CN107095931A - 五味子总木脂素在制备用于治疗骨质疏松症的药物中的用途 - Google Patents

五味子总木脂素在制备用于治疗骨质疏松症的药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及药学领域，特别是涉及一种五味子总木脂素及其制备方法，并进一步涉及所述五味子总木脂素在制备用于治疗骨质疏松症的药物中的用途。本发明提供一种五味子总木脂素，所述五味子总木脂素包括五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素。本发明发明人发现五味子总木脂素能够有效抑制IL‑6和/或IL‑11蛋白及其mRNA的表达，从而可以用于治疗骨质疏松症。

Description

五味子总木脂素在制备用于治疗骨质疏松症的药物中的用途
技术领域
本发明涉及药学领域，特别是涉及一种五味子总木脂素及其制备方法，并进一步涉及所述五味子总木脂素在制备用于治疗骨质疏松症的药物中的用途。
背景技术
骨质疏松症(Osteoprosis，OP)是以骨质量减少，骨组织纤维结构退行性改变为特征，骨脆性增加，易于发生骨折的一种全身代谢性骨病。主要表现为腰背疼痛，骨密度降低，易发生骨折。随着老龄化社会的到来，骨质疏松的发病率也随着增高，女性绝经后，身体内雌激素水平显著降低，骨丢失加快，骨吸收大于骨形成，造成绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoprosis，PMOP)，成为绝经后妇女的一种常见病。
《素问·上古天真论》曰：“女子七岁，肾气盛，齿更发长；二七，天癸至，任脉通，太冲脉盛……五七，阳明脉衰，面始焦，发始堕；六七，三阳脉衰于上，面皆焦，发始白；七七……”“肾藏精主骨生髓”，肾精在骨骼生长发育过程中的重要性。肾精少，不能生髓，骨失所养，可致骨质疏松。在“肾主骨”理论指导下，补肾成为治疗骨质疏松症的基本大法。
当雌激素缺乏时，不仅会减弱对骨吸收的抑制，进而影响白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-111(IL-11)、肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子在骨代谢中的作用，骨代谢平衡遭到破坏，造成骨质疏松。绝经后卵巢水平能力下降，雌激素分泌减少，对骨吸收的抑制作用大幅度减低，骨吸收与骨形成保持平衡的状态被打破，骨质疏松的病理症状在微观结构上表现出来，如骨密度降低、骨小梁排列结构紊乱、连接度降低等。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供五味子总木脂素在制备用于治疗骨质疏松症的药物中的用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种五味子总木脂素，所述五味子总木脂素包括五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素。
在本发明一些实施方式中，所述五味子总木脂素中五味子醇甲的含量为8.09wt％-19.27wt％、五味子醇乙的含量为2.78wt％-5.82wt％、五味子酯甲的含量为2.25wt％-4.14wt％、五味子甲素的含量为1.55wt％-2.51wt％、五味子乙素的含量为1.73wt％-5.99wt％、五味子丙素的含量为0.11wt％-0.51wt％。
本发明第二方面提供所述的五味子总木脂素的制备方法，包括如下步骤：
1)获取五味子的提取液；
2)将提取液浓缩、吸附、洗脱后得流出液，即得所述五味子总木脂素。
在本发明一些实施方式中，所述五味子的提取液为五味子的醇提提取液。
在本发明一些实施方式中，五味子的提取液的制备方法包括如下步骤：使用提取溶剂对五味子进行一次以上的提取，合并各次提取的提取液。
在本发明一些实施方式中，各次提取的提取温度室温至溶剂回流的温度。
在本发明一些实施方式中，各次提取的提取时间为0.5-2小时。
在本发明一些实施方式中，各次提取时的固液比为每1kg待提取物使用3.2-3.6L溶剂。
在本发明一些实施方式中，提取溶剂选自乙醇和/或甲醇。
在本发明一些实施方式中，还对提取液进行过滤，过滤优选使用孔径为0.3-0.5μm的滤膜。
在本发明一些实施方式中，所述五味子为五味子的果实，优选为干燥和/或成熟果实。
在本发明一些实施方式中，所述五味子为五味子粉末，优选目数为14-20目。
在本发明一些实施方式中，吸附时所使用的吸附剂选自硅藻土、硅胶中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中，使用硅藻土进行吸附，五味子与硅藻土的优选质量比为2.5：1-1.5。
在本发明一些实施方式中，洗脱时所使用的洗脱剂选自石油醚、正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中，使用石油醚和/或三氯甲烷作为洗脱剂进行洗脱，石油醚的沸程优选为60-90℃。
在本发明一些实施方式中，优选先使用石油醚和/或正己烷进行洗脱，再使用三氯甲烷和/或二氯甲烷和/或乙酸乙酯进行洗脱。
在本发明一些实施方式中，流出液还进行浓缩和/或脱溶，即得所述五味子总木脂素。
本发明第三方面提供五味子总木脂素在制备用于治疗骨质疏松症的药物中的用途。
在本发明一些实施方式中，所述骨质疏松症为原发性骨质疏松症。
在本发明一些实施方式中，所述骨质疏松症为雌激素缺乏所导致的骨质疏松症，更具体的，所述骨质疏松症为绝经后骨质疏松症。
在本发明一些实施方式中，所述骨质疏松症为IL-6和/或IL-11表达上升所导致的骨质疏松症。
本发明第四方面提供五味子总木脂素在制备IL-6和/或IL-11抑制剂中的用途。
在本发明一些实施方式中，所述五味子总木脂素包括五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素。
在本发明一些实施方式中，所述五味子总木脂素包括如下组分：五味子醇甲的含量为8.09wt％-19.27wt％、五味子醇乙的含量为2.78wt％-5.82wt％、五味子酯甲的含量为2.25wt％-4.14wt％、五味子甲素的含量为1.55wt％-2.51wt％、五味子乙素的含量为1.73wt％-5.99wt％、五味子丙素的含量为0.11wt％-0.51wt％。
本发明第五方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如权利要求1-2任一权利要求所述的五味子总木脂素。
在本发明一些实施方式中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
附图说明
图1为各组大鼠股骨BV/TV的变化示意图；
图2为各组大鼠股骨Tb.N的变化示意图；
图3为各组大鼠股骨Tb.Th的变化示意图；
图4为各组大鼠股骨Tb.SP的变化示意图；
图5为各组大鼠股骨SMI的变化示意图；
图6为各组大鼠胫骨骨髓中IL-6蛋白表达的变化示意图；
图7为各组大鼠胫骨骨髓中IL-6mRNA表达的变化示意图；
图8为各组大鼠胫骨骨髓中IL-11蛋白表达的变化示意图；
图9为各组大鼠胫骨骨髓中IL-11mPNA的变化示意图；
图10为空白对照组大鼠骨小梁三维重建图像；
图11为假手术组大鼠骨小梁三维重建图像；
图12为模型组大鼠骨小梁三维重建图像；
图13为阳性对照组大鼠骨小梁三维重建图像；
图14为五味子总木脂素小剂量组大鼠骨小梁三维重建图像；
图15为五味子总木脂素中剂量组大鼠骨小梁三维重建图像；
图16为五味子总木脂素大剂量组大鼠骨小梁三维重建图像；
图17为空白对照组大鼠胫骨骨髓中IL-6蛋白表达示意图(免疫组化法，×40)；
图18为假手术组大鼠胫骨骨髓中IL-6蛋白表达示意图(免疫组化法，×40)；
图19为模型组大鼠胫骨骨髓中IL-6蛋白表达示意图(免疫组化法，×40)；
图20为阳性对照组大鼠胫骨骨髓中IL-6蛋白表达示意图(免疫组化法，×40)；
图21为五味子总木脂素小剂量组大鼠胫骨骨髓中IL-6蛋白表达示意图(免疫组化法，×40)；
图22为五味子总木脂素中剂量组大鼠胫骨骨髓中IL-6蛋白表达示意图(免疫组化法，×40)；
图23为五味子总木脂素大剂量组大鼠胫骨骨髓中IL-6蛋白表达示意图(免疫组化法，×40)；
图24为空白对照组大鼠胫骨骨髓中IL-6mRNA表达示意图(原位杂交法，×40)；
图25为假手术组大鼠胫骨骨髓中IL-6mRNA表达示意图(原位杂交法，×40)；
图26为模型组大鼠胫骨骨髓中IL-6mRNA表达示意图(原位杂交法，×40)；
图27为阳性对照组大鼠胫骨骨髓中IL-6mRNA表达示意图(原位杂交法，×40)；
图28为五味子总木脂素小剂量组大鼠胫骨骨髓中IL-6mRNA表达示意图(原位杂交法，×40)；
图29为五味子总木脂素中剂量组大鼠胫骨骨髓中IL-6mRNA表达示意图(原位杂交法，×40)；
图30为五味子总木脂素大剂量组大鼠胫骨骨髓中IL-6mRNA表达示意图(原位杂交法，×40)；
图31为空白对照组大鼠胫骨骨髓中IL-11蛋白表达示意图(免疫组化法，×40)；
图32为假手术组大鼠胫骨骨髓中IL-11蛋白表达示意图(免疫组化法，×40)；
图33为模型组大鼠胫骨骨髓中IL-11蛋白表达示意图(免疫组化法，×40)；
图34为阳性对照组大鼠胫骨骨髓中IL-11蛋白表达示意图(免疫组化法，×40)；
图35为五味子总木脂素小剂量组大鼠胫骨骨髓中IL-11蛋白表达示意图(免疫组化法，×40)；
图36为五味子总木脂素中剂量组大鼠胫骨骨髓中IL-11蛋白表达示意图(免疫组化法，×40)；
图37为五味子总木脂素大剂量组大鼠胫骨骨髓中IL-11蛋白表达示意图(免疫组化法，×40)；
图38为空白对照组大鼠胫骨骨髓中IL-11mRNA表达示意图(原位杂交法，×40)；
图39为假手术组大鼠胫骨骨髓中IL-11mRNA表达示意图(原位杂交法，×40)；
图40为模型组大鼠胫骨骨髓中IL-11mRNA表达示意图(原位杂交法，×40)；
图41为阳性对照组大鼠胫骨骨髓中IL-11mRNA表达示意图(原位杂交法，×40)；
图42为五味子总木脂素小剂量组大鼠胫骨骨髓中IL-11mRNA表达示意图(原位杂交法，×40)；
图43为五味子总木脂素中剂量组大鼠胫骨骨髓中IL-11mRNA表达示意图(原位杂交法，×40)；
图44为五味子总木脂素大剂量组大鼠胫骨骨髓中IL-11mRNA表达示意图(原位杂交法，×40)。
具体实施方式
本发明发明人经过大量探索实验发现，五味子总木脂素能够有效抑制IL-6和/或IL-11蛋白及其mRNA的表达，从而可以用于治疗骨质疏松症，在此基础上完成了本发明。
本发明一方面提供一种五味子总木脂素，所述五味子总木脂素通常可以包括五味子醇甲(schisandrin，7432-28-2)、五味子醇乙(schisandrol B，58546-54-6)、五味子酯甲(Schisantherin A，58546-56-8)、五味子甲素(Schisandrin A，61281-38-7)、五味子乙素(Schisandrin B，61281-37-6)、五味子丙素(Schisandrin C，61301-33-5)等组分。所述五味子总木脂素通常可以从木兰科植物五味子中提取获得，所述五味子可以是北五味子(Schisandra chinernsis(Turcz.)Baill.)。
本发明所提供的五味子总木脂素中，五味子醇甲的含量通常不低于0.4wt％，具体可以为8.09wt％-19.27wt％，在本发明一具体实施方式中，所述五味子醇甲的含量可以约为15.58wt％。本发明中的“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
本发明所提供的五味子总木脂素中，五味子醇乙的含量可以为2.78wt％-5.82wt％，在本发明一具体实施方式中，所述五味子醇乙的含量可以约为4.01wt％。
本发明所提供的五味子总木脂素中，五味子酯甲的含量可以为2.25wt％-4.14wt％，在本发明一具体实施方式中，所述五味子酯甲的含量可以约为3.54wt％。
本发明所提供的五味子总木脂素中，五味子甲素的含量可以为1.55wt％-2.51wt％，在本发明一具体实施方式中，所述五味子甲素的含量可以约为2.04wt％。
本发明所提供的五味子总木脂素中，五味子乙素的含量可以为1.73wt％-5.99wt％，在本发明一具体实施方式中，所述五味子乙素的含量可以约为2.90wt％。
本发明所提供的五味子总木脂素中，五味子丙素的含量可以为0.11wt％-0.51wt％，在本发明一具体实施方式中，所述五味子丙素的含量可以约为0.20wt％。
本发明所提供的五味子总木脂素中，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素之间的比例可以是例如8.09-19.27：2.78-5.82：2.25-4.14：1.55-2.51：1.73-5.99：0.11-0.51。
本发明另一方面提供所述五味子总木脂素的制备方法，所述制备方法可以包括：获取五味子的提取液。所述五味子的提取液通常可以为五味子的醇提提取液，所述醇提通常指利用醇类溶剂的溶解性，将醇类溶剂作为溶剂对物质进行分离提纯的方法，所述醇类溶剂通常可以是例如甲醇、乙醇等，优选为无水乙醇。获取五味子的提取液时，通常可以将适量的溶剂与待提取物(五味子)进行混合，利用溶剂的溶解性将待提取物(五味子)中的可溶性物质(可被溶剂溶解的物质)溶出，从而获得提取液。所述待提取物(五味子)可以是五味子的果实，通常为干燥和/或成熟的五味子的果实。待提取物(五味子)通常可以是粉末状的，从而可以提升提取效率，例如，待提取物可以为目数为14-20目的粉末。对待提取物(五味子)进行提取的提取温度可以是室温至溶剂回流的温度，具体例如可以是溶剂回流的温度。提取过程中，可以对待提取物(五味子)进行一次以上的提取，提取之后合并各次提取的提取液，以保证待提取物(五味子)中的可溶性物质被充分地溶出。本领域技术人员可对提取时间和提取时的固液比进行适当调整，以使得待提取物中的可溶性物质被充分溶出，例如，每次提取的时间可以是0.5至2小时，再例如，每次提取时待提取物与溶剂的比例可以是每1kg待提取物使用3.2-3.6L溶剂。获得提取液以后，还可以对提取液进行过滤，以除去提取液中的一些难容和/或不溶的物质，本领域技术人员可根据提取液的情况选择合适的过滤条件，例如可以使用孔径为0.3-0.5μm的滤膜进行过滤。
本发明所提供的五味子总木脂素的制备方法还可以包括：将提取液浓缩、吸附、洗脱后得流出液，即得所述五味子总木脂素。本领域技术人员可选择合适的吸附剂和/或洗脱剂的种类和使用量用于对提取液进行吸附和/或脱附，例如，吸附剂可以是硅藻土、硅胶等，优选为硅藻土。再例如，待提取物(五味子)与硅藻土的质量比可以是2.5：1-1.5，再例如，脱附时可以使用石油醚、正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等作为洗脱剂进行洗脱，优选的脱附剂为石油醚和/或三氯甲烷，再例如，洗脱时可以先使用石油醚和/或正己烷进行洗脱，再使用三氯甲烷和/或二氯甲烷和/或乙酸乙酯进行洗脱。石油醚的沸程可以为60-90℃，待提取物(五味子)与石油醚的用量比可以为每2.5kg待提取物使用5.0L-10.0L石油醚，待提取物(五味子)与三氯甲烷的用量比可以为每2.5kg待提取物使用5.0L-10.0L三氯甲烷，洗脱过程中，柱温可以为15-30℃，例如可以为室温，通常可以先使用石油醚进行洗脱、再使用三氯甲烷进行洗脱。所得流出液通常还可以进行浓缩和/或脱溶，以获得合适形态的五味子总木脂素。
本发明另一方面提供五味子总木脂素在制备用于治疗骨质疏松症的药物中的用途。在本申请中，“治疗”包括药学和/或生理效果的预防性、治愈性或缓和性处置，该效果可以是指减少适应症的一种或多种症状或者完全消除适应症，或阻滞、延迟适应症的发生和/或降低适应症发展或恶化的风险。
在本申请中，骨质疏松症通常指由于骨量减少和/或骨微结构破坏所导致的骨脆性增加和/或骨折风险上升的适应症，通常为全身性适应症。骨质疏松症通常可以包括原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症和特发性骨质疏松等。原发性骨质疏松症通常指由于绝经和/或年龄上升所引起的骨量减少和/或骨微结构破坏，从而导致骨的脆性增加和/或骨折风险上升的的适应症，原发性骨质疏松症通常可以包括绝经后骨质疏松症和老年性骨质疏松症。继发性骨质疏松症通常指由于疾病和/或药物等原因所致的骨量减少和/或骨微结构破坏，从而导致骨的脆性增加和/或骨折风险上升的适应症。特发性骨质疏松症通常指男性发病年龄小于50岁、女性发病年龄小于40岁的无潜在疾病、发病原因不明的骨质疏松症。绝经后骨质疏松症通常指由于雌激素缺乏导致骨量减少和/或骨微结构破坏，从而导致骨的脆性增加和/或骨折风险上升的适应症。老年性骨质疏松症通常指由于年龄上升所引起的骨质量减少和/或骨的微观结构退化，从而导致骨的脆性增加和/或骨折风险上升的适应症。
本发明所提供的五味子总木脂素经药效试验验证可以使得切除大鼠卵巢所导致的生理现象(例如，股骨BV/TV的减少、股骨Tb.Th的减少、股骨Tb.N的减少，股骨Tb.SP的增加、股骨SMI的增加等)在一定程度上发生逆转，还可以使得切除大鼠卵巢所导致的IL-6和/或IL-11蛋白和/或它们的mRNA表达升高发生逆转，从而表明本发明所提供的五味子总木脂素对雌激素缺乏所导致的骨缺陷(例如，骨质量减少和/或骨的微观结构退化等)具有治疗作用，也可以表明本发明所提供的五味子总木脂素对IL-6和/或IL-11蛋白和/或它们的mRNA的表达具有抑制作用，从而表明本发明所提供的五味子总木脂素对IL-6和/或IL-11表达上升(相对于正常水平)所导致的骨缺陷(例如，可以是骨质量减少和/或骨的微观结构退化等)具有治疗作用。可见，本发明所提供的五味子总木脂素对于骨质疏松症具有治疗作用，更具体可以是原发性骨质疏松症，进一步具体可以是绝经后骨质疏松症。
本发明另一方面提供五味子总木脂素在制备IL-6和/或IL-11抑制剂中的用途。本发明所提供的五味子总木脂素经药效试验验证可以使得切除大鼠卵巢所导致的IL-6和/或IL-11蛋白和/或它们的mRNA表达升高发生逆转，从而可以表明本发明所提供的五味子总木脂素对IL-6和/或IL-11蛋白和/或它们的mRNA的表达具有抑制作用，可以作为或者用于制备IL-6和/或IL-11的抑制剂。
本发明另一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括所述五味子总木脂素，更具体可以包括治疗有效量的所述五味子总木脂素，所述治疗有效量通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗的效果。
本发明的药物组合物还可以包括至少一种药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体通常指用于给药的载体，这些物质本身通常并不是活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的，例如，可参见Remington'sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中关于药学上可接受的载体的相关内容。
本发明的药物组合物可以适于任何形式的给药，例如可以是通过肺、鼻、直肠和/或静脉内给药，更具体可以是通过静脉内给药、腹膜内给药、肌内给药、皮下给药、鞘内给药、直肠给药、经皮给药、经粘膜给药或经鼻给药等。本领域技术人员可根据药物的给药途径，将本发明的药物组合物可以被配制成不同药物形式的药物(药剂)，例如可以是溶液、悬浮液、可复溶的干制品、粉剂、片剂、颗粒剂、软膏、凝胶、霜剂、洗剂、乳剂、栓剂、贴剂或喷雾剂等。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例中所使用的材料和仪器的具体信息如下：
SD大鼠，SPF级，雌性，体重210±20g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK-(军)2012-0004，在中国中医科学院中医基础理论研究所清洁级实验动物室内饲养，实验动物室许可证号：SYXK(京)2010-0032。
戊酸雌二醇片：拜耳医药保健有限公司广州分公司生产，产品批号：101A，规格：1mg/片。临用前，碾碎，用1.07wt％吐温80水溶液配制成浓度为0.015mg/ml的混悬液。
戊巴比妥钠：德国MERCK公司生产，批号：20131206。
吐温80：西陇化工股份有限公司生产，批号：1304121，化学纯。
多聚甲醛：国药集团化学试剂有限公司生产，批号：20140604。
多聚赖氨酸：武汉博士德生物工程有限公司生产，批号：09F09A03。
大鼠IL-6抗体：美国圣克鲁斯生物技术公司生产，批号：H2214。
大鼠IL-11抗体：武汉博特欧生物科技有限公司生产，批号：K10210。
Goat ABC Staining System：美国圣鲁科斯生物技术公司生产，批号：C2014。
Rabbit ABC Staining System：美国圣鲁科斯生物技术公司生产，批号：C2014。
IL-6原位杂交检测试剂盒：武汉博士德生物公司工程有限公司产品，批号：003620512-136040HL。采用IL-6的寡核苷酸探针，经地高辛标记，针对大鼠、小鼠的IL-6靶基因的mRNA序列为：
(1)5’-CTCCG CAAGA GACTT CCAGC CAGTT GCCTT—3’；
(2)5’-CTTCC AAACT GGATA TAACC AGGAA ATTTG—3’；
(3)5’-ATTTC TAAAG GTCAC TATGA GGTCT ACTCG—3’。
IL-11原位杂交检测试剂盒：武汉博士德生物公司工程有限公司产品，批号：01579TW2082325040UK。采用针对IL-11的寡核苷酸探针，经地高辛标记，其中针对大鼠IL-11靶基因mRNA的序列为：
(1)5’-AGAGA CAAAT TCCCA GCTGA TGGAG ACCAC AATCT-3’；
(2)5’-TCCTA CTTCC GACAT GTACA GTGGT TGCGC CGGGC-3’；
(3)5’-CAAGC CCGAC TGGAA CGGCT ACTTC GTCGC TTACA-3’。
Skyscan1174X-Ray Microtomograph(Micro-CT)：比利时，Bruker公司；
Qwin Pro V3.5.0图像分析系统：德国，Leica公司；
Leica DM6000B正置显微镜：德国，Leica公司；
Cryotome FSE冷冻切片机：美国，Thermo公司。
统计学分析：实施例中的实验结果皆以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 20.0统计软件进行统计学处理。若数据为正态分布，则采用单因素方差分析进行处理：方差齐性的，组间两两比较采用LSD检验；方差不齐的则采用Dunnett，s T3检验。非正态分布的数据，采用Kruskal-Wallis 1-way ANOVA(k samples)进行检验：组间两两比较，采用Stepwisestep-down法。
实施例1
五味子总木脂素的制备：
将目数为14-20目的五味子药材粉末2.5kg加入无水乙醇8.5L，浸泡过夜后，加热回流提取2h，同法重复回流提取3次后，合并滤液，减压蒸馏回收溶剂，加热浓缩至粘稠态后，得到五味子粉末的浸膏；将该五味子粉末的浸膏加入硅藻士1.2kg搅拌，减压干燥(60℃)挥干溶剂后，用粉碎机研磨成目数为20-30目的浸膏粉末后，放入玻璃柱中，先用沸程为60‐90℃的石油醚6.0L于室温进行一次洗脱，至6.0L石油醚全部洗脱完毕后，再用6.0L三氯甲烷于室温进行二次洗脱，至6.0L三氯甲烷全部洗脱完毕后，收集二次洗脱所得流出液，即得五味子总木脂素。对所得五味子总木脂素中的主要组分含量进行测定，结果如下：五味子醇甲15.58wt％，五味子醇乙4.01wt％，五味子酯甲3.54wt％，五味子甲素2.04wt％，五味子乙素2.90wt％，五味子丙素0.20wt％。
临用前，按五味子总木脂素的总重量计，用1.07wt％吐温80水溶液分别配制成浓度为8.05mg/ml、16.10mg/ml和32.20mg/ml的混悬液。
实施例2
动物分组及处理：
将92只大鼠按体重随机分为3组：空白对照组12只，假手术组12只，造模组68只。对造模组大鼠进行卵巢切除手术：用戊巴比妥钠45mg/kg体重对大鼠进行腹腔注射麻醉。侧卧位固定，于最末肋骨下端，脊柱外侧约1cm处与腋中线交叉处，进行剃毛，暴露术野。碘酊、75％酒精消毒后，作纵行切口，约1cm-1.5cm。切开皮肤、腹部肌肉和肌膜，将卵巢及周围脂肪团轻轻拉出切口外，手术缝合线结扎卵巢下端输卵管，切除卵巢。然后，缝合切口，并敷以消炎粉以防感染。同法切除另一侧卵巢。假手术组的手术过程同上，只是切除卵巢周围小块的脂肪组织，但不摘除卵巢。手术过程中造模组有1只大鼠死亡。术后3周，待大鼠伤口愈合后，再将造模组67大鼠按体重随机分为5组：模型组12只；阳性对照组14只；五味子总木脂素小剂量组13只，中剂量组14只，大剂量组14只。分组后，开始对各给药组大鼠灌胃给药：五味子总木脂素小、中、大剂量组分别给予浓度为8.05mg/ml、16.10mg/ml和32.20mg/ml的五味子总木脂素混悬液(实施例1中配置)，给药体积为12ml/kg体重，给药剂量分别为96.6mg/kg体重、193.2mg/kg体重和386.4mg/kg体重。阳性对照组灌胃给予浓度为0.015mg/ml的戊酸雌二醇溶液，给药体积为12ml/kg体重，给药剂量为0.18mg/kg体重。以上各组大鼠给药，每天1次，连续6天，休息1天后，再给药6天，如此给药13周。每周称体重一次，据此调整给药剂量。空白对照组、假手术组、模型组按上法灌胃给予等体积的1.07wt％吐温80水溶液。
给药结束后，给各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠45mg/kg体重进行麻醉，然后处死。取左侧股骨，福尔马林固定。取右侧胫骨近端1/3，剔除骨组织周围的软组织，用4wt％多聚甲醛(用0.01M PBS配制，pH7.2，含1‰DEPC)固定，置于4℃冰箱48h，用于制作脱钙冰冻切片。
实施例3
骨组织形态指标检测：
检测前，将左侧股骨取出，在生理盐水中浸泡24h后，采用Micro-CT对其进行组织形态指标检测：将股骨放置于micro-CT的标本管内，并用湿纸巾缠绕固定，防止扫描过程中标本的脱水及移位。采用Skyscan1174型micro-CT的Scanner软件进行扫描，参数设定为：电压50kV，电流800μA，断层图像分辨率1304pixel×1024pixel，扫描空间分辨率12μm，旋转角度0.8度，曝光时间5300ms。
扫描完成后，用N-Recon软件进行三维重构，各组的大鼠骨小梁三维重建图像参见图10-图16，最后用CT-AN软件进行三维分析(以上两款软件均为Skyscan1174型micro-CT自带软件)。
感兴趣区域选择在距生长板1mm以下，厚度为1.5mm的骨髓腔区域。分析得到以下参数：
骨体积分数(BV/TV)：骨小梁的总体积与感兴趣区域的骨髓腔体积；
骨小梁数量(Tb.N)：表示每1mm内的骨小梁数量；
骨小梁厚度(Tb.Th)：骨小梁的平均厚度；
骨小梁分离度(Tb.SP)：骨小梁之间的平均距离；
结构模型指数(SMI)：反应骨小梁呈“棒状”还是“板状”的指标，越接近3表示骨小梁越呈棒状。
1)各组大鼠股骨BV/TV的变化如表1和图1所示：
表1
注：表1中，与假手术组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，△△P<0.01；三个剂量组之间比较：与小剂量组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01；与中剂量组比较：#P<0.05，##P<0.01。
从表1、图1可以看出，与假手术组比较，模型组、阳性对照组以及五味子总木脂素小、中、大剂量组大鼠股骨BV/TV均显著减少。与模型组比较，中剂量组、大剂量组和阳性对照组的BV/TV均显著增加；而小剂量组则无显著性变化。三个剂量组之间比较，中剂量组、大剂量组的BV/TV明显高于小剂量组；大剂量组与中剂量组比较，无显著性差异。
2)各组大鼠股骨Tb.N的变化如表2和图2所示：
表2
注：表2中，与假手术组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，△△P<0.01；三个剂量组之间比较：与小剂量组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01；与中剂量组比较：#P<0.05，##P<0.01。
从表2、图2可以看出，模型组、阳性对照组以及五味子总木脂素小、中、大剂量组大鼠股骨Tb.N显著少于假手术组。中剂量组、大剂量组和阳性对照组与模型组比较，Tb.N均显著增多；小剂量组与之比较，无显著性变化。三个剂量组之间比较，中剂量组、大剂量组与小剂量组比较，Tb.N显著增多；大剂量组与中剂量组比较，无显著性差异。
3)各组大鼠股骨Tb.Th的变化如表3和图3所示：
表3
注：表3中，与假手术组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，△△P<0.01；三个剂量组之间比较：与小剂量组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01；与中剂量组比较：#P<0.05，##P<0.01。
从表3、图3可以看出，模型组、阳性对照组以及五味子总木脂素小、中、大剂量组与假手术组比较，大鼠股骨Tb.Th均显著减少。与模型组比较，中剂量组、大剂量组以及阳性对照组的Tb.Th显著增加；而小剂量组无显著性变化。三个剂量组之间比较，中剂量组、大剂量组的Tb.Th较小剂量组显著增加；大剂量组与中剂量组比较，无显著性差异。
4)各组大鼠股骨Tb.SP的变化如表4和图4所示：
表4
注：表4中，与假手术组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，△△P<0.01；三个剂量组之间比较：与小剂量组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01；与中剂量组比较：#P<0.05，##P<0.01。
从表4、图4可以看出，与假手术组比较，模型组、阳性对照组以及五味子总木脂素小、中、大剂量组大鼠股骨Tb.SP均显著增加。中剂量组、大剂量组以及阳性对照组与模型组比较，Tb.SP显著减少；小剂量组与之比较，无显著性变化。三个剂量组之间比较，中剂量组、大剂量组的Tb.SP均明显少于小剂量组；大剂量组与中剂量组比较，无显著性差异。
5)各组大鼠股骨SMI的变化如表5和图5所示：
表5
从表5、图5可以看出，模型组、阳性对照组以及五味子总木脂素小、中、大剂量组大鼠股骨SMI较假手术组明显增加。与模型组比较，中剂量组、大剂量组和阳性对照组的SMI明显减少；而小剂量组无显著性差异。三个剂量组之间比较，中剂量组、大剂量组与小剂量组比较，SMI均明显减少；大剂量组与中剂量组比较，无显著性差异。
可见，通过对去卵巢大鼠灌服五味子水煎剂3个月，发现中药组大鼠胫骨骨小梁体积百分比明显高于模型组，骨小梁矿化率、骨小梁形成表面百分比、骨小梁吸收表面百分比均低于模型组，产生有效的治疗机制是通过促进骨髓基质细胞和成骨细胞中护骨素表达，提高其与RANKL的结合率，减少破骨细胞的吸收，使骨形成大于骨吸收，阻止骨量减低。相关实验结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠股骨BV/TV、Tb.Th和Tb.N显著减少，而Tb.SP和SMI显著增加。SMI增加，表明骨小梁成棒状结构，这与在光学显微镜下在去卵巢所致骨质疏松症大鼠骨切片上所见到的纽扣状骨小梁相一致(因Micro CT检测到的是立体结构，而切片是平面的，所以在切片上呈现的是纽扣状结构)，这是绝经后骨质疏松症的一个典型病理特征，这一结果表明，切除大鼠卵巢可使其股骨BV/TV、Tb.Th和Tb.N显著减少，使Tb.SP和SMI显著增加，从而导致大鼠发生骨质疏松症。相关实验结果进一步显示，五味子总木脂素可使以上指标在一定程度上发生逆转，五味子总木脂素中剂量组和大剂量组与模型组比较，大鼠股骨BV/TV、Tb.Th和Tb.N显著增加，而Tb.SP和SMI明显减少，这一结果表明，五味子总木脂素对去卵巢所致的大鼠骨质疏松症具有治疗作用。
实施例4
胫骨骨髓中IL-6和IL-11蛋白及其mRNA表达的检测：
脱钙骨冰冻切片的制作：右侧胫骨固定48h后，用0.01M PBS(PH7.2，含1wt‰DEPC)充分漂洗骨组织，然后，放入10wt％EDTA·Na2 0.01M PBS(PH7.2，含1wt‰DEPC)溶液中，置于4℃冰箱中进行脱钙，每天换液一次。6周脱钙结束后，用0.01M PBS(PH7.2，含1wt‰DEPC)充分漂洗，再放入15wt％蔗糖(用0.01M PBS配制，PH7.2，含1wt‰DEPC)中进行脱水，4℃冰箱中保存。用冰冻切片机切片，每块骨组织切取5μm厚的纵向脱钙骨切片，贴于经1wt％多聚赖氨酸涂片的载玻片上。室温下挥发水分，待载玻片干透之后，利用4℃冰箱预冷的丙酮溶液固定30s，取出，在室温晾干后，收入载玻片盒，-20℃冰箱保存待测。
1)胫骨骨髓中IL-6和IL-11蛋白表达的检测方法：
采用免疫组织化学染色方法，检测胫骨骨髓中IL-6和IL-11的蛋白表达。按照试剂盒所附说明进行操作，IL-6蛋白表达的检测方法如下：
(1)取出冰冻切片，室温平衡10min。
(2)纯净水洗5min×2次。
(3)0.3wt％H2O2室温孵育30min，目的是消除内源性过氧化物酶对实验结果的干扰，0.01M PBS(pH7.2)洗5min×3次。
(4)滴加正常山羊血清封闭液，室温30min。甩去多余液体。
(5)滴加IL-6一抗，用0.01M PBS(pH7.2)1:100的稀释，以0.01M PBS代替一抗作为阴性对照，4℃过夜。
(6)0.01M PBS(pH7.2)洗5min×3次。
(7)滴加二抗，37℃孵育10min。
(8)0.01M PBS(pH7.2)洗2min×3次。
(9)滴加二抗试剂AB混合物，37℃孵育10min。
(10)0.01M PBS(pH7.2)洗2min×3次。
(11)DAB显色：1600μl超纯水加入1滴浓缩DAB液及5滴缓冲液，另外再加1滴DAB过氧化物酶底物，混匀后滴至切片。显微镜下观察，反应5min后，用纯净水洗涤终止反应。
(12)脱水透明，中性树胶封片，显微镜观察。
IL-11蛋白表达的检测方法同上，只是在第5步，滴加IL-11一抗。
结果判断：大鼠胫骨骨髓中细胞阳性反应为细胞胞浆有棕黄色着色。采用QwinPro V3.5.0图像分析系统进行检测。随机检测骺板以下髓腔内5个高倍视野(40×10)，计算每个视野内的积分光密度(IOD)，求其平均值，以其作为表达强度。
2)胫骨骨髓中IL-6和IL-11mRNA表达的检测方法：
采用原位杂交法，检测胫骨骨髓中IL-6和IL-11的mRNA表达。按照试剂盒所附说明进行操作，IL-6mRNA表达的检测方法如下：
(1)取出冰冻切片，室温平衡30min。
(2)纯净水洗5min×2次；
(3)0.3％H2O2室温孵育10min，用来消除内源性过氧化物酶对实验结果的干扰，纯净水洗3次。
(4)暴露mRNA核酸片断：滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶在切片上，37℃消化5min。PBS洗5min×3次，纯净水洗1次。
(5)后固定：1％多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.2)固定液，含有1‰DEPC。室温固定10min，纯净水洗3次。
(6)预杂交：每张片子滴加20μl预杂交液，41℃恒温箱孵育4小时。吸取多余液体，不洗。
(7)杂交：每张片子滴加20μl IL-6寡核苷酸探针杂交液，盖上原位杂交专用盖玻片，41℃恒温箱杂交过夜。
(8)杂交后洗涤：揭掉盖玻片后，37℃左右水温，2×SSC洗涤5min×2次；37℃左右水温0.5×SSC洗涤15min×1次；37℃左右水温0.2×SSC洗涤15min×1次。
(9)滴加封闭液：37℃孵育30min，甩去多余液体，不洗。
(10)滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃孵育60min。原位杂交用PBS洗5min×4次。
(11)滴加SABC：37℃孵育20min。原位杂交用PBS洗5min×3次。
(12)滴加生物素化过氧化物酶：37℃孵育20min。原位杂交用PBS洗5min×4次。
(13)DAB显色：使用DAB显色试剂盒，1ml纯净水加显色剂A，B，C各一滴，混匀，加至标本上。室温显色，显微镜下观察，反应5min后，用纯净水洗涤终止反应。
(14)脱水透明，中性树胶封片。显微镜观察。
大鼠胫骨骨髓中IL-11mRNA表达的检测方法同上，只是在第7步滴加的寡核苷酸酸探针杂交液为20μl IL-11。
结果判断：大鼠胫骨骨髓中细胞阳性反应为细胞胞浆有棕黄色着色。采用QwinPro V3.5.0图像分析系统进行检测。随机检测骺板以下髓腔内5个高倍视野(40×10)，计算每个视野内的积分光密度(IOD)，求其平均值，以其作为表达强度。
3)大鼠胫骨骨髓中IL-6蛋白表达的显微镜观测图如图17-图23所示，大鼠胫骨骨髓中IL-6mRNA表达的显微镜观测图如图24-图30所示，五味子总木脂素对去卵巢大鼠胫骨骨髓中IL-6蛋白及其mRNA表达的影响具体如表6、图6和图7所示：
表6
从表6、图6、图7可以看出，与假手术组比较，模型组、五味子总木脂素小剂量组大鼠胫骨骨髓中IL-6蛋白及其mRNA表达IOD均显著增高；而中剂量组、大剂量组和阳性对照组的IL-6蛋白表达IOD无显著差异；中剂量组的IL-6mRNA表达IOD显著增高，但大剂量组和阳性对照组的IL-6mRNA表达IOD无显著性差异。与模型组比较，中剂量组、大剂量组和阳性对照组的IL-6蛋白及其mRNA表达IOD均明显降低；小剂量组的则均无显著性差异。三个剂量组之间比较，中剂量组、大剂量组的IL-6蛋白及其mRNA表达IOD均明显低于小剂量组；大剂量组与中剂量组比较，无显著性变化。
3)大鼠胫骨骨髓中IL-11蛋白表达的显微镜观测图如图31-图37所示，大鼠胫骨骨髓中IL-11mRNA表达的显微镜观测图如图38-图44所示，五味子总木脂素对去卵巢大鼠胫骨骨髓中IL-11蛋白及其mRNA表达的影响具体如表7、图8和图9所示：
表7
从表7、图8、图9可以看出，与假手术组比较，模型组、五味子总木脂素小、中剂量组大鼠胫骨骨髓中IL-11蛋白及其mRNA表达IOD均明显增高；大剂量组的IL-11蛋白表达IOD明显增高，而其mRNA表达IOD无显著性差异；阳性对照组的IL-11蛋白及其mRNA表达IOD均无显著性差异。中剂量组、大剂量组以及阳性对照组的IL-11蛋白及其mRNA表达IOD均低于模型组；小剂量组与之比较均无显著性差异。三个剂量组之间比较，中剂量组、大剂量组的IL-11蛋白及其mRNA表达IOD均较小剂量组显著降低；大剂量组与中剂量组比较，均无显著性变化。
此外，假手术组的以上指标与空白对照组的比较，均无显著性差异，从而排除了手术因素对实验的影响。
相关实验结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠胫骨骨髓中的IL-6和IL-11蛋白及其mRNA表达均显著增强，说明卵巢切除，雌激素水平大幅度降低，可导致IL-6和IL-11合成与分泌增多。相关实验结果表明还表明，五味子总木脂素大剂量组和中剂量组大鼠胫骨骨髓中的IL-6和IL-11蛋白及其mRNA表达均明显低于模型组，这一结果说明五味子总木脂素可使去卵巢所致的大鼠骨髓中增强的IL-6和IL-11蛋白及其mRNA表达减弱，五味子总木脂素可通过抑制骨髓中IL-6和IL-11的合成和分泌而达到治疗骨质疏松症的作用。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (14)

1.一种五味子总木脂素，所述五味子总木脂素包括五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素。
2.如权利要求1所述的五味子总木脂素，其特征在于，五味子醇甲的含量为8.09wt％-19.27wt％、五味子醇乙的含量为2.78wt％-5.82wt％、五味子酯甲的含量为2.25wt％-4.14wt％、五味子甲素的含量为1.55wt％-2.51wt％、五味子乙素的含量为1.73wt％-5.99wt％、五味子丙素的含量为0.11wt％-0.51wt％。
3.如权利要求1-2任一权利要求所述的五味子总木脂素的制备方法，包括如下步骤：
1)获取五味子的提取液；
2)将提取液浓缩、吸附、洗脱后得流出液，即得所述五味子总木脂素。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包括如下技术特征中的一个或多个：
A1)所述五味子的提取液为五味子的醇提提取液；
A2)五味子的提取液的制备方法包括如下步骤：使用提取溶剂对五味子进行一次以上的提取，合并各次提取的提取液；
A3)还对提取液进行过滤，过滤优选使用孔径为0.3-0.5μm的滤膜；
A4)所述五味子为五味子的果实，优选为干燥和/或成熟果实；
A5)所述五味子为五味子粉末，优选目数为14-20目；
A6)吸附时所使用的吸附剂选自硅藻土、硅胶中的一种或多种的组合；
A7)洗脱时所使用的洗脱剂选自石油醚、正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯中的一种或多种的组合；
A8)流出液还进行浓缩和/或脱溶，即得所述五味子总木脂素。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括如下技术特征中的一个或多个：
B1)各次提取的提取温度为室温至溶剂回流的温度；
B2)各次提取的提取时间为0.5-2小时；
B3)各次提取时的固液比为每1kg待提取物使用3.2-3.6L溶剂；
B4)提取溶剂选自乙醇和/或甲醇；
B5)使用硅藻土进行吸附，五味子与硅藻土的优选质量比为2.5：1-1.5；
B6)先使用石油醚和/或正己烷进行洗脱，再使用三氯甲烷和/或二氯甲烷和/或乙酸乙酯进行洗脱；
B7)使用石油醚和/或三氯甲烷作为洗脱剂进行洗脱，石油醚的沸程优选为60-90℃。
6.五味子总木脂素在制备用于治疗骨质疏松症的药物中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述骨质疏松症为原发性骨质疏松症。
8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述骨质疏松症为雌激素缺乏所导致的骨质疏松症，更具体的，所述骨质疏松症为绝经后骨质疏松症。
9.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述骨质疏松症为IL-6和/或IL-11表达上升所导致的骨质疏松症。
10.五味子总木脂素在制备IL-6和/或IL-11抑制剂中的用途。
11.如权利要求6-10任一权利要求所述的用途，其特征在于，所述五味子总木脂素包括五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述五味子总木脂素包括如下组分：五味子醇甲的含量为8.09wt％-19.27wt％、五味子醇乙的含量为2.78wt％-5.82wt％、五味子酯甲的含量为2.25wt％-4.14wt％、五味子甲素的含量为1.55wt％-2.51wt％、五味子乙素的含量为1.73wt％-5.99wt％、五味子丙素的含量为0.11wt％-0.51wt％。
13.一种药物组合物，所述药物组合物包括如权利要求1-2任一权利要求所述的五味子总木脂素。
14.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
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