DE10021390A1 - Protektionslösung und Fixierverfahren für die Paraffinschnitt-Technik - Google Patents

Abstract

Obwohl Formaldehyd auf Grund seiner sehr guten morphologischen Strukturerhaltung für histologische Anwendungen gut verwendbar ist, haben sich in jüngster Zeit die Anforderungen an Gewebefixierungen durch die Entwicklung moderner molekularbiologischer Verfahren erhöht. Beim Einsatz mit immunhistochemischen und molekulargenetischen Methoden haben sich eine Reihe von Nachteilen der Formaldehyd fixierten Proben gezeigt, da die proteinvernetzende Wirkung von Formaldehyd sich für unmittelbare Untersuchungen an den Proteinstrukturen als nachteilig erwies. Die Erfindung stellt daher eine Protektionslösung bereit, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie zumindest eine Aminosäure und zumindest eine Zuckerverbindung enthält. die Stickstoffverbindungen sind vorzugsweise Aminosäuren wie Glycin, L-Alanin, L-Prolin, L-Serin und/oder L-Glutaminsäure. Die Zuckerverbindung ist vorzugsweise D-Glucose. Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren, bei dem nach Behandlung mit der Protektionslösung direkt ein Lösungsmittel (z. B. Aceton) zugegeben wird. Die Protektionslösung kann z. B. aus Tabletten einfach zubereitet werden.

Description

Die Erfindung betrifft eine Protektionslösung, eine Protektionslösungszubereitung und ein Fixierverfahren. Insbesondere betrifft die Erfindung Zubereitungen zur Protektion von biologischen Proben für histologische, histochemische, immunhistochemische und molekulargenetische Anwendungen mittels einer neuartigen Protektionslösung, durch die einerseits eine sehr gute Strukturerhaltung, anderseits eine dauerhafte Konservierung auf Grund einer Einbettung in Paraffin garantiert wird.

Oberstes Ziel jeder Fixierung von biologischem Material ist eine optimale und auf Langzeit ausgerichtete Erhaltung derjenigen Strukturen, die für eine mikroskopische Darstellung spezifischer morphologischer Details einer Gewebeprobe relevant sind. Dies wird entweder durch denaturierende beziehungsweise eiweißfällende Agentien, wie beispielsweise Säuren, Metallsalze, Alkohole, Ketone oder sonstige organische Lösungsmittel oder deren Kombination erreicht, oder durch proteinvernetzende Substanzen, wie beispielsweise Pentan-1,5-dial (Glutardialdehyd), Methanal (Formaldehyd) oder deren Kombinationen mit den vorher genannten Agentien. Formaldehyd ist das in der Histologie als etwa 10-prozentige wäßrige Lösung (Formalin) am häufigsten eingesetzte Fixierungsmittel, weil es in der klinischen Routinediagnostik den bestmöglichen Kompromiß zwischen einfacher und sicherer Anwendung sowie einer hervorragenden Strukturerhaltung bietet.

Die stark proteinvernetzende Wirkung des Formaldehyds ist essentiell, um das Gewebe im Verlaufe einer Fixierung und Einbettung in Paraffin vor den aggressiven Einwirkungen der konzentrierten Lösungsmittel zu schützen, deren Einsatz im nächsten Schritt des Fixierungsverfahrens unumgänglich ist, um die vollständige Dehydrierung einer Probe vor der Einbettung in wasserfreies Paraffin zu gewährleisten.

Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren vorgeschlagen worden, die die Dehydrierung durch Lösungsmittel ohne vorherige Proteinvernetzung durchführen (F.-J. Medina et al, Histochemistry 103 (1995). Seiten 403 bis 413; G. B. Marit et al., Histotechnology 18 (1995), Seiten 111 bis 114; US 5,432, 056). Eine solche Fixierung biologischen Materials erscheint zwar prinzipiell möglich und ist zudem einfach, jedoch auf Grund der schlecht kalkulierbaren destruktiven Einwirkungen auf morphologische Strukturen, wie den Nucleus oder das Cytoplasma wenig gebräuchlich, und wird höchstens bei sehr kleinen Gewebsstücken, wie Biopsien oder Probeexcisionen verwendet (vgl. Edna B. Prophet, Bob Mills, Jacguelyn B. Arrington, Leslie H. Sobin (Ed.): Laboratory Methods in Histotechnology, Washington, D. C., 1992).

Obwohl Formaldehyd auf Grund seiner sehr guten morphologischen Strukturerhaltung für histologische Anwendungen gut verwendbar ist, haben sich in jüngster Zeit die Anforderungen an Gewebefixierungen durch die Entwicklung moderner molekularbiologischer Verfahren erhöht. Beim Einsatz Formaldehyd-fixierter biologischer Proben für den Einsatz mit immunhistochemischen und molekulargenetischen Methoden haben sich eine Reihe von Nachteilen der Formaldehyd fixierten Proben gezeigt, da die proteinvernetzende Wirkung von Formaldehyd, welche für eine Morphologiestabilisierung erwünscht war, sich für unmittelbare Untersuchungen an den Proteinstrukturen als nachteilig erwies. So kann der Nachweis von Gewebsantigen mittels spezifischer Antikörper durch die Einwirkung von proteinvernetzenden Agentien wie Formaldehyd erschwert oder sogar unmöglich sein, wenn die zu untersuchende Antigenstruktur (Epitop) durch die Vernetzung maskiert oder umgeformt ist. Als nachteilig haben sich Formaldehyd induzierte Proteinvernetzungen auch bei der in situ-Hybridisierung und Isolierung verschiedener RNA-Spezies erwiesen.

Zur Überwindung dieser Probleme sind im Stand der Technik verschiedene Verfahren vorgeschlagen worden, wie beispielsweise die gezielte Andauung der Gewebeschnitte mit proteolytischen Enzymen oder eine Vorbehandlung der Gewebe in der Mikrowelle. Nichtsdestotrotz lassen sich auch heute noch eine Reihe von Gewebsantigenen lediglich im Gefrierschnitt oder Zellausstrich zuverlässig bestimmen. Die Gefrierschnittechnik ist aber technisch aufwendiger, da ein Kryostat verwendet werden muß, und die Langzeitlagerung der Proben ist problematischer. Zudem erbringt die Gefrierschnittechnik nicht in allen Fällen eine ebenfalls zu fordernde zufriedenstellende morphologische Qualität.

Der Erfindung lag somit die Aufgabe zu Grunde, eine Fixierung von biologischen Proben so durchzuführen, daß die oben aufgeführten Probleme nicht auftreten, wobei das Verfahren einfach gehalten sein sollte.

Diese Aufgabe wird durch die Gegenstände der Patentansprüche gelöst.

Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Fixierung von biologischen Proben, wobei die native biologische Probe so vorbehandelt wird, daß ein unmittelbarer Einsatz von dehydrierenden Lösungsmitteln möglich ist. Durch das Verfahren wird eine unkomplizierte Langzeitlagerung ermöglicht und die fixierten Proben werden so erhalten, daß sie in ihren morphologischen Details einem formaldehydfixierten Schnitt in wichtigen Merkmalen entsprechen.

Weiter betrifft die Erfindung eine Protektionslösung, welche die destruktiven Wirkungen von organischen Lösungsmitteln weitestgehend reduziert bzw. völlig verhindert.

Weitere vorteilhafte Aspekte, Ausgestaltungen und Details der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Patentansprüchen, der Beschreibung und den beigefügten Abbildungen.

Die Erfindung ist zunächst gerichtet auf eine Protektionslösung, die zumindest eine Aminosäure und zumindest eine Zuckerverbindung enthält.

Die Protektionslösung kann typischerweise drei bis zwanzig, vorzugsweise jedoch fünf bis zwölf, verschiedene Aminosäuren enthalten. Besonders bevorzugt wird, daß die zumindest eine Aminosäure ausgewählt ist aus den Aminosäuren Glycin, L-Alanin, L-Prolin, L-Serin und/oder L-Glutaminsäure. Vorzugsweise liegen mehr als eine der genannten Aminosäuren in Kombination vor.

Jede der in der Protektionslösung enthaltenen Aminosäuren kann in einer Konzentration von 1-400 mM in der Lösung enthalten sein. Vorzugsweise wird die Konzentration jeder der Aminosäuren 10-200 mM betragen, besonders bevorzugt 10-100 mM.

Die zumindest eine Zuckerverbindung ist ausgewählt aus D-Glucose, D-Galactose oder D-Mannose. Der pH-Wert-Wert der (im übrigen wäßrigen) Protektionslösung kann günstigerweise zwischen 5 und 7 liegen, vorzugsweise wird der pH-Wert zwischen 5,8 und 6,8, gemessen bei 20°C, betragen.

Es kann weiterhin vorteilhaft sein, wenn die Protektionslösung pH-Wert-gepuffert ist und der richtige pH-Wert durch einen Indikator, wie z. B. Phenolrot, angezeigt wird. Eine solche Pufferung kann beispielsweise durch die Puffersubstanzen HEPES und/oder Imidazol in geeigneten Konzentrationen erreicht werden.

Um die Haltbarkeit der Protektionslösungen zu verbessern, kann sie zudem ein Konservierungsmittel, beispielsweise Natriumazid, enthalten.

Grundsätzlich kann bei der erfindungsgemäßen Protektionslösung auf den Einsatz von üblichen Salzen völlig verzichtet werden.

Da jedoch als Konservierungsmittel beispielsweise Natriumazid geeignet ist, kann ein geringer Anteil an Salzen in der Protektionslösung akzeptabel sein. So wird es zumindest bevorzugt, daß die Protektionslösung weniger als 0,06 g an Salzen pro 100 ml an Lösung enthält.

Um die proteinvernetzende Wirkung von Aldehyden grundsätzlich zu vermeiden, ist es weiterhin bevorzugt, daß die Protektionslösung keine Aldehyde enthält.

Besonders bevorzugt wird eine Protektionslösung, die pro 100 ml enthält: 75-85 mM Glycin, 40-50 mM L-Alanin, 12-22 mM L-Prolin, 33-43 mM L-Serin, 63-73 mM L-Glutaminsäure, 15-19 mM HEPES, 71-75 mM Imidazol, 25-35 mM D-Glucose, 3-9 mM Natriumazid und 0,005 g Phenolrot in wäßriger Lösung mit einem pH-Wert von 6,0 bis 6,4 bei 20°C. Eine ganz besonders bevorzugte erfindungsgemäße Protektionslösung enthält 0,6 g Glycin (80 mM), 0,4 g L-Alanin (45 mM), 0,2 g L-Prolin (17 mM), 0,4 g L-Serin (38 mM), 1,0 L-Glutaminsäure (68 mM), 0,4 g HEPES-Puffer (17 mM), 0,6 g D-Glucose (30 mM), 0,5 g Imidazol (73 mM), 0,05 g Natriumazid (7,7 mM) und 0,005 g Phenolrot/­ 100 ml wäßriger Lösung.

Die Erfindung ist weiterhin gerichtet auf eine Zubereitung, welche die zur Herstellung einer bestimmten Menge an der erfindungsgemäßen Protektionslösung notwendigen Substanzen als Feststoffe enthält. Solch eine Zubereitung kann vorzugsweise eine Tablette sein. In einer Tablette sind die notwendigen Komponenten kompakt zusammengepreßt. Die Tablette wird vor Gebrauch in einem definierten Volumen an Wasser aufgelöst und ermöglicht dadurch eine sehr einfache Anwendung.

Die Erfindung ist weiterhin auf einen Fixierkit gerichtet, das zumindest enthält: zumindest eine Zubereitung der zur Herstellung einer vorbestimmten Menge an erfindungsgemäßer Protektionslösung notwendigen Substanzen als Feststoffe und eine weitere Lösung, welche zumindest ein zur Fixierung geeignetes Lösungsmittel enthält. Die weitere Lösung kann beispielsweise Aceton enthalten oder aus Aceton bestehen.

Die Erfindung ist schließlich auch auf ein Fixierverfahren für biologische Proben gerichtet, das folgende Schritte aufweist:

• - Inkubieren einer biologischen Probe mit der erfindungsgemäßen Protektionslösung; und
• - nachfolgendes Inkubieren der biologischen Probe mit einer weiteren Lösung, welche zumindest ein zur Fixierung geeignetes Lösungsmittel enthält.

Unter einer biologischen Probe im Sinne der vorliegenden Erfindung wird dabei jegliches Zellen und/oder extrazelluläres organisches Material enthaltendes Material, insbesondere Gewebe verstanden. So kommen sowohl tierische als auch pflanzliche Gewebe als geeignete biologische Proben in Frage. Das Gewebe kann aus beliebigen Tieren inklusive des Menschen sowie aus beliebigen Pflanzen, Pilzen etc. gewonnen worden sein. Es kann aus Organen, Haut, Blut etc. gewonnen sein oder bestehen. Vorzugsweise handelt es sich um Biopsiematerial, Operationsmaterial, Sektionsmaterial, Körperflüssigkeiten.

Unter Inkubieren im Sinne der vorliegenden Erfindung ist zu verstehen, daß sich die zu fixierende biologische Probe komplett in der jeweiligen Inkubationslösung befindet, also vorteilhafterweise von allen Seiten von Lösung umgeben ist, beziehungsweise zumindest sämtliche Teile der biologischen Probe hinreichend mit der jeweiligen Lösung in Kontakt kommen kann.

Vorzugsweise weist das Fixierverfahren den weiteren Schritt auf:

• - Einbetten der behandelten biologischen Probe in Paraffin.

Durch die Einbettung in Paraffin wird eine gute weitere Konservierung erreicht, sowie das anschließende Schneiden dünner Gewebsschnitte erleichtert.

Vorzugsweise erfolgt das Inkubieren mit der Protektionslösung für mindestens fünf Stunden. Das Inkubieren mit der Protektionslösung kann für 8 bis 100 Stunden, vorzugsweise für 10 bis 20 Stunden durchgeführt werden. Es wird weiterhin bevorzugt, daß das Inkubieren bei niedrigen Temperaturen erfolgt. So ist eine geeignete bevorzugte Temperatur für das Inkubieren sowohl mit der Protektionslösung als auch mit der weiteren Lösung 0°C bis 4°C. Das Inkubieren mit der weiteren Lösung erfolgt vorzugsweise für 1 bis 10 Stunden. Das eigentliche Zugeben der weiteren Lösung kann so erfolgen, daß entweder die biologische Probe aus der Protektionslösung herausgenommen wird oder die Protektionslösung in anderer Weise von der Probe getrennt wird und danach die weitere Lösung auf die Probe gegeben wird, beziehungsweise die Probe in die weitere Lösung eingelegt wird. Vorzugsweise ist die weitere Lösung hierbei eiskalt, um die Temperatur der biologischen Probe auch entsprechend niedrig zu halten.

Das Inkubieren mit der weiteren Lösung kann in mehreren Schritten mit jeweiligem Wechsel der weiteren Lösung erfolgen. Auf diese Weise kann zuverlässiger sichergestellt werden, daß die in die biologische Probe hineindiffundierende weitere Lösung die erfindungsgemäße Protektionslösung teilweise ausfällt und gleichzeitig bis auf notwendige Restmengen aus der biologischen Probe vollständig verdrängt.

Die weitere Lösung enthält vorzugsweise Aceton oder besteht aus Aceton und kann Glyoxal enthalten.

Die jeweilige biologische Probe, beispielsweise ein Gewebestück, wird mit der erfindungsgemäßen Protektionslösung in Kontakt gebracht, wobei die erfindungsgemäße Protektionslösung in das Gewebestück nach Art einer Immersionsfixierung hineindiffundiert und somit die destruktiven Wirkungen des anschließend zugegebenen organischen Lösungsmittels weitestgehend reduziert beziehungsweise sogar völlig verhindert.

Das ganze Verfahren ist so abgestimmt, daß das im zweiten Schritt hineindiffundierende Lösungsmittel in Form der weiteren Lösung die erfindungsgemäße Protektionslösung teilweise ausfällt und gleichzeitig aus dem Gewebestück bis auf notwendige Restmengen wieder ausschleust. Die durch die weitere Lösung verursachte Dehydrierung und die reversible Proteinfällung laufen dabei parallel ab, ohne eine starke Denaturierung zu verursachen, was für die Erhaltung sensitiver Antigenstrukturen besonders wichtig ist. Ein zusätzlicher wichtiger Effekt der Protektionslösung besteht darin, daß es dem eindringenden Lösungsmittel Kapillarräume eröffnet, wodurch dieses schneller als normal in die biologische Probe eindringen kann.

Anschließend wird das dehydrierte biologische Probenstück direkt in niedrig schmelzendes Paraffin (Schmelztemperatur 52 °C bis 54°C) verbracht. Beim Eindringen des Paraffins wirken die verbliebenen Restmengen der erfindungsgemäßen Protektionslösung wiederum als Schutzfaktor gegenüber dem wie ein Lösungsmittel agierenden Paraffin und werden gleichzeitig mit dem in der weiteren Lösung befindlichen Lösungsmittel, beispielsweise dem Aceton, aus dem Gewebestück ausgeschleust. Die Einwirkzeit des Paraffins liegt bei 55-56°C vorteilhafterweise zwischen 2 und 18 Stunden. Die weitere Zubereitung der Gewebeschnitte erfolgt dann in dem Fachmann bekannter üblicher Weise, beispielsweise wie in Romeis: Mikroskopische Technik, Urban und Schwarzenberg, 1989, beschrieben.

Die erfindungsgemäße Protektionslösung und das erfindungsgemäße Fixierverfahren ermöglichen eine schonende Fixierung biologischen Materials, so daß auch nach Einbettung in Paraffin noch Antigenstrukturen weitestgehend erhalten sind. Es gilt in gleicher Weise auch für den Erhaltungszustand von Nukleinsäuren, wie beispielsweise DNA und RNA. Zugleich kann eine akzeptable morphologische Darstellung der meisten für die pathologische Diagnostik relevanten Strukturdetails gewährleistet bleiben. Ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß die so erhaltenen fixierten Gewebeproben nach ihrer morphologischen Beurteilung noch einer RNA-, oder DNA-Diagnostik unterworfen werden können, so daß an einem einzelnen Objekt verschiedene Untersuchungen durchgeführt werden können. Die erfindungsgemäß fixierten Gewebeproben sind für längere Zeit, zumindest für Monate, haltbar. Die erfindungsgemäße Protektionslösung und das erfindungsgemäße Fixierverfahren (HOFE = Hepes-Glutamic acid buffer-mediated Organic Solvent Protection Effect) eignen sich insbesondere für mengenmäßig kleine Gewebeproben.

Im folgenden soll die Erfindung an Hand von konkreten Anwendungsbeispielen weiter erläutert werden, wobei auf die beigefügten Figuren Bezug genommen wird, in denen folgendes dargestellt ist:

Fig. 1 zeigt Schnitte verschiedener, erfindungsgemäß fixierter Gewebeproben;

Fig. 2 zeigt verschiedene Vergrößerungen von erfindungsgemäß und konventionell fixierten Gewebsstücken im Vergleich;

Fig. 3 zeigt Beispiele für immunhistochemische Nachweise anhand verschiedener, erfindungsgemäß fixierter Gewebestücke;

Fig. 4 zeigt Beispiele für DNA in-situ-Hybridisierungen an verschiedenen, erfindungsgemäß fixierten Gewebestücken; und

Fig. 5 zeigt RNA Ausbeuten aus erfindungsgemäß und konventionell fixierten Geweben im Vergleich.

Beispiel 1 Herstellung einer erfindungsgemäßen Protektionslösung

Für 100 ml einer erfindungsgemäßen Protektionslösung werden verwendet: 0,6 g Glycin, 0,4 g L-Alanin, 0,2 g L-Prolin, 0,4 g L-Serin, 1,0 L-Glutaminsäure, 0,4 g HEPES-Pufffer, 0,6 g D-Glucose, 0,5 g Imidazol, 0,05 g Natriumazid und 0,005 g Phenolrot. Die erfindungsgemäße Protektionslösung wird hergestellt, indem die einzelnen Komponenten eingewogen werden und nach Wasserzugabe und Einstellen auf das Volumen (hier: 100 ml) der pH-Wert-Wert kontrolliert wird. Die erhaltene Lösung wird bei 60°C eine Stunde gerührt, filtriert und der pH- Wert nochmals kontrolliert. Die für die erfindungsgemäße Protektionslösung benötigten Substanzen können von einschlägigen Anbietern, zum Beispiel Sigma, Deisenhofen, Deutschland bezogen werden. Der pH-Wert-Wert der erfindungsgemäßen Protektionslösung sollte bei 6,0 bis 6,4 bei 20°C liegen, die Osmolarität bei ca. 390 mOsm/kgH₂O.

Beispiel 2 Fixierung einer Gewebeprobe mit dem erfindungsgemäßen Verfahren

Das zu untersuchende. Gewebestück wird zum frühestmöglichen Zeitpunkt nach der Entnahme bei 4°C, vorzugsweise in einer sterilen Plastikpetrischale, kühl aufbewahrt, wobei es vor Austrocknung geschützt werden muß. Hierbei ist wichtig, daß es nicht in physiologischer Salzlösung aufbewahrt wird. Die Gewebe können in Stücke von maximal 10 mm Kantenlänge und 3 mm Dicke zugeschnitten werden und in Standardkassetten eingebracht werden. Um Möglichkeiten zur Diffusion zu schaffen, hat es sich bewährt, möglichst nur angeschnittene Organe bzw. Organscheiben zu verwenden und keine gekapselten Organe. Soll tiefgefrorenes Gewebe Verwendung finden, darf es vorher nicht auftauen, sondern wird noch gefroren in die Protektionslösung eingelegt. Die Kassetten werden in eiskalte erfindungsgemäße Protektionslösung gemäß Beispiel 1 eingelegt; beispielsweise in Kuvetten nach Hellendahl, die Platz für bis zu drei Kassetten bieten. Es erfolgt eine Inkubation bei Kühlschranktemperatur (möglichst nahe 0°C) für mindestens 12 bis maximal 18 Stunden, wobei in Ausnahmefällen auch längere Inkubationszeiten von bis zu drei Tagen möglich sind. Die Farbe der erfindungsgemäßen Protektionslösung, sofern Phenolrot als Indikator verwendet worden ist, sollte während der gesamten Dauer etwa gold-orange sein, um einen stabilen pH-Wert zu garantieren. Nach der Inkubation werden die Kassetten mit einer spitzen gebogenen Pinzette aus dem Bad herausgenommen und zwischen Filterpapier mehrmals von außen gründlich abgetrocknet. Hierbei ist darauf zu achten, daß eine möglicherweise vorhandene Infektiosität des untersuchten Gewebes zu diesem Zeitpunkt noch erhalten ist, so daß entsprechende Schutzmaßnahmen (Handschuhe) beachtet werden müssen. Die abgetrockneten Kassetten werden in eine neue Kuvette überführt, die mit eiskaltem reinem Aceton (0°-4°C), dem kurz zuvor 100 µl einer vorbereiteten Glyoxallösung gut vermischt zugegeben wurden, gefüllt ist und sofort wieder bei Kühlschranktemperatur inkubiert. Bei Nichtvorhandensein eines explosionsgeschützten Kühlschranks kann die Inkubation in eiskaltem Aceton auch unter einem Abzug in einer Kuvette in Eiswasser (ca. 0°C) vorgenommen werden. [Die Glyoxallösung wird hergestellt, indem 0,1 g Glyoxal, beispielsweise Sigma G-5754, in 20 ml erfindungsgemäßer Protektionslösung bei etwa 80°C für etwa 30 Minuten gerührt werden, bis eine klare hellbraune Lösung entstanden ist. Danach soll die Glyoxallösung abkühlen und wird im Kühlschrank vor der Zugabe zu dem Aceton aufbewahrt. Die Glyoxalzugabe in Aceton verhindert die Vernetzung von Proteinstrukturen.] Es ist darauf zu achten, daß proteolytische Enzyme auch jetzt noch aktiv sein können.

Die vorerwähnte Inkubation der Gewebeprobe in Aceton/Glyoxal bei Kühlschranktemperatur erfolgt für etwa 2 Stunden. Eventuelle weißliche Ausfällungen sind als normal zu betrachten. Danach wird die Kassette mit der Gewebsprobe herausgenommen, einmal kurz zwischen Filterpapier abgetrocknet und sofort wieder in eine neue Kuvette mit frischem eiskaltem Aceton gegeben. Wiederum wird für 2 Stunden inkubiert. Das Aceton wird noch zweimal gewechselt, wobei die Inkubationsdauer jeweils 2 Stunden betrug. Nach der letzten Inkubation werden die Kassetten einmal kurz abgetrocknet, wobei wiederum zu beachten ist, daß das Material immer noch potentiell infektiös sein kann und unverzüglich einzeln in Einmal-Wägeschalen (etwa 80 × 80 mm bei einer Höhe von etwa 20 mm), die mit reinem Paraffin (niedrigschmelzend von 52-54°C ohne Zusatzstoffe, z. B. MEDITE Tissuewax) gefüllt sind, überführt und in einen Brutschrank bei einer Temperatur von etwa 55°C bis 56°C verbracht. Beim Überführen ist darauf zu achten, daß Luftblasen möglichst entweichen können.

Am nächsten Morgen ist die Paraffinierung abgeschlossen. Die Gewebestücke werden in der üblichen Weise auf einer Wärmeplatte unter Zugabe von frischem Paraffin ausgebettet, wobei Luftblasen wiederum zu vermeiden sind. Die eingebettete biologische Probe wird sofort auf Eis abgekühlt. Hierbei können Rißbildungen im frischen Blöckchen häufiger auftreten als bei konventionell vorbekannten Routineeinbettungen, da es sich beim Paraffin um absolut reines Paraffin handelt. Die fertigen Blöckchen können im Kühlschrank bis zum Schneiden aufbewahrt werden.

Beispiel 3 Herstellung von Schnitten nach einer erfindungsgemäßen Fixierung

Im Kühlschrank gelagerte Paraffinblöckchen mit erfindungsgemäß fixiertem Gewebe werden im Mikrotom in üblicher Weise eingespannt. Als Streckmedium dient eine eiskalte 5%ige wäßrige Lösung von Aceton (für Anwendungen außer Immunhistochemie) oder eine eiskalte 4%ige wäßrige Lösung von Polyethylenglykol (zum Beispiel Sigma P 3015) (insbesondere für immunhistochemische Anwendungen). Die Schnitte sollten möglichst ohne Eintauchen auf die Oberfläche der Strecklösung plaziert werden. Danach werden sie mit einem gereinigten bzw. beschichteten Objektträger aus dem Streckmedium herausgehoben. Die Unterseite des Objektträgers wird mit Filterpapier abgewischt und auf eine 45°C warme Heizplatte zum Strecken gelegt. Sobald der Schnitt glatt auf dem Objektträger anliegt, sollte der Objektträger auf Filterpapier nochmals seitlich abgelaufen werden lassen und auf einem Ständer plaziert werden. Danach werden die Schnitte im Brutschrank bei 50°C ca. 1/2 Stunde trocknen gelassen. Aceton-gestreckte Leerschnitte können nun im Kühlschrank über mehrere Wochen aufbewahrt werden. PEG-gestreckte Schnitte haben eine kürzere Haltbarkeit von wenigen Tagen. Das benutzte Streckmedium kann nach einem Filtrierungsschritt wiederbenutzt werden.

Zum Entparaffinieren der Schnitte werden die Objektträger für 2 Minuten auf eine 60°C heiße Wärmeplatte (für Immunhistochemie: 10 Minuten auf eine 80°C heiße Platte, um störende endogene Enzymaktivitäten von alkalischer Phosphatase oder Peroxidase zu blockieren) plan gelegt. Nach der Inkubation wird der Objektträger unmittelbar in eine erste Kuvette mit 56-60°C warmen Isopropanol eingestellt. Nach 2 Minuten Inkubationszeit wird der Objektträger in einer zweiten Kuvette mit 56-60°C warmen Isopropanol intensiv gewaschen, worauf man das Isopropanol ablaufen und den Objektträger lufttrocknen läßt. Die nun entparaffinierten Schnitte können auch in diesem Stadium im Kühlschrank aufbewahrt werden, neigen jedoch leichter dazu, Wasser anzuziehen. Bei Verwendung anderer Lösungsmittel zum Entparaffinieren, wie beispielsweise Xylol, Chloroform, Rotihistol etc. muß mit Epitopschäden gerechnet werden, so daß die Verwendung von Isopropanol bevorzugt ist.

Zum Rehydrieren werden die Schnitte anschließend für mindestens 20 Minuten in 70-prozentigem eisgekühlten Aceton bei Kühlschranktemperatur inkubiert. Im Anschluß werden die Objektträger herausgenommen, ca. 5 Sekunden auf Filterpapier ablaufen gelassen und dann (noch feucht) in einer Kuvette mit eiskaltem destillierten Wasser gewaschen und in einer weiteren Kuvette mit Aqua dest. für 10 Minuten inkubiert. Das Wasser wird im Anschluß ablaufen gelassen, an der Unterseite des Objektträgers mit Filterpapier abgewischt und der Objektträger auf eine 45°C warme Heizplatte gelegt, bis das gesamte Wasser verdunstet und der Schnitt angetrocknet ist (etwa 1 bis 2 Minuten).

Die so hergestellten Schnitte lassen sich in verschiedener Weise verwenden. Beispielsweise können verschiedene Färbungstechniken auf die Schnitte angewendet werden, um bestimmte morphologische Strukturen sichtbar zu machen. Die Schnitte können mit Antikörpern behandelt werden, um das Vorhandensein bestimmter Antigene nachzuweisen oder sie können für in-situ-Hybridisierung verwendet werden. Nukleinsäure kann aus den Schnitten gewonnen werden und Einzelkerne können mit entsprechenden Mikrodissektions-Techniken aus dem Zellverband herausgelöst werden. Bei Verwendung der Schnitte zur Immunohistochemie sollten die Schnitte möglichst trocken mit der ersten Antikörperlösung überschichtet werden. Auf komplizierte Blockingverfahren kann in der Regel verzichtet werden. Antikörper und Enzymkonjugate sollten nur in PBS oder TBS gelöst werden. Antikörperverdünnungen sind analog wie bei Gefrierschnitten anzuwenden. Bei in-situ-Hybridisierungen kann auf komplizierte Blockingverfahren in der Regel verzichtet werden. Im Hybridisierungs-Mix sollte nach Möglichkeit kein SDS verwendet werden.

Beispiel 4 HE-Färbung erfindungsgemäß hergestellter Schnitte

Für eine HE-Färbung werden die rehydrierten Schnitte in eine Hämalaun-Lösung (beipielsweise nach Mayer) für 2 bis 4 Minuten verbracht. Danach werden sie in einer ersten Kuvette mit destilliertem Wasser intensiv gespült und in eine zweite Kuvette mit wiederum destilliertem Wasser gestellt. Unter fließendem Leitungswasser läßt man die Schnitte für etwa 1 bis 2 Minuten bläuen. In der Eosinfarblösung findet im Anschluß je nach Intensität eine Färbung von 2 bis 4 Minuten statt. Danach wird zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Im Anschluß werden die Objektträger kurz zweimal in 70-prozentigen Alkohol, beispielsweise Isopropanol, im Anschluß daran zweimal in absoluten Alkohol eingetaucht und zum Abschluß 10 Minuten in einer dritten Kuvette in absoluten Alkohol eingetaucht. Danach werden die Schnitte in einer Kuvette mit Xylol oder Rotihistol gespült, in einer weiteren Kuvette mit Xylol oder Rotihistol für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und nach kurzem Abtropfenlassen mit Deckgläsern eingedeckt.

Fig. 1 zeigt verschiedene Beispiele erfindungsgemäß fixierter Gewebe. Fig. 1A zeigt ein Mammakarzinom (HE-Färbung); Fig. 1B ein Mammakarzinom bei positivem immunhistochemischem Nachweis (gleiche Technik wie in Fig. 3) von Östrogen-Rezeptoren (Gegenfärbung mit Hämalaun); Fig. 1C ein Mammakarzinom bei negativem Nachweis von Progesteron-Rezeptoren (ebenfalls gegengefärbt mit Hämalaun) und Fig. 1D einen Ausschnitt aus dem Rektum (HE-Färbung).

Fig. 2 ist ein Vergleich von erfindungsgemäß und formalinfixiertem Gewebe, wobei beide Gewebe HE-gefärbt worden sind. Fig. 2A zeigt von oben nach unten in aufsteigender Vergrößerung Milzgewebe, das erfindungsgemäß fixiert worden ist. Fig. 2B zeigt von oben nach unten in aufsteigender Vergrößerung Formalin-fixiertes Milzgewebe.

Fig. 3 zeigt Beispiele für immunhistochemische Nachweise nach erfindungsgemäßer Fixierung mit kryogängigen Antikörpern (Fa. DAKO, Hamburg) wobei als Technik LSAB (= Labelled Streptavidin-Biotin) mit alkalischer Phosphatase und Neufuchsin zum Einsatz kam. Hierbei zeigt Fig. 3A Gewebe aus dem Endothel vom Appendix mit einem Nachweis für E-Selektin. Fig. 3B zeigt Gewebe aus dem Mesothel des Appendix mit einem Nachweis für VCAM. Fig. 3C zeigt T-Lymphozyten aus der Milz mit einem Nachweis für CD5. Fig. 3D zeigt Lymphgefäße des Appendix mit nachgewiesenem ICAM. Fig. 3E zeigt Gewebe aus dem Mesothel des Appendix, wiederum mit nachgewiesenem ICAM. Fig. 3F schließlich zeigt B-Lymphozyten aus der Milz mit Nachweis des Antigens CD22.

Fig. 4 stellt Beispiele für DNA in-situ-Hybridisierungen nach erfindungsgemäßer Fixierung vor. Hierbei zeigt Fig. 4A Plazentagewebe nach einer Doppelmarkierung mit Sonden für Chromosom 9 (classical satellite, Biotin/FITC, grünes Signal) (Fa. ONCOR) und für Chromosom 18 (alpha satellite, Digoxigenin/Rhodamin, rotes Signal) (Fa. ONCOR). Fig. 4B zeigt das gleiche Präparat nach Gegenfärbung mit DAPI. Fig. 4C zeigt Lebergewebe nach einer Einfachmarkierung mit der Sonde pUC1.77 (kostenlos zu beziehen von Cooke, H. J. and Hindley, J (1979), Nucl. Acids Res. 6: 3177-3197) für Chromosom 1 (alpha satellite, Biotin/Rhodamin) nach Gegenfärbung mit DAPI. Fig. 4D schließlich zeigt Nierengewebe, das wie das Gewebe aus Fig. 4C behandelt worden ist.

Beispiel 5 Vorbereitung zur DNA/RNA-Isolierung nach erfindungsgemäßer Fixierung

Die Schnitte werden mit einer spitzen gebogenen Pinzette in ein konisches Zentrifugenröhrchen mit 10 ml Volumen eingebracht. Es werden 4 ml 65°C bis 70°C warmes Isopropanol hinzugefügt und für etwa 30 Sekunden auf einem Reagenzglasschüttler mit kurzen Unterbrechungen gut durchgerüttelt. Im Anschluß wird das Zentrifugenröhrchen für 5 Minuten bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Durch die Temperaturerniedrigung in der Zentrifuge kann das vorher gelöste Paraffin nach dem Zentrifugieren wieder ausgefallen sein, was an einer festen weißlichen Schicht oberhalb des Präzipitats zu erkennen ist. Sollte dieser Fall eingetreten sein, wird das Röhrchen günstigerweise für 10 Minuten bei 65°C inkubiert. Das klare Isopropanol wird vorsichtig dekantiert und das Zentrifugenröhrchen vollkommen austropfen gelassen. Die Behandlung mit warmen Isopropanol, Zentrifugation und Dekantieren werden im Anschluß noch zweimal wiederholt.

Nach dem letzten Dekantieren werden 4 ml eiskaltes 70-prozentiges Aceton hinzugefügt, das Zentrifugenröhrchen mehrmals mit einem Reagenzglasrüttler gerüttelt und für 10 Minuten bei Kühlschranktemperatur inkubiert. Im Anschluß wird der Überstand soweit als möglich mit einer Pasteur-Pipette abgesaugt. Das Zugeben von eiskaltem Aceton und die folgenden Schritte werden einmal wiederholt.

Im Anschluß werden 4 ml eiskaltes 50-prozentiges Aceton in das Röhrchen pipettiert, dieses wird gerüttelt und 10 Minuten bei Kühlschranktemperatur inkubiert. Nach kurzem Rütteln, Zentrifugieren und Dekantieren wie oben beschrieben, kann im allgemeinen das Abgießen vollständig und ohne Abspülen von Material durchgeführt werden. Das Röhrchen wird geschüttelt, sofort zentrifugiert, abgegossen und im Anschluß sofort eiskaltes destilliertes Wasser eingefüllt und daraufhin nochmals für 10 Minuten bei Kühlschranktemperatur stehengelassen. Das Röhrchen wird im Anschluß wieder wie oben beschrieben zentrifugiert, dekantiert und sein Inhalt durch eine geeignete eiskalte Pufferlösung ersetzt.

Danach kann die Gewebeprobe entweder bei -85°C oder in Stickstoff eingefroren werden oder unmittelbar einer herkömmlichen DNA- bzw. RNA-Extraktion, wie bei Frischgewebe, unterzogen werden.

Fig. 5 zeigt beispielhaft die Ausbeute bei einer RNA-Isolierung aus erfindungsgemäß fixiertem Gewebe und konventionell formalinfixiertem Gewebe. Hierbei zeigen die Bahnen 1 bis 3 erfindungsgemäß fixiertes Gewebe, bei dem eine RNA-Isolierung mit dem RNazol-RNA-Isolierungskit (Fa. Campro- Scientific) unter verschiedenen Fixierungsrahmenbedingungen durchgeführt worden ist. Die Bahnen 4 bis 6 zeigen eine mittels dem RNA Isolationskit RNeasy (Fa. Qiagen, Hilden) durchgeführte RNA-Isolation aus Formalin-fixiertem Gewebe. Die Bahnen 7 bis 9 zeigen wiederum die Ergebnisse von RNA-Isolierung mit Hilfe des RNeasy-Isolationskits aus erfindungsgemäß fixiertem Gewebe. Bahn 10 ist frei, Bahn 11 zeigt einen Molekulargewichtsmarker. Es ist klar zu erkennen, daß nur mit erfindungsgemäß fixiertem Gewebe eine RNA-Isolierung noch möglich ist.

Claims (26)

1. Protektionslösung zur Anwendung in Fixierverfahren für die Paraffinschnitt-Technik, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest eine Aminosäure und zumindest eine Zuckerverbindung enthält.

2. Protektionslösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie 3 bis 20, vorzugsweise 5 bis 12, verschiedene Aminosäuren enthält.

3. Protektionslösung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest eine Aminosäure ausgewählt ist aus Glycin, L-Alanin, L-Prolin, L-Serin und/oder L-Glutaminsäure.

4. Protektionslösung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß jede der zumindest einen Aminosäuren in einer Konzentration von 1 bis 400 mM enthalten ist.

5. Protektionslösung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß jede der zumindest einen Aminosäuren in einer Konzentration von 10 bis 200 mM enthalten ist.

6. Protektionslösung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß jede der zumindest einen Aminosäuren in einer Konzentration von 10 bis 100 mM enthalten ist.

7. Protektionslösung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest eine Zuckerverbindung ausgewählt ist aus D-Glucose, D- Galactose oder D-Mannose.

8. Protektionslösung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß ihr pH 5 bis 7, vorzugsweise 5,8 bis 6,8, gemessen bei 20°C, beträgt.

9. Protektionslösung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie pH-gepuffert ist.

10. Protektionslösung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Puffersubstanzen HEPES und/oder Imidazol enthält.

11. Protektionslösung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Konservierungsmittel enthält.

12. Protektionslösung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie kein Aldehyd enthält.

13. Protektionslösung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie 75-85 mM Glycin, 40-50 mM L-Alanin, 12-22 mM L-Prolin, 33-43 mM L-Serin, 63 -73 mM L-Glutaminsäure, 15-19 mM HEPES, 71-75 mM Imidazol, 25-35 mM D-Glucose, 3-9 mM Natriumazid, und 0,005 g/100 ml Phenolrot in wässriger Lösung mit einem pH von 6,0 bis 6,4 bei 20°C enthält.

14. Protektionslösung nach Anspruch 13, wobei sie pro 100 ml wäßriger Lösung 0,6 g Glycin, 0,4 g L-Alanin, 0,2 g L-Prolin, 0,4 g L-Serin, 1,0 L-Glutaminsäure, 0,4 g HEPES-Pufffer, 0,6 g D-Glucose, 0,5 g Imidazol, 0,05 g Natriumazid und 0,005 g Phenolrot enthält.

15. Zubereitung, enthaltend die zur Herstellung einer bestimmten Menge an Protektionslösung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 notwendigen Substanzen als Feststoffe.

16. Zubereitung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Tablette vorliegt.

17. Fixierkit aufweisend:
zumindest eine Zubereitung der zur Herstellung einer vorbestimmten Menge an Protektionslösung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 notwendigen Substanzen als Feststoffe; und
eine weitere Lösung, welche zumindest ein zur Fixierung geeignetes Lösungsmittel enthält.

18. Fixierkit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die weitere Lösung Aceton enthält oder ist.

19. Fixierverfahren für biologische Proben mit folgenden Schritten:
Inkubieren einer biologische Probe mit einer Protektionslösung nach einem der Ansprüche 1 bis 14; und
Inkubieren der biologischen Probe mit einer weiteren Lösung, welche zumindest ein zur Fixierung geeignetes Lösungsmittel enthält.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es den weiteren Schritt aufweist: Einbetten der behandelten biologischen Probe in Paraffin.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkubieren mit der Protektionslösung für mindestens 4 Stunden erfolgt.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkubieren mit der Protektionslösung für 8 bis 100 Stunden, vorzugsweise für 10 bis 20 Stunden, erfolgt.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkubieren mit der Protektionslösung und/oder mit der weiteren Lösung bei einer Temperatur von 2°C bis 10°C erfolgt.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkubieren mit der weiteren Lösung für 1 bis 10 Stunden erfolgt.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkubieren mit der weiteren Lösung in mehreren Schritten mit jeweiligen Wechseln der weiteren Lösung erfolgt.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die weitere Lösung Aceton enthält oder ist.