DE602004004138T2

DE602004004138T2 - Verfahren zur vorbereitung histologischer proben

Info

Publication number: DE602004004138T2
Application number: DE602004004138T
Authority: DE
Inventors: Peter Erik BLEUEL; Willem Gerard HOFLAND
Original assignee: Academisch Ziekenhuis Groningen
Current assignee: Academisch Ziekenhuis Groningen
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2004-06-30
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2024-07-01
Also published as: NZ544311A; US7618828B2; CN1816737B; EP1644715B1; AU2004252386A1; ATE350657T1; CN1816737A; US20060228810A1; JP4519127B2; ES2279405T3; CA2530750A1; EP1644715A1; JP2007521488A; DE602004004138D1; WO2005001437A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verarbeitung einer biologischen Probe von der Fixierung bis zur Imprägnierung für die histologische Analyse. Insbesondere bezieht sie sich auf ein schnelles und sicheres automatisches Verarbeitungssystem, das mit kontinuierlichem Durchsatz betrieben werden kann und bei dem keine toxischen und entzündlichen Lösungsmittel, wie Xylol, verwendet werden.
Herkömmliche Verfahren zur Vorbereitung einer Probe (z.B. Gewebe) für die Histologie beinhalten die Inkubation in getrennten Lösungen von phosphatgepuffertem 10%igem Formaldehyd zur Fixierung, die Inkubation in einer Reihe von zunehmenden Konzentrationen von Alkohol zur Dehydratisierung und die Inkubation in Xylol zur Befreiung des Gewebes von Dehydratisierungsmittel vor der Imprägnierung. Wegen der für diesen Vorgang erforderlichen Zeit, gewöhnlich 8 Stunden oder länger, ist es üblich, diese getrennten Schritte, Fixierung, Dehydratisierung, Befreiung und Imprägnierung, über Nacht in automatischen mechanischen Instrumenten, die für solche Aufgaben entworfen sind, zu beenden (siehe zum Beispiel US 3,892,197 , US 4,141,312 und US 5,049,510 ).
Das Ziel der Gewebeverarbeitung besteht letztlich darin, der Probe durch ein Medium mit ähnlicher Härte inneren und äußeren Halt zu geben, so dass die Probe die Mikrotomie ohne Beschädigung übersteht. Das häufigste Einbettungs- oder Trägermedium ist Paraffin, aber es werden auch viele andere Substanzen verwendet. Mikrotomie ist der Vorgang des Schneidens einer eingebetteten Probe zu dünnen Schnitten von ungefähr 2 bis 8 μm Dicke mit einem scharfen Stahlmesser in einem Mikrotom. Dann werden die Schnitte auf Objektträger, gewöhnlich Mikroskopobjektträger, aufgenommen.
Zu den Standard-Paraffinverarbeitungsverfahren gehören die chemische Dehydratisierung durch abgestufte Alkohollösungen, dann das Eintauchen in eine Übergangslösung (gewöhnlich als Intermedium bezeichnet) und anschließend die Imprägnierung mit Paraffin. "Dehydratisierung" bedeutet die Entfernung von Wasser. Während der Verarbeitungsverfahren wird Dehydratisierung verwendet, um die freien Wassermoleküle und, wenn sie richtig durchgeführt wird, auch das molekular gebundene Wasser zu entfernen. Dehydratisierung wird normalerweise mit Hilfe von Alkohollösungen erreicht, am häufigsten mit Ethanol, Isopropylalkohol (Isopropanol), gelegentlich Methanol oder Butanol für Pflanzen- und Tiergewebe. Wenn die Proben nicht richtig dehydratisiert werden und Wasser in der Probe zurückbleibt, dringen das Intermedium und das Imprägnierungsmittel (zum Beispiel Paraffin) nicht in das Gewebe ein, und dieses ist weich und schlaff. Durch übermäßige Dehydratisierung wird das gebundene Wasser entfernt, was zu geschrumpften, harten, spröden Proben führt, die vor dem Schneiden eine übermäßige Rehydratisierung erfordern.
Fett in einer Gewebeprobe wird mit einem Lösungsmittel entfernt, da Fett die Entfernung des Dehydratisierungsmittels und die Imprägnierung beeinträchtigt. Eine unzureichende Fettentfernung (Entfettung) kann zur Ausbreitung von Artefakten von Gewebeschnitten, Faltung von Gewebeschnitten und schlechten Anfärbung führen. Fett kann mit verschiedenen Lösungsmitteln, wie zum Beispiel Aceton, Chloroform oder Xylol, aus der Gewebeprobe entfernt werden.
Nach der Dehydratisierung einer Probe wird ein "Intermedium" verwendet, um den für die Dehydratisierung verwendete Alkohol aus der Probe zu entfernen und die Probe für das Imprägnierungsmedium vorzubereiten. Intermedien, die auch als "Dealkoholisierungsmittel" bezeichnet werden, müssen sowohl mit dem Dehydratisierungsmittel als auch mit dem Imprägnierungs/Einbettungsmedium mischbar sein. Eine unzureichende Entfernung des Dehydratisierungsmittels, die dadurch, dass Wasser in der Probe bleibt, oder durch unzureichende Einwirkungszeiten verursacht sein kann, bewirkt eine schlechte Paraffininfiltrierung, die zu weichen, schlaffen Proben führt. Andererseits führt die übermäßige Einwirkung von Intermedien zu harten, spröden Proben, was durch die Denatu rierung der Gewebeprotein verursacht wird und der Auswirkung einer übermäßigen Dehydratisierung sehr ähnlich ist.
Xylol (Dimethylbenzol) ist seit vielen Jahren das am verbreitetsten verwendete Intermedium. Es ist ein aromatischer Kohlenwasserstoff, der Alkohol schnell ersetzt und einen Brechungsindex hat, der das Gewebe transparent machen kann. Ein Hauptnachteil von Xylol ist, dass es sehr aufwändig zu verwenden ist, weil es hochgradig flüchtig, entzündlich und ein mutmaßliches Karzinogen ist. Xylol sollte daher nur mit ausreichender Lüftung verwendet werden, und Hautkontakt sollte vermieden werden. Außerdem ist Xylol teuer.
Nach effektiven Ersatzstoffen für Xylol wurde aktiv gesucht. Ein erster Ersatzstoff, der 1981 vorgestellt wurde, war Limonen. Leider hat diese Chemikalie wegen mehrerer Probleme einen Schatten auf das Thema geworfen. Limonen ist ölig und kann nicht zuverlässig recycelt werden (die recycelte Lösung ist vom ursprünglichen Produkt verschieden). Sein Geruch ist überwältigend und dringt schnell in benachbarte Räume und Abteilungen vor. Am lästigsten ist die Tatsache, dass es bei exponierten Arbeitern ernsthafte Sensibilisierungsreaktionen verursacht. Weitere Xylol-Ersatzstoffe sind kurzkettige aliphatische Kohlenwasserstoffe (Alkane). Ätherische Öle können ebenfalls als Xylol-Ersatzstoff verwendet werden, aber sie sind nicht so üblich. Keiner dieser Xylol-Ersatzstoffe hat sich jedoch als so geeignet und kosteneffektiv wie Xylol erwiesen.
Herkömmliche Verfahren zur Gewebeverarbeitung können sowohl manuell als auch automatisch durchgeführt werden. Die meisten histopathologischen Labors verwenden jetzt automatische Gewebeverarbeitungsmaschinen, die mehrere Behälter verwenden und 6-20 Stunden für die Verarbeitung benötigen. Automatische Gewebeprozessoren, die solche herkömmlichen Verfahren implementieren, werden zum Beispiel von Shandon (Hypercenter- und Pathcentre-Modelle), Miles-Sakura (Tissue-Tek-Modell) und Mopec-Medite (TPC15-Modell) hergestellt und vertrieben.
Ein Nachteil der Systeme des Standes der Technik besteht darin, dass solche automatischen Systeme nicht zu kontinuierlichem Durchsatz befähigt sind. In Anbetracht der zur Beendung der Gewebeverarbeitung erforderlichen Zeit werden Cassetten, die Gewebe enthalten, am Tag in das System geladen, und die Gewebeverarbeitung wird in einem Zyklus über Nacht beendet. Der Betrieb der Systeme des Standes der Technik ermöglichte es also nicht, gewebehaltige Cassetten an einem Arbeitstag bis zu Ende zu verarbeiten.
Typischerweise erfordert diese herkömmliche Methode das Senden von Gewebeproben aus dem Operationssaal, der Praxis oder anderen Stellen zu einem pathologischen Labor irgendwann während des Arbeitstags, und anschließend wurden die Proben über Nacht diskontinuierlich verarbeitet, so dass eine zum Blockieren und Schneiden geeigneten Gewebeprobe frühestens erst am Morgen des nächsten Tages zur Verfügung steht; und das Stellen einer Diagnose durch einen Pathologen auf der Basis der mikroskopischen Untersuchung von Schnitten, die aus einer blockierten und geschnittenen Probe hergestellt werden, ist erst später an diesem nächsten Tag möglich. Dies erfordert mindestens fast 24 Stunden zwischen dem Empfang der Probe und der Abgabe des Berichts des Pathologen.
Außer der wenigstens eintägigen Verzögerung, bevor der Mediziner (z.B. ein Chirurg) in den Genuss eines Berichts vom Pathologen kommt, gibt es auch Probleme im Zusammenhang mit dem gehinderten Arbeitsfluss im pathologischen Labor, der durch die erforderliche diskontinuierliche Verarbeitung von Proben bedingt ist, die Sicherheitsbedenken, die mit einem über Nacht erfolgenden Betrieb von Instrumenten verbunden sind, die Gefahr von möglichen Instrumentenausfällen und die Notwendigkeit, die Instrumente zu überwachen, und die Verschwendung bei der Verwendung großer Volumina von Reagentien für diese Verarbeitung, wenn sie automatisiert ist. Außerdem sind teure Maßnahmen erforderlich, um eine Exposition von Laborpersonal gegenüber schädlichen Dämpfen und toxischen Substanzen, die mit den in diesem Verfahren verwendeten Reagentien (wie Xylol) verbunden sind, zu verhindern. Außerdem verschmutzen die großen Volumina an Lösungsmittelabfällen und Paraffintrüm mern, die durch die herkömmliche Methode produziert werden, die Umwelt, wenn sie nicht richtig entsorgt werden.
Es gibt ein stets vorhandenes Interesse an einer Beschleunigung der Gewebeverarbeitung und Analyse für diagnostische Zwecke. Weiterhin hat sich das Gesundheitswesen in letzter Zeit darauf konzentriert, die Kosten verschiedener Verfahren einschließlich Gewebeverarbeitung zu senken. Die Kosten einer Gewebeverarbeitung hängen mit der Zeit zur Verarbeitung und Analyse der Proben, dem für das Personal und die Geräte im Labor erforderlichen Raum, dem Volumen der Reagentien (sowohl der Bezugspreis der reinen Chemikalien als auch die Gebühren für die Entsorgung von Abfall) und der Anzahl des erforderlichen Personals zusammen. Am wichtigsten ist, dass Patienten und ihre Ärzte von der Bewertung und Diagnose durch den Pathologen abhängen, um die Behandlung zu planen. Eine Reduktion der zur Beendigung der Gewebeverarbeitung benötigten Zeit würde die Besorgnis verringern, die man während der Zeit zwischen dem Erhalt der Proben und der Abgabe des Berichts des Pathologen an den Arzt erfährt. Eine erhebliche Reduktion der für die Verarbeitung einer histologischen Probe erforderlichen Zeit ist also sehr wünschenswert. Andere haben die Notwendigkeit, die für die Gewebeverarbeitung erforderliche Zeit zu verkürzen, ebenfalls erkannt, aber sie haben nur mäßige Verbesserungen bei den herkömmlichen Verfahren erreicht. Um die Gewebeverarbeitung zu beschleunigen, verwenden die US-Patente Nr. 4,656,047, 4,839,194 und 5,244,787 Mikrowellenenergie, die US-Patente Nr. 3,961,097 und 5,089,288 verwenden Ultraschallenergie, und das US-Patent Nr. 5,023,187 verwendet Infrarotenergie. Das US-Patent Nr. 5,104,640 offenbart eine nichtwässrige Zusammensetzung aus einem Fixiermittel, einem Stabilisator und einem Lösungsvermittler, der einen Blutabstrich an einem Objektträger befestigt.
Die Erfinder beschreiben jetzt ein Verfahren für die Gewebeverarbeitung in einer Weise, die sich von jedem der zur Zeit verwendeten Verfahren unterscheidet. Angegeben wird ein Verfahren zur Verarbeitung einer biologischen Probe zur histologischen (oder pathologischen) Analyse, das das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer Zusammensetzung, die ein überkritisches oder fast überkriti sches Fluid umfasst, und das anschließende Imprägnieren der Probe mit einem Einbettungsmedium unter einem Druck von mehr als 1 bar umfasst.
Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist schneller als jedes der beschriebenen Verfahren, verursacht eine minimale Beschädigung des verarbeiteten Gewebes, vermeidet die Verwendung von organischen Lösungsmitteln einschließlich Xylol, verwendet minimale Mengen an Reagentien und führt überraschenderweise zu einer überlegenen Probe für die anschließende cytologische, histologische oder anatomische Analyse. Außerdem ist es bei einem Verfahren gemäß der Erfindung nicht mehr notwendig, große (Kunststoff-) Behälter mit einer entzündlichen Flüssigkeit, wie Ethanol oder Xylol, zu verwenden.
Ein überkritisches Fluid, das zuweilen auch überkritisches Gasfluid oder Fluidum genannt wird, ist irgendeine Substanz oberhalb ihrer kritischen Temperatur (T_c) und ihres kritischen Drucks (P_c). Für jede Substanz gibt es eine Temperatur, oberhalb derer sie nicht mehr als Flüssigkeit vorliegen kann, unabhängig davon, wie viel Druck angewendet wird. Ebenso gibt es einen Druck, oberhalb dessen die Substanz nicht mehr als Gas vorliegen kann, unabhängig davon, wie stark die Temperatur erhöht wird. Dieser Punkt wird kritischer Punkt genannt; die kritische Temperatur und der kritische Druck sind die definierenden Grenzen auf einem Phasendiagramm für eine reine Substanz.
Im überkritischen Bereich gibt es nur einen Zustand des Fluids. Ein überkritisches Fluid hat physikalisch-chemische Eigenschaften, die zwischen denen von Flüssigkeiten und von Gasen liegen. Überkritische Fluide (auch bekannt als hochkondensierte Gase) können sich leichter auf einer Oberfläche ausbreiten als eine echte Flüssigkeit, da sie geringere Oberflächenspannungen haben als Flüssigkeiten. Gleichzeitig behält ein überkritisches Fluid die Fähigkeit einer Flüssigkeit bei, Substanzen, die in den Verbindungen löslich sind, zu lösen, was ein Gas nicht kann.
Gemäß der Erfindung wird eine (Gewebe)Probe mit einem überkritischen Fluid in Kontakt gebracht oder mit diesem umgeben, was das Beaufschlagen der Probe mit der Zusammensetzung, die ein (fast) überkritisches Fluid umfasst, über den kritischen Druck (P_c) des überkritischen Fluids und das Erhitzen der Probe mit dem überkritischen Fluid über die kritische Temperatur (T_c) des überkritischen Fluids umfasst. Das überkritische Fluid dringt in eine Probe ein, während es in einem Hochdruckgefäß an der Probe vorbeiströmt. Es ist vielleicht nicht immer notwendig, eine Substanz zu verwenden, die sich an oder oberhalb ihres kritischen Punkts befindet (d.h. oberhalb ihres T_c und P_c), solange die Eigenschaften (insbesondere die Lösefähigkeit) der Substanz in einem Verfahren der Histoprozessierung von Nutzen sind. Zum Beispiel kann auch ein fast überkritisches Fluid, das sich auf einem Druck und einer Temperatur in der Nähe des kritischen Punkts befindet, vorteilhaft in einem hier angegebenen Verfahren verwendet werden. Gemäß der Erfindung ist der Ausdruck "fast überkritisches Fluid" definiert als Fluid bei einer Temperatur im Bereich des etwa 0,7- bis etwa 1,4-fachen seines T_c und bei einem Druck im Bereich des etwa 0,3- bis etwa 7-fachen seines PC.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Probe mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die (fast) überkritisches Kohlendioxid (CO₂) umfasst. Der kritische Druck von CO₂ beträgt etwa 7,3 MPa (73 bar), und die kritische Temperatur beträgt ungefähr 31° Celsius. Biologische Gewebe enthalten Proteine, die bei einer Temperatur oberhalb von ungefähr 60 °C denaturieren. Die relativ niedrige kritische Temperatur von CO₂ erlaubt es, eine Probe bei einer Temperatur, die im Wesentlichen keine schädlichen Auswirkungen auf die biologische Probe hat, mit einem überkritischen Fluid in Kontakt zu bringen. Andere (fast) überkritische Fluide mit einer relativ niedrigen kritischen Temperatur (vorzugsweise niedriger als 60 °C) sind jedoch ebenfalls für die Verwendung in einem Verfahren gemäß der Erfindung geeignet, zum Beispiel Xenon, Distickstoffoxid, Ethan, HFC-116, Chlortrifluormethan, Ethylen, Schwefelhexafluorid und Trifluormethan. CO₂ ist für industrielle Anwendungen äußerst attraktiv, da es das zweithäufigste und zweitbilligste Lösungsmittel auf der Erde ist. Es ist nicht entzündlich, ungiftig und leicht in hoher Reinheit verfügbar.
Ein Einbettungs- oder Trägermedium gibt der Probe mechanischen Halt, so dass Schnitte hergestellt werden können, zum Beispiel für die mikroskopische Untersuchung. Ein bevorzugtes Einbettungsmedium gemäß der Erfindung ist ein flüssiges Einbettungsmedium, zum Beispiel flüssiges Paraffin. Paraffin wurde in den Bespielen hier als Einbettungsmedium ausgewählt, da es in überkritischem CO₂ löslich ist (oder CO₂ umgekehrt in Paraffin löslich ist), billig und leicht zu handhaben ist und die Anfertigung von Bänderschnitten durch die Kohärenz der von diesem Material gelieferten Strukturen erleichtert wird. Weitere geeignete Einbettungs- oder Imprägnierungsmaterialien sind kommerzielle Wachsrezepturen, Gemische von Wachsen mit unterschiedlichen Schmelzpunkten (z.B. flüssiges Mineralöl und festes Paraffin), Paraplast, Bioloid, Embedol, Kunststoffe und dergleichen.
Gemäß der Erfindung wird eine Probe typischerweise zuerst in Ethanol oder eine andere Art von Dehydratisierungsmittel eingetaucht, um Wasser in der Probe zu ersetzen. Dann wird die Probe mit einem (fast) überkritischen Fluid beaufschlagt, um das Dehydratisierungsmittel, wie Ethanol, zu entfernen. Bei (fast) überkritischen Bedingungen sind das Dehydratisierungsmittel und das Fluid mischbar, d.h. sie lösen sich vollständig ineinander, unabhängig von den Anteilen der Komponenten. Anschließend wird das (fast) überkritische Fluid ersetzt, indem man ein Einbettungsmedium infiltriert, während ein erhöhter Druck, d.h. ein Druck oberhalb des Drucks von 1 bar (1 Atmosphäre, 1 kg/cm), aufrechterhalten wird. Das (fast) überkritische Fluid innerhalb der Probe wird in dem Einbettungsmedium gelöst, während es gleichzeitig allmählich durch das Paraffin ersetzt wird. Der erhöhte Druck während des Infiltrationsschritts gewährleistet, dass kein Gas in dem Gewebe eingeschlossen wird und dass die zellulären Strukturen erhalten bleiben. Vorzugsweise beträgt der angewendete Druck wenigstens 50 bar, besonders bevorzugt wenigstens 100 bar, wie 120 oder 150 bar oder noch höher, wie etwa 200 bar. Allgemein gesprochen gilt: Je höher der angewendete Druck, desto höher die Löslichkeit des (fast) überkritischen Fluids im Einbettungsmedium, und desto effizienter wird das Fluid durch das Einbettungsmedium ersetzt. Zum Beispiel wurde beobachtet, dass die Löslichkeit von CO₂ in flüssigem Paraffin bei 80 bar und 55 °C ungefähr 15 Gew.-%, bei 120 bar ungefähr 30 Gew.-% und bei 180 bar etwa 50 Gew.-% beträgt. Die Temperatur, bei der eine Imprägnierung gemäß der Erfindung durchgeführt werden kann, kann variieren und hängt unter anderem von dem verwendeten Einbettungsmedium ab. Typischerweise wird eine Temperatur oberhalb des Schmelzpunkts des Einbettungsmediums gewählt. Im Fall von Paraffin ist dies eine Temperatur von 56-58 °C. Unter erhöhtem Druck ist der Schmelzpunkt jedoch gewöhnlich reduziert. Zum Beispiel beginnt Paraffin bei einem Druck von 110 bar bei 51 °C zu schmelzen und ist bei 57 °C vollständig geschmolzen. Wenn man die Temperatur eines Reaktors, der eine Probe umfasst (siehe 1), über die Schmelztemperatur hinaus erhöht, erhöht sich der Druck im Reaktor. In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Probe 0,5 bis 1 Stunde lang bei einem Druck von 150 bar bei etwa 40 °C mit CO₂ in Kontakt gebracht, um Ethanol aus der Probe zu entfernen. Anschließend wird die Probe auf 65 °C erhitzt, während die Dichte von CO₂ aufrechterhalten wird, so dass sich der Druck auf etwa 220-250 bar erhöht. Man lässt flüssiges Paraffin in den Reaktor eintreten, während man CO₂ den Reaktor verlassen lässt, während man versucht, einen konstanten Druck aufrechtzuerhalten. Der Reaktor wird Ober einen Zeitraum von etwa 30 Minuten vollständig mit Paraffin gefüllt, um CO₂ aus der Probe zu entfernen und/oder zu lösen. Während dieses Stadiums des Verfahrens kann der Druck abfallen, zum Beispiel auf 100-140 bar. Sobald die Probe im Paraffin vollständig eingetaucht ist, kann der Druck allmählich gesenkt werden, um eine Diffusion von CO₂ aus dem Gewebe in das Paraffin zu ermöglichen und um zu vermeiden, dass CO₂-Bläschen in dem Gewebe eingeschlossen werden.
Nachdem die Probe entspannt wurde, kann es vorteilhaft sein, die Proben während einiger Zeit (z.B. 10-60 Minuten) in dem warmen Paraffin zu belassen.
Das Phänomen der erhöhten Löslichkeiten in überkritischen Fluiden ist seit den späten 1800er Jahren bekannt. Seit Jahrzehnten werden sie in Lebensmittelverarbeitungsindustrien verwendet, um Aromaverbindungen, wie Coffein und Hopfenöl, zu extrahieren. Das Auflösungsvermögen von überkritischen Fluiden ist empfindlich gegenüber kleinen Veränderungen in den Betriebsbedingungen, und es ist möglich, den Druck und die Temperatur fein abzustimmen, um die Lösefähigkeit eines überkritischen Fluids für ein besonderes Verfahren maßzuschneidern. Die wünschenswerten und einzigartigen Eigenschaften von überkritischen Fluiden gaben den Impuls für die Anwendung der Technologie der überkritischen Fluide auf verschiedene andere Probleme, zum Beispiel die Reinigung von Stoffen oder die Sanierung von kontaminiertem Boden.
Die Extraktion mit überkritischen Fluiden wird bei Verfahren zur Herstellung von sterilisiertem Gewebe zum Einbau in Xenotransplantate und bioprothetische Vorrichtungen verwendet. Die US-Patentanmeldung Nr. US 2003/0072677 beschreibt die Verwendung von überkritischen Fluiden zur Entfernung von infektiösen Materialien aus Geweben und zur Behandlung des Gewebes mit einem chemischen Agens. Im Unterschied zur vorliegenden Erfindung bezieht sich US 2003/0072677 nicht auf die Verarbeitung von Proben für die weitere Untersuchung, geschweige denn auf die Anwendung von überkritischen Fluiden in histologischen (Einbettungs-) Verfahren. Das US-Patent Nr. 6,493,964 offenbart eine Apparatur zum Trocknen im überkritischen Bereich zur Probenvorbereitung in der Elektronenmikroskopie und der Halbleiterwaferproduktion. Es verwendet die Technik des Ersetzens des Dehydratisierungsmittels in der Zellstruktur durch ein überkritisches "Übergangsfluid" und dann des Entfernens des Übergangsfluids. US 6,493,964 bezieht sich jedoch nicht auf die Probenimprägnierung und lehrt nicht oder legt nahe, dass überkritische Fluide vorteilhafterweise als Intermedium zwischen Dehydratisierungsmitteln und einem Einbettungsmedium verwendet werden, während ein erhöhter Druck aufrechterhalten wird, und dass eine solche Verwendung zu einer überlegenen Qualität der Probe (siehe unten) im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren führt. EP 0 822 403 bezieht sich auf die Verarbeitung von organischen Geweben, um sie für die weitere Untersuchung vorzubereiten, wobei ein Inertgas unter erhöhtem Druck verwendet wird, so dass die Probe bei höheren Temperaturen behandelt werden kann. Der Druck kann aufgebaut werden, indem man ein Inertgas in den Behälter einleitet, der die Gewebeprobe umfasst, zum Beispiel CO₂. Es wird erwähnt, dass ein Dehydratisierungs/Intermedium-Schritt vorzugsweise gleichzeitig bei einem Druck von bis zu 10 bar und bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis 90 °C durchgeführt wird. Unter diesen Bedingungen befindet sich CO₂ nicht in einem überkritischen oder fast überkritischen Zustand. Das Verfahren von EP 0 822 403 beinhaltet also ein ganz anderes Konzept als das Verfahren der Erfindung und beinhaltet kein (fast) überkritisches Fluid. Außerdem erwähnt EP 0 822 403 , dass die Imprägnierung vorzugsweise im Vakuum durchgeführt wird.
In einem Verfahren zur histologischen Verarbeitung gemäß der Erfindung wird eine Probe mit einem (fast) überkritischen Fluid behandelt und anschließend unter erhöhtem Druck mit einem Einbettungsmedium imprägniert. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren der Erfindung weiterhin eine Dehydratisierung, Entfettung und/oder Entkalkung der Probe vor der Imprägnierung. Diese zusätzlichen Verarbeitungsschritte können mit Hilfe der oben genannten herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden. Vorzugsweise jedoch werden sie unter Verwendung eines überkritischen Fluids durchgeführt. In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verarbeitung einer Probe angegeben, wobei die Verarbeitung die Dehydratisierung der Probe unter Verwendung eines überkritischen Fluids umfasst. Zum Beispiel wird eine Probe mit einem überkritischen Fluid in Kontakt gebracht, um Wasser aus der Probe in Lösung zu bringen und zu entfernen, bevor man die Probe mit einem Einbettungsmedium imprägniert. Ein überkritisches Fluid kann mit einem anderen Lösungsmittel gemischt werden, um das Extrahieren bestimmter Substanzen (z.B. Wasser) aus einer Probe zu unterstützen. In einer Ausführungsform wird eine Probe mit einer Zusammensetzung dehydratisiert, die ein überkritisches Fluid und ein Dehydratisierungsmittel, vorzugsweise einen Alkohol, wie Ethylalkohol (Ethanol; EtOH), oder ein Detergens, wie Tween, umfasst. Die Dehydratisierung unter Verwendung eines überkritischen Fluids, wie sie hier angegeben wird, erfolgt typischerweise schnell, zuweilen sogar innerhalb von Minuten. Die Erfindung kombiniert also das verbesserte Einbettungsverfahren mit einer attraktiven Alternative für die zeitraubende traditionelle, schrittweise erfolgende Dehydratisierung unter Verwendung von abgestuften Alkohollösungen. Vorteilhafterweise löst und extrahiert das überkritische Fluid andere Substanzen aus einer Probe, wie Fette und Lipide, wodurch das Schneiden einer Probe in dünne Scheiben erleichtert wird. In einer speziellen Ausführungsform umfasst das Verarbeiten einer Probe, insbesondere eines verkalkten Gewebes, wie einer Knochenprobe, das Entfernen von Calcium aus einer Probe. Die Entkalkung einer Probe ist wichtig, um dünne Scheiben aus Knochengewebe und anderen verkalkten Teilchen in Geweben schneiden zu können, da verkalkte Strukturen im Allgemeinen schwierig zu schneiden sind. Traditionelle Entkalkungsvorschriften erfordern die zusätzliche Inkubation einer fixierten Probe während einer bis fünf Nächten in einer sauren Entkalkungslösung (typischerweise Ameisensäure, Essigsäure, Salzsäure oder Salpetersäure). Entkalkung wird auch unter Verwendung eines Calciumchelators, wie EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), durchgeführt. Gemäß der Erfindung erfolgt die Entkalkung einer Probe einfacher und schneller als bei bestehenden Entkalkungsverfahren. Dazu wird eine biologische Probe mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die ein (fast) überkritisches Fluid umfasst, wobei die Zusammensetzung zusätzlich ein Entkalkungsmittel umfasst. Zu den geeigneten Entkalkungsmitteln gehören Säuren, wie Carbonsäuren, zum Beispiel Ameisensäure oder Essigsäure, und andere Chemikalien, die Calcium binden oder maskieren können.
Wenn eine Zusammensetzung, die ein überkritisches Fluid umfasst und zusätzlich ein Cosolvens (z.B. für Wasser und/oder Calcium) umfasst, verwendet wird, können das überkritische Fluid und das Cosolvens (z.B. ein Alkohol und/oder eine Säure) als Gemisch in einem Zylinder zugeführt werden. Ein weiteres Verfahren zum Zuführen des zusätzlichen Cosolvens kann erreicht werden, indem man zusätzliche Pumpensysteme vor Ort verwendet, um das erforderliche Cosolvens dem überkritischen Fluid beizumischen.
"Histologische Analyse" bezieht sich hier auf jede Art von Analyse, die durchgeführt werden kann, um das Erscheinungsbild, die Eigenschaften und das Verhalten eines Gewebes, einer Zelle, eines Organs oder eines Organismus zu untersuchen. Sie kann durchgeführt werden, indem man eine verarbeitete Probe unter einem Mikroskop in Augenschein nimmt. Eine (Komponente einer) verarbeitete(n) Probe kann mit einem oder mehreren Reagentien, wie einem Farbstoff, einem Reagens oder einer Sonde, die speziell gegenüber einer oder mehreren in der Probe vorhandenen Komponenten (wie Proteinen, Nucleinsäuren, Kohlenhydraten) reaktiv ist, in Kontakt gebracht werden, um einen bestimmten Zelltyp oder ein bestimmtes Gewebe zu identifizieren oder zu markieren. "Gewebe" bezieht sich auf eine Gruppe oder Schicht von Zellen, die im Wesentlichen gleich sind und zusammenwirken, um eine spezielle Funktion auszuüben. Zu den typischen Sonden gehören Antikörper (z.B. für die Immunhistochemie), Nucleinsäuresonden (RNA; DNA) (z.B. für in-situ-Hybridisierung oder PCR-Technik), Substrate zur Verwendung in der Enzymhistochemie (z.B. NADH zum Nachweis von Acetylcholinesterase- oder ATPase-Aktivität) und herkömmliche Färbechemikalien, wie Hämatoxylin und Eosin (H&E), Alcian-Blau für sulfatierte Mukosubstanzen, Brown-Brenn-Gram-Färbung für Gram-positive und Gram-negative Bakterien, Kongorot für Amyloid, Giemsa für H. pylori und Knochenmark, Gomoris modifizierte Eisenfärbung und viele andere Sonden, die dem Fachmann bekannt sind und nützlich sind, um einen bestimmten Zelltyp oder ein bestimmtes Gewebe, sei es normal oder krank, zu identifizieren oder zu markieren.
"Pathologische Analyse" bezieht sich auf eine histologische Analyse, die mit Pathologie zu tun hat. Typischerweise wird eine pathologische Analyse von einem Pathologen durchgeführt, der eine Krankheit diagnostiziert, indem er eine Probe, die Zellen und Gewebe umfasst, unter einem Mikroskop untersucht. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine pathologische Analyse die Analyse einer humanen Probe, um das Stadium oder den Grad einer Krankheit zu bestimmen.
Gemäß der Erfindung umfasst eine Probe eine biologische Probe, wie eine Gewebeprobe. Im Zusammenhang der Erfindung ist eine "Gewebeprobe" irgendein Gewebestück, das nach einem hier offenbarten Verfahren verarbeitet werden kann. Der Ausdruck kann sich auch auf einzelne Zellen aus irgendeiner biologischen Flüssigkeit (z.B. Aszites, Blut, Pleuraflüssigkeit) oder eine Zellsuspension, die durch Absaugen von soliden Organen oder Lavage von Körperhöhlen erhalten wird, beziehen. Einzelne Zellen können vor der Verarbeitung durch Sedimentation oder Auftriebszentrifugation pelletiert werden. Er kann sich auch auf ein intaktes Organ oder sogar einen intakten Organismus oder einen Teil davon beziehen. Zu den Organismen gehören einzellige und mehrzellige Organismen, die von Bakterien, Pilzen, Insekten und Pflanzen bis zu Säugern reichen. Für die Histologie und Pathologie werden gewöhnlich feste Stücke (d.h. Gewebeschnitte oder Nadelbiopsien) von einem menschlichen Patienten verarbeitet. Während herkömmliche Verfahren zur Fixierung und Einbettung eines Organs (z.B. Gehirn) bis zu 6-8 Wochen erfordern, erlaubt das Verfahren der Erfindung jetzt die Imprägnierung eines (intakten) Organs oder eines Teils davon mit einem festen Einbettungsmedium innerhalb eines Tags und ohne die Verwendung von toxischen Lösungsmitteln (Intermedium).
Mit einem Verfahren der Erfindung ist es möglich, die Gesamtverarbeitungszeit (von der Fixierung bis zur Imprägnierung) von den herkömmlichen 8-12 Stunden auf weniger als 2 Stunden, vorzugsweise weniger als 1,5 Stunden, besonders bevorzugt weniger als eine Stunde, zu reduzieren. Nirgendwo im Stand der Technik wird gelehrt oder nahegelegt, dass das gesamte Verfahren zur Herstellung von diagnostischen Gewebeschnitten in weniger als 1,5-2 Stunden durchgeführt werden könnte, angefangen von der Herstellung einer Probe aus einem fixierten oder nicht fixierten Gewebe bis zur Imprägnierung mit kontinuierlicher Verarbeitung von Proben, wobei die Verwendung von toxischen, möglicherweise karzinogenen Intermedien umgangen und eine überlegene Qualität der Probe erhalten wird. WO 01/44783 offenbart ein Gewebeprozessorsystem, das eine verbesserte Mikrowelleneinheit beinhaltet, die eine schnelle Verarbeitung unter zwei Stunden und gegebenenfalls ohne die Verwendung von Xylol-Intermedien erlaubt. Mit der Vorschrift von WO 01/44783 kann jedoch nur eine Gewebeprobe mit einer Dicke von weniger als etwa drei Millimetern verarbeitet werden. Dagegen können in einem Verfahren der vorliegenden Erfindung Proben mit einer Dicke von bis zu 5 mm, wie 8 mm oder sogar mehr als 1 cm, unter Verwendung eines überkritischen Fluids schnell verarbeitet werden. Wie oben erwähnt und im Unterschied zu WO 01/44783 ist das Verfahren der Erfindung nicht auf Gewebeproben oder kleine Gewebeschnitte beschränkt. Ein Verfahren gemäß der Erfindung erlaubt es, eine Probe mit einem Volumen im Bereich von etwa 0,001 cm³ (z.B. eine Biopsie) oder 1 cm³ (z.B. eine Hautprobe) bis zu 10 cm³ (z.B. ein kleiner Tumor) oder bis zu noch größeren Proben, wie solche mit einem Volumen von 2000 cm³ (z.B. ein Organ wie ein vollständiges Gehirn), zu verarbeiten. Im Allgemeinen gilt gemäß einem Verfahren der Erfindung: Je größer die Probe, desto länger dauert es, die Probe zu verarbeiten. Im Vergleich zum Stand der Technik nimmt jedoch der mit der vorliegenden Erfindung erreichte Zeitgewinn ebenfalls mit der Größe der Probe zu. Zum Beispiel wird eine Gewebeprobe von 20 × 15 × 5 mm gemäß einem Verfahren der Erfindung schnell dehydratisiert und imprägniert. Dies bietet insofern einen beträchtlichen Vorteil, als eine Probe mit einem solchen Volumen oder einer solchen Größe verarbeitet werden kann, dass es möglich ist, mehrere (Mikrotom-) Schnitte aus der Probe zu erhalten. Zum Beispiel kann ein Pathologe nach der histologischen Inspektion einer Probe dieselbe Probe, die mit einem speziellen Reagens, wie einem Antikörper, angefärbt wurde, in Augenschein nehmen wollen, um die histologische Analyse zu unterstützen. Die Verarbeitung einer Probe gemäß der Erfindung erlaubt es, einfach eine zweite, dritte oder eine noch größere Zahl von (parallelen) Schnitten aus derselben Probe zu erhalten. Wenn die Probe schon vor der Verarbeitung kleiner als 3 Millimeter ist, wie es in WO 01/44783 der Fall ist, ist dies offensichtlich nicht möglich. Stattdessen müssen gleich zu Anfang mehrere Proben genommen werden, und ihre relative Orientierung muss sorgfältig registriert werden, um ihre Verbindung in situ zu rekonstruieren.
Die histologische Analyse verschiedener Typen von humanen Gewebeproben, die unter Verwendung eines überkritischen Fluids gemäß der Erfindung verarbeitet wurden, zeigte überraschenderweise eine überlegene Qualität der Probe im Vergleich zu Proben aus derselben Gewebeprobe, die nach herkömmlichen Verfahren verarbeitet wurden. Zum Beispiel ist das in 3 gezeigte Keratinfärbungsmuster einer humanen Kolonprobe nach der Verarbeitung unter Verwendung von Kohlendioxid intensiver als das Keratinfärbungsmuster von 2, die eine Probe aus derselben Kolonprobe zeigt, die mit Hilfe von herkömmlichen Verfahren verarbeitet wurde. Ebenso konnte eine verbesserte histologische Analyse an einer vimentingefärbten humanen Gallenblasenprobe, die gemäß dem Verfahren der Erfindung verarbeitet wurde (vergleiche 3 und 4), und an einer humanen Nervenprobe, die auf S-100-Protein angefärbt wurde (vergleiche 6 und 7), durchgeführt werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Probe, bevor sie nach einem Verfahren gemäß der Erfindung verarbeitet wird, nach herkömmlichen Verfahren fixiert, zum Beispiel unter Verwendung einer Formaldehydlösung (auch als Formalin bekannt). Formaldehyd (CH2O) reagiert mit terminalen freien NH₂-Gruppen von Proteinen und bildet kovalente Methylenbrücken zwischen zwei Komponenten eines Proteins oder zwischen zwei verschiedenen Proteinen. Ein Hauptnachteil der herkömmlichen Fixierung und Gewebeverarbeitung (d.h. zu Paraffinblöcken) liegt jedoch darin, dass sie eine irreversible Beschädigung (z.B. Hydrolyse einer Phosphodiesterbindung und/oder Deamidierung) der Struktur von Nucleinsäuren (z.B. DNA und insbesondere RNA) verursachen kann. Dementsprechend schränkt das Fixieren und Verarbeiten einer (Gewebe)Probe zu einem Paraffinblock die Anwendung von genetischen Techniken für die Diagnose und Forschung ein.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Probe, die zuvor eingefroren wurde, nach einem Verfahren der Erfindung verarbeitet. Es ist in dem Fachgebiet bekannt, dass die meisten DNA- und bestimmte RNA-Analysen spezielle Vorsichtsmaßnahmen bei der Handhabung des Probenmaterials erfordern, wie ein sofortiges ("Blitz-") Einfrieren von frischen Geweben in flüssigem Stickstoff, um einen Nucleinsäureabbau zu verhindern. Ein Verfahren der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um eine (blitz)gefrorene Probe zu imprägnieren, und die Erfindung gibt somit ein Verfahren an, um eine verarbeitete biologische Probe zu erhalten, die anschließend mit verschiedenen Typen der histologischen Analyse einschließlich Nucleinsäureanalyse (DNA, RNA) analysiert werden kann. Andererseits jedoch kann die histologische Diagnose eines gefrorenen Schnitts auch Nachteile haben im Vergleich zu Schnitten, die aus Paraffinblöcken hergestellt sind. Zum Beispiel unterliegen gefrorene Proben einer Dehydratisierung. Die Lagerung gefrorener Proben erfordert daher Maßnahmen, um eine Dehydratisierung zu verhindern. Wichtig ist, dass gefrorene Gewebe oft viele Artefakte zeigen, die durch die Anwesenheit von Eiskristallen in der Probe verursacht werden. Es kann also zuweilen schwierig sein, die Vorteile und Nachteile, die entweder mit einer fixierten oder mit einer gefrorenen Probe verbunden sind, ausreichend gegeneinander abzuwägen.
Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Verarbeitung einer Probe liefert jetzt eine elegante Lösung dieser Probleme, da es neben der Verarbeitung einer fixierten oder gefrorenen Probe auch eine schnelle Verarbeitung einer frischen Probe erlaubt, die nicht fixiert oder eingefroren wurde, bevor sie mit einem überkritischen Fluid in Kontakt gebracht wurde. Anstelle des Einfrierens oder der Verwendung eines chemischen Fixiermittels gewährleistet der hohe Druck, den die Probe während des Kontakts mit einem überkritischen Fluid erfährt, und die schnelle Imprägnierung mit einem Einbettungsmedium (z.B. Paraffinwachs) unter erhöhtem Druck eine optimale Erhaltung der Struktur und Architektur. Überraschenderweise tritt keine Beschädigung der Gewebeprobe auf, wenn der Druck erhöht und anschließend allmählich wieder gesenkt wird. Die Beaufschlagung des Gewebes kann relativ schnell durchgeführt werden. Die Zellen innerhalb des Gewebes sind mit Flüssigkeit gefüllt, die einer schnellen Druckzunahme widersteht. Die Probe sollte jedoch allmählich entspannt werden, um eine schnelle Ausdehnung des Fluids und ein Aufreißen der Zellen zu vermeiden. Die Erfindung liefert also eine attraktive Alternative zum Blitzeinfrieren einer Probe und erlaubt die Herstellung einer Probe, die mit mehreren Typen von (pathologischer) Analyse einschließlich histologischer, biochemischer und Nucleinsäureanalyse ohne die Verwendung von Formalin verträglich ist.
Wichtig ist, dass zusätzlich zur Reduktion der zur Gewebeverarbeitung erforderlichen Zeit die schnelle Gewebevorbereitung unter Verwendung eines überkritischen Fluids es erlaubt, Gewebestrukturen und -morphologie zu bewahren, die bei den herkömmlichen Methoden verloren gehen. Glycogen, das eine wichtige Verbindung ist, die biologischen Strukturen Festigkeit verleiht, geht bei Verwendung der herkömmlichen Methoden fast immer verloren. Lymphatische Gefäße, insbesondere des Myometriums, kollabieren während der herkömmlichen Verarbeitung, während sie im Wesentlichen intakt bleiben, wenn ein Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Außerdem weisen Studien mit Geweben, die gemäß der Erfindung verarbeitet wurden, auf eine bessere Erhaltung der DNA- und RNA-Extraktion im Vergleich zu herkömmlichen Verarbeitungsverfahren hin. Gewebe, die in Krankenhäusern und anderen chirurgischen Einrichtungen erhalten werden, können bald nach der Einlieferung ins Labor sowohl für histologische als auch für genetische Studien verarbeitet werden. Da eine gemäß der Erfindung verarbeitete Probe außerdem typischerweise gut erhalten ist, kann archiviertes Probenmaterial für zukünftige Forschung und andere Anwendungen zugänglich gemacht werden.
Die vorliegende Erfindung verhindert nicht die Präparierung von Nucleinsäuren, DNA oder RNA aus verarbeiteten Proben. Somit ist eine genetische Studie bei Proben möglich, die routinemäßig im klinischen pathologischen Labor gewonnen wurden. Die kombinierte Kraft dieser Technologien wird groß sein. Histologische Beobachtungen können mit Ergebnissen von genetischen Studien korreliert werden, indem man einen histochemischen Schnitt durch Anfärben oder Immunhistochemie analysiert und Nucleinsäuren aus einem benachbarten Schnitt in einer genetischen Analyse analysiert (zum Beispiel unter Verwendung von PCR-Techniken). Zum Beispiel können kranke und normale Bereiche desselben Schnitts miteinander verglichen werden, um genetische Unterschiede (z.B. Mutationen, Transcriptionsniveaus) nachzuweisen, der Fortschritt einer Krankheit kann charakterisiert werden, indem man genetische Unterschiede in Proben, die zu verschiedenen Zeitpunkten genommen wurden, miteinander vergleicht, und die Tumorentwicklung kann bewertet werden, indem man die Akkumulation von genetischen Unterschieden vom primären Krebs bis zur Metastase verfolgt.
Ein weiterer Vorteil des Verfahrens gemäß der Erfindung bezieht sich auf die Orientierung der Probe. Die Orientierung der Probe ist der Schlüssel zum Erreichen des Endergebnisses, der richtigen Diagnose. Bei bestehenden Verfahren wird eine verarbeitete (eingebettete) Probe in einem Probenhalter oder einer Form platziert, um das Schneiden des Gewebes in einem Mikrotom zu ermöglichen. Die Fixierung und Immobilisierung einer Probe, die häufig klein und zerbrechlich ist, in der korrekten Orientierung in einem Halter ist oft mühsam. Da die meisten Leime nicht mit den bei der Histoprozessierung verwendeten organischen Lösungsmitteln verträglich sind, werden typischerweise Formen mit einer aufgerauten oder "klebrigen" Oberfläche verwendet, um eine Probe am Boden einer Form oder eines Halters zu befestigen. Diese Halter fixieren jedoch eine Probe häufig nicht ausreichend, um sie schneiden zu können. Andere Probenhalter sind mit Schnappdeckeln versehen, um eine Probe zu immobilisieren, indem man einfach eine Probe zwischen dem Boden und dem Deckel einklemmt. Dennoch sind diese Halter für zarte Proben, wie Haut- oder Epithelgewebe, nicht geeignet, da der zum Einklemmen einer Probe erforderliche Druck leicht die Integrität solcher Gewebe zerstört, was sich zum Beispiel anhand von kollabierten Blutgefäßen zeigt. Die Erfindung liefert jetzt eine Lösung dieser Probleme. Da ein Verfahren der Erfindung keine organischen Lösungsmittel (Xylole) mehr erfordert, die zuvor die Verwendung von Leimen unmöglich machten, kann jetzt eine Probe einfach in einer gewünschten Orientierung auf den Boden eines Halters geleimt werden. Wie bereits erwähnt, wird das Verfahren der Erfindung außerdem zweckmäßigerweise verwendet, um Proben von beträchtlich größerem Ausmaß zu imprägnieren, als bisher verwendet werden konnten. Infolgedessen ist es jetzt sogar möglich, ein intaktes Gewebe, Organ oder sogar einen Organismus vor der Verarbeitung zuerst zu orientieren. Zum Beispiel wird ein Tumor im Operationssaal entfernt. Anstatt den Tumor in viele kleine Proben zu zerschneiden, wobei man ihre relative Orientierung sorgfältig verfolgt, erlaubt es die Erfindung jetzt, den ganzen intakten Tumor zu orientieren und einzubetten.
Wir haben ein einfaches, sicheres, kostengünstiges, schnelles und zuverlässiges Verfahren entwickelt, das die Herstellung von imprägnierten Gewebeblöcken erlaubt, die für das Schneiden mit dem Mikrotom in weniger als 1,5 Stunden ab dem Zeitpunkt, an dem das Gewebe im pathologischen Labor empfangen wird, geeignet sind. Die Erfindung erlaubt die kontinuierliche Verarbeitung und den Fluss von Proben, entweder frisch, fixiert oder gefroren, ist automatisierbar, erübrigt die Notwendigkeit von Formalin und Xylol mit ihren schädlichen Dämpfen, erlaubt eine Standardisierung der Gewebeverarbeitung und erfordert erheblich kleinere Volumina von Reagentien als herkömmliche Verfahren. Unter "kontinuierlicher" Verarbeitung verstehen wir die Bewertung des Systems der Erfindung mit zusätzlichen Gewebeproben in Abständen, die durch die zur Beendigung eines einzelnen Schritts des Verfahrens erforderliche Zeit (d.h. wenige Minuten) und nicht durch die zur Beendigung des Verfahrens erforderliche Zeit (d.h. eine Stunde bis mehrere Stunden) bestimmt werden. Zu einem gegebenen Zeitpunkt kann es Proben in unterschiedlichen Stadien der Verarbeitung geben. Mit anderen Worten, durch die Erfindung wird ein kontinuierlicher Durchsatz und Fluss von Proben entlang der verschiedenen Stadien der Gewebeverarbeitung ermöglicht. Die kontinuierliche Verarbeitung kann manuell oder durch ein automatisiertes Instrument, wie einen Gewebeprozessor, erreicht werden.
In einem Aspekt der Erfindung wird ein Prozessor zur Verwendung in einem Verfahren der Erfindung bereitgestellt. Eine Ausführungsform eines solchen Prozessors gemäß der vorliegenden Erfindung wird jetzt als Beispiel unter Bezugnahme auf 1 in der Begleitzeichnung beschrieben.
1 zeigt schematisch ein Beispiel für einen Prozessor gemäß der Erfindung.
Der Prozessor 1 von 1 umfasst einen Vorratstank 3 und ein Leitungssystem 4. Das Leitungssystem 4 hat einen Einlass 2 zum Zuführen einer Substanz zu dem Prozessor, von der in diesem Beispiel angenommen wird, dass es sich um flüssiges Kohlendioxid handelt. Das Kohlendioxid wird durch eine Leitung des Leitungssystems 4 durch einen Kühler 13 in den Vorratstank 3 transportiert. Der Prozessor 1 umfasst stromabwärts des Vorratstanks 3 Druckbeaufschlagungseinrichtungen 5 und Heizeinrichtungen 6, die beide dazu dienen, das Kohlendioxid auf die erforderlichen Bedingungen zu bringen. Das Kohlendioxid wird einem Verfahrensreaktor 9 zugeführt. Dieser Reaktor 9 kann Proben 10 enthalten, die vom Prozessor 1 für die histologische Analyse vorbereitet werden sollen. Der Reaktor 9 umfasst Heiz- und/oder Kühleinrichtungen 14, um das Kohlendioxid im Reaktor 9 auf den erforderlichen Bedingungen zu halten. Mit diesen Konditionierungseinrichtungen 14 des Reaktors 9 können die verschiedenen Schritte der verschiedenen Verfahren der Erfindung, wie sie oben beschrieben sind, in dem Verfahrensreaktor 9 durchgeführt werden. Stromabwärts des Verfahrensreaktors 9 umfasst der Prozessor 1 weiterhin ein Drucksteuerventil 16, anschließend gefolgt von Trenneinrichtungen 11 zum Abtrennen verschiedener Substanzen aus dem Substanzgemisch, das den Reaktor 9 verlässt. Die extrahierten Substanzen, wie Alkohol, Paraffin, Wasser usw., können die Extraktionseinrichtung durch Auslässe 12 verlassen. Einige dieser Substanzen, zum Beispiel Paraffin, können wiederverwendet werden. Das aus dem Gemisch zurückbleibende Kohlendioxid kann recycelt werden. Zu diesem Zweck wird es aus der Trenneinrichtung 11 über die Leitung 4 in eine Recyclingeinrichtung 13 geleitet, zum Beispiel einen Kohlendioxidgas-Kühler 13, der im Leitungssystem 4 des Prozessors 1 enthalten ist, und danach wird das verflüssigte Kohlendioxid wieder dem Vorratstank 3 zugeführt. Wenn der Reaktor 9 ausreichend mit Kohlendioxid gespült ist, wird die Pumpe 5 angehalten, und das Druckgefäß 7, das das Einbettungsmedium (z.B. Paraffin) enthält, wird durch Öffnen des Ventils 17 in den Reaktor 9 geleert, so dass das Einbettungsmittel aufgrund der Schwerkraft durch die Leitung 8 fließt und in den Reaktor 9 fließt. Druckgefäß 7 wird unter Druck gehalten, da es mit der Leitung 4 verbunden ist. Hier werden die Proben 10 mit dem Einbettungsmedium imprägniert, und danach können der Reaktor 9 und das Druckgefäß 9 anschließend über die Leitung 4A in das Trenngefäß 11 entspannt und durch den Auslass 15 entleert werden.
Nachdem ein Beispiel für einen Prozessor 1 gemäß der Erfindung beschrieben wurde, werden dem Fachmann viele Modifikationen desselben einfallen, ohne von der Erfindung abzuweichen, die durch den Umfang der beigefügten Ansprüche definiert ist. Zum Beispiel ist es möglich, in einem einzigen Prozessor eine größere Zahl von Reaktoren, Druckgefäßen, Vorratstanks, Pumpen, Kontrolleinrichtungen, Ventilen usw. anzuwenden. Die Pumpen können zum Beispiel verwendet werden, um Cosolventien oder Dehydrierungsmittel (z.B. Ethanol, Aceton, Formaldehyd usw.) hinzuzufügen.
Beispiel
Humane Gallenblasen-, Colon- und Nervenproben, die mit Ethanol imprägniert wurden, wurden in einen 1-Liter-Reaktor gegeben. Der Reaktor wurde auf einer Temperatur von 40 °C gehalten. Der Reaktor wurde geschlossen und mit Kohlendioxid bei 40 °C auf einen Druck von 150 bar gebracht. Während der Druck durch Anwendung eines Steuerventils auf 150 bar gehalten wurde, wurde der Reaktor mit einer Geschwindigkeit von 10 kg/h mit frischem Kohlendioxid gespült, wobei eine Pumpe angewendet wurde. Nach 45 Minuten wurde die Pumpe gestoppt, und die Temperatur wurde auf 60 °C erhöht, wobei der Druck auf ungefähr 230 bar erhöht wurde Geschmolzenes Paraffin von 60°C wurde langsam mit einer Geschwindigkeit von 2 Liter/h in den Reaktor gepumpt, wobei die Probe imprägniert wurde, während ein Druck von 210 bar aufrechterhalten wurde. Nachdem der Reaktor fast vollständig mit Paraffin gefüllt war, wurde der Reaktor in 10 Minuten entspannt. Überschüssiges Paraffin wurde aus dem Reaktor ablaufen gelassen, und der Reaktor wurde auf 40 °C abgekühlt, und danach wurden die eingebetteten Proben aus dem Reaktor entnommen. Die Proben wurden nach herkömmlichen Verfahren histologisch analysiert.
Legenden
1

Beispiel für einen Prozessor gemäß der Erfindung.

2

Humane Colonprobe (100x; Ausschnitt 400x), verarbeitet gemäß dem herkömmlichen automatisierten Hochdurchsatz-Sakura-VIP-300-Tischgewebeprozessor. Kerstin wurde unter Verwendung von Keratine 20 (monoklonaler Maus-Anti-Human-Cytokeratin-20-Klon, K_s 20,8, Klon Nr. M7019, Charge 067, von Dako) angefärbt. Ein automatischer Ventana-NexES^TM-Immunostainer wurde verwendet.
Spezifität: Epithelzellen der Schleimhaut des Dickdarms werden angefärbt, keine Hintergrundfärbung sichtbar.
Intensität: diffuses Färbungsmuster entlang der gesamten Krypte.

3

Humane Colonprobe (100x; Ausschnitt 400x) aus derselben Probe, wie sie in 2 gezeigt ist, aber verarbeitet unter Verwendung von überkritischem Kohlendioxid. Die Färbung wurde so durchgeführt, wie es für 2 beschrieben ist.
Spezifität: Epithelzellen in der Schleimhaut des Dickdarms werden angefärbt, keine Hintergrundfärbung sichtbar.
Intensität: diffuse Färbung entlang der gesamten Krypte, Färbung ist im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren (VIP) verstärkt.

4

Humane Gallenblasenprobe (100x; Ausschnitt 400x), verarbeitet nach dem Standardverfahren VIP300.
Vimentin wurde unter Verwendung eines Anti-Vimentin-Antikörpers (Klon vim 3B4, Kat-Nr. 112457, Boehringer Mannheim) und mit der Ventana-Färbung gemäß der Vorschrift angefärbt.
Spezifität: Mesenchymzellen in der Lamina propria und den tieferen Schichten der Gallenblase werden angefärbt. Epithelzellen sind negativ.
Intensität: diffuse intracytoplasmatische Färbung der Mesenchymzellen.

5

Humane Gallenblasenprobe (100x; Ausschnitt 400x) aus derselben Probe, wie sie in 4 gezeigt ist, aber verarbeitet unter Verwendung von überkritischem Kohlendioxid.
Die Färbung wurde so durchgeführt, wie es für 4 beschrieben ist.
Spezifität: Mesenchymzellen werden in der Lamina propria und den tieferen Schichten der Gallenblase angefärbt.
Intensität: im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren (VIP) verstärkt.

6

Humane Nervenprobe (400x), verarbeitet nach dem Standardverfahren VIP300. Die Färbung wurde unter Verwendung des Antikörpers S-100, Code Nr. Z 311, Charge Nr. 026, Dako, durchgeführt. Ventana-Färbung gemäß Vorschrift.
Spezifität: Nerven werden angefärbt, und andere Strukturen sind negativ.
Intensität: diffuse intracytoplasmatische Färbung der Schwann-Zellen und der Neuronen. Keine Hintergrundfärbung sichtbar.

7

Humane Nervenprobe (400x) aus derselben Probe, wie sie in 6 gezeigt ist, aber verarbeitet unter Verwendung von überkritischem Kohlendioxid.
Die Färbung wurde so durchgeführt, wie es für 6 beschrieben ist.
Spezifität: Nerven werden angefärbt, und andere Strukturen sind negativ.
Intensität: starke Färbung der Schwann-Zellen und der Neuronen. Keine Hintergrundfärbung sichtbar.

Claims

Verfahren zur Verarbeitung einer biologischen Probe zur histologischen Analyse, das die folgenden Schritte umfasst: a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Dehydratisierungsmittel; b) Entfernen des Dehydratisierungsmittels mit einer Zusammensetzung; und c) Ersetzen des überkritischen Fluids durch Infiltrieren eines Einbettungsmediums, vorzugsweise Paraffin, bei einem Druck von 1 bar; dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung ein überkritisches oder fast überkritisches Fluid bei einer Temperatur im Bereich des 0,7- bis 1,4-fachen seiner kritischen Temperatur und bei einem Druck im Bereich des 0,3- bis 7-fachen seines kritischen Drucks umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem überkritischen oder fast überkritischen Fluid um Kohlendioxid handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die biologische Probe eine frische, gefrorene oder fixierte Gewebeprobe, vorzugsweise eine frische, unfixierte Probe, ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die biologische Probe ein Organ oder ein Teil davon umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Probe vor der Imprägnierung dehydratisiert, entfettet und/oder entkalkt wird, indem man eine Zusammensetzung verwendet, die ein überkritisches Fluid umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Zusammensetzung zusätzlich ein Dehydratisierungsmittel, vorzugsweise einen Alkohol, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei die Zusammensetzung zusätzlich ein Entkalkungsmittel, vorzugsweise eine Säure, umfasst.
Prozessor (1) zur Herstellung wenigstens einer Probe (10) für die histologische Analyse, der wenigstens einen Prozessreaktor (9) für die wenigstens eine Probe (10) umfasst, wobei der Prozessor (1) Zufuhreinrichtungen (4), um dem Reaktor (9) wenigstens eine Substanz zuzuführen, und wenigstens eine Zufuhreinrichtung (7), um dem Reaktor (9) durch die Leitung (8) das Einbettungsmedium zuzuführen, umfasst, wobei der Prozessor dadurch gekennzeichnet ist, dass eine der zugeführten Substanzen im überkritischen oder fast überkritischen Zustand vorliegt und der Prozessor weiterhin Druckbeaufschlagungs- und/oder Erhitzungseinrichtungen (5, 6) umfasst, um die im überkritischen oder fast überkritischen Zustand vorliegende Substanz auf den erforderlichen Druck im Bereich des 0,3- bis 7-fachen ihres kritischen Drucks und/oder die erforderliche Temperatur im Bereich des 0,7- bis 1,4-fachen ihrer kritischen Temperatur zu bringen.
Prozessor (1) gemäß Anspruch 8, der weiterhin Trenneinrichtungen (11) umfasst, um Substanzen aus einem Gemisch von Substanzen, das den Reaktor (9) verlässt, abzutrennen.
Prozessor (1) gemäß Anspruch 8 oder 9, der weiterhin Rückführungseinrichtungen (13) zum Zurückführen von aus dem Reaktor (9) ausgetragenen Substanzen in den Kreislauf umfasst.
Verwendung eines Prozessors gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10 zur Verarbeitung einer biologischen Probe zur histologischen Analyse.