柱之间的物质交换和信息交流。

冰冻切片技术是一种将生物组织在低温下迅速冷冻达到一定硬度再进行切片的一种实验技术。该技术虽然是研究生物组织结构的一种常用技术，但由于该技术在操作过程中的冷冻要求，使得该技术并非适用于所有植物组织材料，其主要原因在于植物细胞具有细胞壁和液泡，含有大量的水分，低温速冻处理过程中这些水分容易生成冰晶并进而发生细胞破裂等结构性破坏，进而使得切片易碎，想获得较完整的切片非常困难。而随着植物冷冻处理技术的进步，使得冷冻切片技术在植物组织结构研究、分析中的应用也取得了一定进展。而就蝴蝶兰的组织结构研究而言，由于蝴蝶兰生长环境的高温、高湿特性要求，使得蝴蝶兰组织细胞中含水率普遍偏高，因此也使得冷冻切片技术是否适用于蝴蝶兰的组织结构分析是存在较大不确定性的，也是需要慎重进行研究和分析的。

发明内容

本申请以蝴蝶兰为例，目的在于提供一种适合兰科植物组织的冰冻切片处理方法，从而为冷冻切片技术在兰科植物组织结构分析中的应用奠定基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种蝴蝶兰冰冻切片处理方法，该方法具体包括如下处理步骤：

（1）待处理组织取样，并进行预处理

对目标组织进行取样，并进行整形处理，切成合适尺寸小块；所述目标组织具体例如为蝴蝶兰新鲜幼苗期（一年生）的叶片或气生根，或者生长良好盛花期的花柄、花萼、唇瓣或合蕊柱等组织，具体整形处理方式为：将样品洗净擦干后，用锋利的刀片将气生跟组织迅速切成1cm的小段，将叶片组织切成0.2cm×1cm的小块；将花柄修整成长1cm、横切，将花萼修整成长1cm×宽0.5cm、纵切，将唇瓣修整成长0.8cm×宽0.5cm、纵切，将合蕊柱横切修整；

对整形处理后组织样品，利用含蔗糖保护液进行预处理，以降低后续冷冻过程中植物组织产生结晶的几率；

所述含蔗糖保护液中，蔗糖浓度为4~16%；具体预处理方式为：

将蝴蝶兰叶片组织样品置于蔗糖-PBS保护液（蔗糖浓度优选为16%）中处理20~40min（优选处理30min），然后抽真空（至无气泡冒出为止），将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液（浓度0.2M，缓冲液pH7.4）浸洗处理（浸洗2~4次，每次3~8min），浸洗结束后抽真空以去除浸洗液；

将气生根组织样品置于蔗糖-PBS保护液（蔗糖浓度优选为4%）中处理20~40min（优选处理30min），然后抽真空（至无气泡冒出为止），将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液（浓度0.2M，缓冲液pH7.4）浸洗处理（浸洗2~4次，每次3~8min），浸洗结束后抽真空以去除浸洗液；

将花器官组织（花柄、花萼、唇瓣、合蕊柱）样品置于蔗糖-PBS保护液，（花柄、唇瓣优选采用4%蔗糖浓度，花萼优选采用8%蔗糖浓度，合蕊柱优选采用16%蔗糖浓度）中处理30~60min（优选处理60min），然后抽真空（至无气泡冒出为止），将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液（浓度0.2M，缓冲液pH7.4）浸洗处理（浸洗2~4次，每次3~8min）；

（2）冷冻处理，并进行包埋处理

将步骤（1）中蔗糖-PBS处理后组织样品置于液氮中，液氮速冻20~30s；

然后，在-15 ~ -25℃条件下（优选-20℃），利用OCT或普通胶水包埋15~30min（优选20min）；

（3）冷冻切片

将步骤（2）中包埋处理样品切片操作时，叶片组织切片厚度为10~20μm（优选15μm），气生根组织切片厚度为10~20μm（优选20μm）；花柄组织切片厚度为10~20μm（优选15μm）；花萼组织切片厚度为10~20μm（优选10μm）；唇瓣组织切片厚度为10~20μm（优选20μm）；花柱组织切片厚度为10~20μm（优选10μm）；

为便于后续研究、观察，可进一步对步骤（3）中冷冻切片进行展片、染色及拍照操作，具体而言：

打开放卷板，对步骤（3）中的切片进行展片，观察组织的超微结构；

染色操作时，直接对切片进行番红单染色、固绿单染色或者番红-固绿双重染色；

叶片组织、气生根组织、合蕊柱，优选采用番红-固绿双重染色；花柄、花萼、唇瓣优选采用番红单染色；

所述番红-固绿双重染色（番红-固绿复染）（常温下染色），具体方法是：向展开的材料用质量分数1%的番红水溶液染色15~30min（叶片组织和气生根组织优选25min，合蕊柱组织优选为15min），用蒸馏水洗涤4次，再用质量分数为0.1%的固绿染色20s，用质量分数为95%的乙醇或蒸馏水冲洗固绿至材料不褪色为止，之后在材料表面上滴加质量分数为50%的甘油，盖上盖玻片；

番红单染色时，染色处理时间优选为20min；

染色结束后，观察蝴蝶兰组织冷冻切片的显微结构，并拍照保存。

本申请属于一种蔗糖保护-液氮冷冻的冰冻切片法，利用本申请所提供的蝴蝶兰冷冻切片处理方法对组织显微结构进行研究时，包括组织采样、组织预处理、液氮快速冷冻、冷台固定、冰冻切片、展片、染色、观察和拍照等操作步骤。初步应用效果表明，利用本申请所提供冷冻切片方法进行实际操作时，可获得组织显微结构较完整的切片，并可获得较清晰的蝴蝶兰叶、根、花器官等组织切片图，从而为蝴蝶兰组织结构的观察和研究、以及原位杂交及亚细胞定位等分子技术的应用奠定基础。

总体而言，本申请中，发明人以蝴蝶兰幼嫩叶、根以及花器官为例，对冷冻切片技术中的预处理、冷台固定、冷冻切片等关键性操作参数进行了优化，建立了一种适用于蝴蝶兰组织显微结构观察和研究的冷冻切片方法。尤其是相关预处理方式的改进，较好降低了冷冻处理过程中植物组织冰晶产生几率，从而为后续冷冻切片奠定了良好基础。另一方面，在本申请所提供冷冻切片处理方法基础上，也为其他兰科植物组织的冷冻切片处理方法提供了较好借鉴和参考。因此使得本申请所提供相关技术方案具有较好实用价值和推广应用意义。

附图说明

图1为不同冷凝温度对蝴蝶兰冰冻切片的效果比较，其中A、B、C分别为叶片组织-15℃、-20℃、-25℃冷凝20min处理后组织观察结果；D、E、F分别为气生根组织-15℃、-20℃、-25℃冷凝20min处理后组织观察结果；

图2为不同切片厚度对蝴蝶兰冰冻切片的效果比较，其中A、B、C分别为叶片组织10μm、15μm、20μm切片厚度观察结果；D、E、F分别为气生根组织10μm、15μm、20μm切片厚度观察结果；

图3为花器官中不同结构最适切片厚度（×10）情况下观察图；其中A、B、C、D分别为：花柄15μm、花萼 10μm、 唇瓣 20μm、花柱 10μm观察图；

图4为不同番红染色时间对蝴蝶兰根、叶冰冻切片的效果比较，其中A、B分别为叶片组织染色15min、25min观察结果；C、D分别为气生根组织染色15min、25min观察结果；

图5为花器官不同结构最适染液情况观察图；其中A、B、C、D分别为：花柄、花萼、唇瓣、花柱观察图；

图6为蝴蝶兰叶片和根的解剖结构观察结果，其中：1 叶片横切面（4×10）；2 下表皮横切面（40× 10）；3 叶片横切面（40×10）；4 根横切面（4×10）；5 维管柱结构（10×10）；6根被结构（40×10）；A 表皮、B 气孔、C 维管束、D 内皮层、E 初生韧皮部、F初生木质部、G表皮；

图7为蝴蝶兰花不同结构的最适处理后观察图，其中A、B、C、D分别为：花柄、花萼、唇瓣、合蕊柱观察图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

实验材料：

下述实施例中所采用的蝴蝶兰新鲜幼苗期（一年生）的叶片和根，生长良好盛花期的花柄、花萼、唇瓣和合蕊柱等组织样品，均采自郑州师范学院生物工程研究所智能日光温室，属于一种十分常见的样品材料；

实验试剂：

实施例中所涉及实验试剂均为常见试剂，具体包括：

70%乙醇、95%乙醇； 10%甘油；15%甘油；50%甘油；1%番红水溶液，0.1%固绿乙醇溶液（95%乙醇配制）；

FAA 固定液（90mL70%酒精+5mL冰醋酸+5mL福尔马林）；

Leica OCT冰冻包埋剂，普通胶水（得力品牌）；

蔗糖-PBS保护液（蔗糖质量百分含量根据需要确定，实施例中具体涉及有4%、8%、16%质量百分含量）；

实验仪器：

Leica-CM1950型恒冷切片机，尼康80 i显微成像系统、LEICA DM2500（数码正置显微镜DM2500），均为实验领域常用仪器设备。

实施例

以蝴蝶兰新鲜一年生幼苗期的叶片、气生根、花器官（包括花柄、花萼、唇瓣和合蕊柱）等组织为例，对本申请所提供的蝴蝶兰冰冻切片处理方法简要介绍如下。

（一）待处理组织取样，并进行预处理

分别取幼嫩的蝴蝶兰气生根和叶片若干，生长良好盛花期的花柄、花萼、唇瓣或合蕊柱等组织若干，洗净擦干后进行整形处理，具体而言：

用锋利的刀片迅速切成1cm的小段，叶片洗净后切成0.2cm×1cm的小块；将花柄修整成长1cm、横切，将花萼修整成长1cm×宽0.5cm、纵切，将唇瓣修整成长0.8cm×宽0.5cm、纵切，将合蕊柱横切修整。

为便于对比表明不同预处理方式对于后续切片影响，发明人设计了若干不同预处理方式作为对照，具体设置情况如下：

（1）将上述样品小块置于FAA固定液中固定3h，然后利用真空泵抽真空获得处理后材料，将所得材料用双蒸水清洗4次，确保清洗干净乙醇；

（2）将上述样品小块直接用清水浸泡处理10min，然后取出置于20℃培养箱中放置2h，以使水充分渗透到组织内；

（3）将上述样品小块先用70%酒精处理30min，再将叶片小块转入10%的甘油中浸泡处理2h，而将气生根小块置于15%的甘油溶液浸泡处理2h；最后利用真空泵抽真空后获得处理后材料；

（4）将上述样品小块分别用不同蔗糖质量浓度的固定液处理，具体而言：

将蝴蝶兰组织样品置于蔗糖-PBS保护液（蔗糖质量浓度分别为4%、8%、16%）中处理30min，然后抽真空（至无气泡冒出为止），将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液（浓度0.2M，缓冲液pH7.4）浸洗处理（浸洗3次，每次2min），浸洗结束后可放入浸洗液中4℃保存备用；

气生根组织处理方式同叶片组织处理方式；

将花器官组织（花柄、花萼、唇瓣或合蕊柱）样品置于蔗糖-PBS保护液保护液中处理60min，然后抽真空（至无气泡冒出为止），将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液（浓度0.2M，缓冲液pH7.4）浸洗处理（浸洗3次，每次3min），浸洗结束后可放入浸洗液中4℃保存备用。

对上述不同处理方式处理后样品直接进行冷冻切片观察（切片及观察方式参考后文描述及常规操作即可），结果如下：

（1）FAA处理后样本，由于后续需要用蒸馏水清洗多次，这种操作使得后续切片时切片易碎，无法有效观察，而且即使不发生破碎，观察结果表明，这种处理方式的冷冻切片中，蝴蝶兰叶片表皮和叶肉也不完整，效果较差。

（2）采用清水处理后的冷冻切片观察结果表明，清水处理的冷冻切片，植物组织破损程度较大，并且表皮、皮层薄壁组织以及维管束结构均会受到不同程度的破碎，无法准确反映组织结构特性。

（3）70%酒精及甘油处理后冷冻切片观察结果表明，这种处理方式后组织细胞内膜系统损伤严重，使得该方式也无法较好用于蝴蝶兰组织分析。

（4）对蔗糖-PBS保护液处理后组织的冷冻切片观察结果表明，植物叶的表皮、气孔及维管束，根的皮层和中柱鞘等结构较为清晰，可较好反映组织结构特性；进一步对不同蔗糖浓度处理结果观察对比表明：

根用4%的蔗糖溶液保护后，其表皮和维管柱结构更易观察，叶片用16%的蔗糖溶液渗透处理后，观察到的气孔、表皮、维管束效果更好；而8%浓度蔗糖处理跟或叶片组织时，在观察维管束结构或叶片表皮细胞时均存在一定细胞结构破损或模糊不清的缺陷；

花柄经过4%的蔗糖磷酸缓冲液浓度预处理后，观察效果最为清晰；而花萼更适合用8%的蔗糖磷酸缓冲液浓度预处理；唇瓣在4%的蔗糖磷酸缓冲液浓度下观察得到的图片更加清晰；合蕊柱在16%的蔗糖磷酸缓冲液浓度下，图片更清晰（部分最佳结果如图5、图6所示）。

（二）冷冻处理，并进行包埋处理

在上述确定最适预处理方式基础上，按照上述步骤（一）种操作，分别对16%的蔗糖溶液（蔗糖-PBS保护液，蔗糖质量浓度16%）处理后叶片组织、4%的蔗糖溶液（蔗糖-PBS保护液，蔗糖质量浓度4%）处理后气生根组织、4%的蔗糖溶液（蔗糖-PBS保护液，蔗糖质量浓度4%）处理后花柄组织、8%的蔗糖溶液（蔗糖-PBS保护液，蔗糖质量浓度8%）处理后花萼组织、4%的蔗糖溶液（蔗糖-PBS保护液，蔗糖质量浓度4%）处理后唇瓣组织、16%的蔗糖溶液（蔗糖-PBS保护液，蔗糖质量浓度16%）处理后合蕊柱组织进行包埋处理。

但为确定不同包埋剂对后续冷冻切片影响，发明人分别以OCT包埋剂、普通胶水（得力品牌）和双蒸水作为包埋剂，对步骤（1）中预处理后组织样品进行包埋，具体处理方式为：

首先，将步骤（1）中预处理后组织样品置于液氮中，液氮速冻25s（可室温回温30s后再进行后续操作，也可直接进行后续操作）；

其次，将包埋剂（OCT包埋剂、普通胶水、双蒸水）滴在样品托上，分别在-15℃、-20℃、-25℃环境中包埋冷凝20min，待冷冻完全时进行修片。

对不同包埋处理方式的组织样品进行切片对比（染色及观察方式参考后文描述及常规操作即可），结果表明：

以水直接做包埋剂处理时，难以切出整体清晰的切片，其中植物表皮、表皮毛和叶肉细胞组织破损较多；

而OCT包埋剂和普通胶水作为包埋剂应用时，均能较为清晰的观察到叶片的表皮、气孔以及根的表层细胞组织、木质部和薄壁组织等结构；但考虑后续染色操作时，由于采用普通胶水包埋处理后，染色前需先用温水进行冲洗，不然不易染色，因此使得采用普通胶水作为包埋剂时仍然存在一定不便性。

而对不同包埋温度处理方式下切片进行观察，结果如图1所示。结合观察统计情况及对图1进行分析可以看出：

在-15℃条件下包埋处理时，包埋块易脱落，此种方式处理后切片的叶片气孔和叶肉细胞的细胞核不易观察(图1A)，而根的横切面结构被挤压变形（图1D)；

-20℃条件下处理时，叶片的表皮、气孔和叶肉细胞较为完整（图1B)，可以较清晰地观察到根的表皮、皮层以及中柱鞘等植物显微结构（图1E)；

-25℃条件下处理时，切片叶片表皮结构以及叶肉细胞严重破损（图1C)，根的维管束结构不易观察，且外皮层些许丢失(图1F)。

类似的，蝴蝶兰花柄，花萼、唇瓣和合蕊柱在-20℃条件下进行包埋处理时，其包埋块不易脱落，切片完整，组织结构清晰。

（三）冷冻切片

参考步骤（一）、步骤（二）优化操作方式，将16%的蔗糖溶液处理后叶片组织和合蕊柱组织，4%的蔗糖溶液处理后气生根组织、花柄组织、唇瓣组织，16%的蔗糖溶液处理后花萼组织，分别采用OCT包埋剂-20℃包埋冷凝20min处理后，进行切片。

切片操作时，在不同切片厚度条件（10μm、15μm、20μm）下进行冷冻切片（切片过程中，冷凝温度为-20℃）。

对不同切片厚度观察对比结果如图2、图3所示（染色时间番红单染25min固绿单染5min，番红固绿复染25min），具体而言：

对于叶片组织，切片厚度为10μm时，可明显观察到表皮的气孔结构，但植物叶片的上下表皮和根的中皮层易碎(图2A)，很难得到完整的切片；切片厚度为15μm，可明显观察到叶片表皮、气孔以及维管束，效果最好(图2B)，适于作为蝴蝶兰叶片切片厚度；切片厚度为20μm时，叶肉细胞严重重叠，但叶脉清晰（图2C）；

对于气生根组织，切片厚度为20μm时，根的表皮和凯氏带等结构更易观察（图2F)；

切片厚度10μm时，根的中皮层破损，且维管束不易观察（图2D)；切片15μm时，其维管束结构模糊，细胞结构不清晰（图2E)；

对与花器官：

花柄的最适切片厚度为15μm（图3A）；10μm的花柄切片厚度容易碎，而且很容易卷缩；20um的花柄切片厚度虽然容易展片，却因为切片厚度较厚而使切片模糊，不易得到好的切片；

花萼的最适厚度为10μm（图3B），在10μm的切片厚度观察花萼效果较好；而在15μm、20μm的切片厚度均不能得到理想的效果；

唇瓣的最适厚度20μm（图3C）；在10μm、15μm的厚度下，一是因为切碎了，不易展片，二是因为观察的适合得不到清晰完整的图片；

花柱的最适切片厚度10μm（图3D）；15μm、20μm的切片厚度不清晰、模糊、重叠。

（四）展片、染色、观察及拍照

对步骤（三）中的切片，发明人进一步进行了展片，通过观察不同处理方式下的超微结构以确定不同处理方式对切片效果影响情况；进一步地，对切片进行染色并拍照，以进一步分析相关组织结构情况，具体操作过程简介如下：

打开放卷板，展片，观察组织的超微结构；

染色操作时，不同组织切片进番红单染色、固绿单染色或者番红-固绿双重染色；

所述番红-固绿双重染色（番红-固绿复染）（常温下染色），具体方法是：向展开的材料用质量分数1%的番红水溶液染色15-25min，用蒸馏水洗涤4次，再用质量分数为0.1%的固绿染色20s，用蒸馏水冲洗固绿至材料不褪色为止，之后在材料表面上滴加质量分数为50%的甘油，盖上盖玻片；

番红单染色时，染色处理时间为20min，固绿单染色时，染色时间为5min。

染色结束后，观察蝴蝶兰组织冷冻切片的显微结构，并拍照保存。

对于不同染色处理后样品观察结果表明：对于15μ m切片厚度的叶、以及20 μ m厚度的根，用质量分数为1%的番红溶液染色25min处理时，叶片的表皮、叶脉、叶肉以及根的表层组织细胞、维管束结构等更易清晰观察；花柄、花萼、唇瓣的最适染液为番红，染色时间为20min；合蕊柱的最适染液为番红固绿双重染色，染色时间为15分钟。具体效果如图4、图5所示。

（五）对蝴蝶兰组织的具体微观特征观察

在上述部分参数优化基础上，发明人对蝴蝶兰叶片、根和花器官组织进行了具体处理，并就蝴蝶兰叶片、根和花器官的具体微观组织特征进行了观察，具体过程简要介绍如下。

（1）组织取样，并进行预处理

分别取幼嫩的蝴蝶兰气生根和叶片若干，生长良好盛花期的花柄、花萼、唇瓣或合蕊柱等组织若干，洗净擦干后，用锋利的刀片迅速切成1cm的小段，叶片洗净后切成0.2cm×1cm的小块；将花柄修整成长1cm、横切，将花萼修整成长1cm×宽0.5cm、纵切，将唇瓣修整成长0.8cm×宽0.5cm、纵切，将合蕊柱横切修整。

将叶片组织样品小块用16%质量分数的蔗糖溶液（蔗糖-PBS保护液，蔗糖质量浓度为16%）处理30min，然后抽真空；将所得材料再用含有相同蔗糖浓度（16%）的磷酸缓冲液（浓度0.2M，缓冲液pH7.4）浸洗处理（浸洗3次，每次8min）；

将气生根组织样品样品小块用4%质量分数的蔗糖溶液（蔗糖-PBS保护液，蔗糖质量浓度为4%）处理30min，然后抽真空；将所得材料再用含有相同蔗糖浓度（16%）的磷酸缓冲液（浓度0.2M，缓冲液pH7.4）浸洗处理（浸洗3次，每次8min）。

将花器官组织（花柄、花萼、唇瓣、合蕊柱）样品置于蔗糖-PBS保护液（花柄、唇瓣采用4%蔗糖浓度，花萼采用8%蔗糖浓度，合蕊柱采用16%蔗糖浓度）中处理60min，然后抽真空（至无气泡冒出为止），将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液（浓度0.2M，缓冲液pH7.4）浸洗处理（浸洗4次，每次3min）。

（2）冷冻处理，并进行包埋处理

将步骤（1）中蔗糖处理后组织样品置于液氮中，液氮速冻25s；

然后，在-20℃条件下，利用OCT包埋20min。

（3）冷冻切片

将步骤（2）中包埋处理样品回温30s后进行切片操作。切片操作时，叶片组织切片厚度为15μm，气生根组织切片厚度为20μm；花柄切片厚度为15μm；花萼切片厚度为10μm；唇瓣切片厚度20μm；花柱切片厚度为10μm。

（4）展片、染色、观察及拍照

打开放卷板，对步骤（3）中的切片进行展片，观察组织的超微结构；

染色操作时，对切片进行染色，对叶片组织、气生根组织、合蕊柱采用番红-固绿双重染色（番红-固绿复染），对花柄、花萼、唇瓣采用番红单染色；

番红-固绿复染（常温下染色）具体方法是：向展开的材料用质量分数1%的番红水溶液染色（叶片组织和气生根组织为25min，合蕊柱组织为15min），用蒸馏水洗涤4次，再用质量分数为0.1%的固绿染色20s，用质量分数为95%的乙醇冲洗固绿至材料不褪色为止，之后在材料表面上滴加质量分数为50%的甘油，盖上盖玻片；

番红单染色时，染色处理时间为20min；

染色结束后，观察蝴蝶兰组织冷冻切片的显微结构，并拍照保存。具体结果如图6、图7所示。

对图6进行分析，具体可以看出：从宏观上看，蝴蝶兰叶大致可分为表皮、叶肉、叶脉；叶片上表皮的细胞大致近圆形(图6A)，有似“V”形的泡状薄壁细胞，这些紧密连接的细胞参与叶的卷曲和舒展活动，气孔多存在于下表皮（图6B）。蝴蝶兰的叶片属于等面叶，叶肉组织无海绵组织和栅栏组织的分化。叶肉细胞呈多边形，无胞间隙。叶片维管束有大小维管束之分，每个大小维管束周围均有一两层维管束鞘（图6C)；常见机械组织。

蝴蝶兰根较粗壮，横切面上由根被、皮层及中柱构成。根被外存在少许根毛，根被细胞较大，联系紧密，排列规则，形似“花环”结构(图6G)；外皮层由多层细胞构成，细胞壁栓化加厚；中皮层占很大面积，内皮层横向壁、径向壁、内切向壁形成明显木栓化的加厚区域（图6D），凯氏带呈马蹄状，也有少数薄壁的通道细胞交错排列；内皮层包括中柱鞘、木质部、韧皮部、薄壁组织等结构。维管束为外始式发育方式，即木质部在上，韧皮部在下(图6E)。

而对图7进行分析可以看出，即使蝴蝶兰的同一器官，但组织结构对固定液浓度、切片厚度以及染液种类的适用性也存在一定差异。

总体上，现有技术中虽然对于冷冻切片技术进行了部分研究，但由于植物组织细胞成分的差异性，使得该技术在适用不同植物结构分析时，往往缺乏一定可借鉴性。例如，为减少组织细胞中冰晶形成，有些植物组织适合以甘油进行预处理，而有些植物适合采用蔗糖溶液预处理；而即使是同样采用蔗糖进行预处理，但不同蔗糖浓度对于后续冷冻效果影响也是不同的，过高浓度蔗糖处理时，会使细胞易皱缩变形，而浓度过低时，又无法阻挡冰晶产生，因此不同植物组织应用时也往往需要重新设计。

总之，本申请针对蝴蝶兰的部分组织结构的冷冻切片方法进行了具体细化研究，获得了基本结构较完整的叶片组织、根组织及其花器官的冷冻切片，可为蝴蝶兰组织结构研究、以及原位杂交及亚细胞定位等分子技术的应用奠定基础，同时也为冷冻切片技术在其他兰科植物组织分析中的应用提供了较好参考和借鉴。

Claims (8)

1.一种蝴蝶兰冰冻切片处理方法，其特征在于，该方法包括如下处理步骤：

（1）待处理组织取样，并进行预处理

对目标组织进行取样，并进行整形处理，切成合适尺寸小块；所述目标组织具体为蝴蝶兰幼苗期的叶片或气生根，或者生长良好盛花期的花柄、花萼、唇瓣或合蕊柱组织；

对整形处理后组织样品，利用含蔗糖保护液进行预处理；

所述含蔗糖保护液中，蔗糖浓度为4~16%；具体预处理方式为：

将蝴蝶兰叶片组织样品置于蔗糖-PBS保护液中处理20~40min，然后将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液浸洗处理；

将气生根组织样品置于蔗糖-PBS保护液中处理20~40min，然后将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液浸洗处理；

将花器官组织中的花柄、花萼、唇瓣或合蕊柱样品置于蔗糖-PBS保护液中处理30~60min，将所得材料再用含有相同蔗糖浓度的磷酸缓冲液浸洗处理；

（2）冷冻处理，并进行包埋处理

将步骤（1）中蔗糖处理后组织样品置于液氮中，液氮速冻20~30s；

然后，在-15 ~ -25℃条件下，包埋15~30min；

（3）冷冻切片

将步骤（2）中包埋处理样品切片操作时，各组织切片厚度均为10~20μm。

2.如权利要求1所述蝴蝶兰冰冻切片处理方法，其特征在于，对步骤（3）中冷冻切片进行展片、染色及拍照操作，具体而言：

打开放卷板，对步骤（3）中的切片进行展片，然后进行染色；

染色操作时，对切片进行番红单染色、固绿单染色或者番红-固绿双重染色；

染色结束后，观察蝴蝶兰组织冷冻切片的显微结构，并拍照保存。

3.如权利要求2所述蝴蝶兰冰冻切片处理方法，其特征在于，叶片组织、气生根组织、合蕊柱采用番红-固绿双重染色；花柄、花萼、唇瓣采用番红单染色。

4.如权利要求3所述蝴蝶兰冰冻切片处理方法，其特征在于，所述番红-固绿双重染色，具体方法是：向展开的材料用质量分数1%的番红水溶液染色15~30min，用蒸馏水洗涤4次，再用质量分数为0.1%的固绿染色20s，用蒸馏水或质量分数为95%的乙醇冲洗固绿至材料不褪色为止，之后在材料表面上滴加质量分数为50%的甘油，盖上盖玻片。

5.如权利要求1所述蝴蝶兰冰冻切片处理方法，其特征在于，步骤（1）中，具体整形处理方式为：将样品洗净擦干后，用刀片将气生跟组织切成1cm的小段，将叶片组织切成0.2cm×1cm的小块；将花柄修整成长1cm、横切，将花萼修整成长1cm×宽0.5cm、纵切，将唇瓣修整成长0.8cm×宽0.5cm、纵切，将合蕊柱横切修整。

6.如权利要求1所述蝴蝶兰冰冻切片处理方法，其特征在于，步骤（1）中，预处理叶片组织样品时，蔗糖-PBS保护液中蔗糖浓度为16%，预处理30min；预处理气生根组织样品时，蔗糖-PBS保护液中蔗糖浓度为4%，预处理30min；预处理花柄或唇瓣组织样品时，蔗糖-PBS保护液中蔗糖浓度为4%，预处理60min；预处理花萼组织样品时，蔗糖-PBS保护液中蔗糖浓度为8%，预处理60min；预处理合蕊柱组织样品时，蔗糖-PBS保护液中蔗糖浓度为16%，预处理60min。

7.如权利要求1所述蝴蝶兰冰冻切片处理方法，其特征在于，步骤（2）中，-20℃条件下，利用OCT或普通胶水包埋20min。

8.如权利要求1所述蝴蝶兰冰冻切片处理方法， 其特征在于，步骤（3）中，叶片组织、花柄组织切片厚度为15μm；花柱、花萼组织切片厚度为10μm；气生根组织、唇瓣组织切片厚度为20μm。