CN103674677B - 一种脑组织快速冰冻切片的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脑组织快速冰冻切片的制备方法。本发明利用经过丙酮作为冰冻包埋剂及液氮中间介质，不但可以使脑组织达到速冻的效果，还能使脑组织有效的减少冰晶的形成，其次，本发明通过对影响冰冻切片制作质量的因素，例如取材、切片时的温度以及切片后的固定、储存条件等进行优化，进一步保证了最后制备得到的切片的质量。通过本发明方法获得的脑组织快速冰冻切片为下一步对脑组织进行免疫荧光、免疫组化以及原位杂交实验提供一种具有稳定性、能够很好的保护好抗原及酶活性的冰冻切片，为将来的有关神经系统疾病的临床诊断及科学研究提供符合要求的病理切片。特别对科学研究不经过灌注处理的小鼠的其它组织还可以进行分子及生化指标的检测。

Description

一种脑组织快速冰冻切片的制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物医学领域，具体涉及建立一种脑组织快速冰冻切片的制备方法，也是建立一种关于疾病的快速病理诊断的方法。

背景技术

冰冻切片是借助于低温条件使组织达到一定的硬度然后切片的一种方法，由于它不需要经过长时间的固定、包埋和切片后处理等步骤，而且能很好的保存组织的抗原和酶的活性，因而被广泛应用于临床快速病理诊断以及对于疾病的科学研究上。由于冰冻切片的质量直接影响到病理诊断的准确性，因此制备高质量的冰冻切片具有重要意义。但是冰冻切片比一般石蜡制片要求高、难度大，科研实验中冰冻切片、免疫组化及免疫荧光实验比临床病理诊断的要求更高。

基于影响冰冻切片制作质量的因素较多，主要因素有取材、切片时的温度以及切片后的固定、储存。其中样本的样品的取材及冻存方法至关重要。只有冷冻适宜组织块切片程度时迅速切片才能切出完好的切片。取材过程中要针对容易形成冰晶这一问题采取不同措施避免冰晶的形成。

冰冻切片是免疫组织化学中最常用的切片方法。目前，实验室中冰冻切片的处理方法主要有两种。方法一：利用灌注固定液通过左心室进行灌注，以全身僵硬为准，灌注后立即切取组织块，并快速投入后固定液中进行后固定，固定后再利用10%蔗糖，20%蔗糖，30%蔗糖（0.1MPBS溶）进行梯度脱水置换，每个梯度的蔗糖一般在室温条件下4小时到过夜，最后以组织块沉下为准。虽然此方法能够很好的保护好组织形态，但灌注后的其他组织不能用于留存核酸及蛋白等的分子及生化指标的检测，因此有一定的局限性。方法二：实验动物处死后直接冰冻组织，利用OCT包埋后放于液氮液面冷冻至包埋剂中心即将变白时取出，然后立即放于-80℃冰箱保存备用切片。不经过灌注的动物组织可以根据需要进行分子及生化指标的留样分析，但是，由于液氮的熔点低，利用液氮直接速冻的方法容易将组织冻裂。

基于以上分析以及丙酮的熔点为-96℃，因此利用丙酮作为隔开组织和液氮以防将组织直接放于液氮中速冻冻裂，同时，丙酮还是很好的固定液，能够很好的保护好抗原。另外，不经过灌注处理的组织还可以留为其他指标的检测。

发明内容

本发明的目的在于建立一种脑组织快速冰冻切片的制备方法，该方法实施方便、简捷、制片完整，减少冰晶，具有可重复性及可适用性，利于后期临床诊断及疾病的研发工作。

为了达到本发明的目的，本发明所采用的技术手段为：

本发明的一种脑组织快速冰冻切片的制备方法，其特征在于依次包括样本取材及冻存、冰冻切片的制作以及冰冻切片的HE染色、封片步骤，其中所述的样本取材及冻存包括以下步骤：

（1）制备圆柱形无盖锡纸盒，要求底面平整，用于装冰冻包埋剂OCT；

（2）制备底面组织快速冰冻装置，所述装置中利用预冷丙酮隔开组织与液氮；

（3）将处死后的小鼠的脑组织取出，根据需要进行切面，厚度1.5-2.5毫米；

（4）将脑组织切面放入步骤（1）中装有冰冻包埋剂OCT的锡纸盒的底部且靠近中间的位置，要求脑组织切面完全浸入OCT中，尽量减少气泡；

（5）将步骤（4）的装有脑组织切面的锡纸盒放入步骤（2）的预先装有预冷丙酮的组织快速冰冻装置，然后放入液氮中，且液氮表面不没过组织快速冰冻装置，30～50秒钟待OCT包埋剂中心变白时取出组织快速冰冻装置，放入-80℃冰箱保存备用。

在本发明的一个具体实施例中，步骤（2）中所述的组织快速冰冻装置包括手柄，所述手柄连接在外胆上，所述外胆内部设有内胆，所述外胆与内胆之间形成装液体区域，所述外胆上端与内胆上端之间设有连接环，连接环将所述外胆与内胆之间形成的装液体区域封闭，连接环上设有孔，在所述装液体区域内加入预冷丙酮。优选的，所述外胆与内胆的距离为2厘米，更优选的，所述孔上设有孔盖以防止丙酮挥发。

在本发明中，优选的，所述的冰冻切片的制作包括以下步骤：

（1）切片前将权利要求1步骤（5）得到的OCT包埋的冰冻组织从-80℃冰箱移到-20℃冰箱中1-2个小时，再取出冰冻组织，将组织面朝上固定到冻台上进行切片；

（2）脑组织的冰冻切片机在17～18℃的切片温度下进行切片，利用粘附载玻片进行直接贴片，切片厚度根据需要为4微米到10微米；

（3）将载有切片的粘附载玻片迅速利用-20℃冷丙酮固定5～10分钟；

（4）固定后取出直接染色或晾干后利用-80℃冰箱保存待用。

在本发明中，优选的，所述的冰冻切片的HE染色、封片过程包括以下步骤：

（1）将固定后的切片取出水洗；

（2）利用苏木素染色3～5分钟；

（3）自来水洗，用滤纸吸干液体；

（4）1%的盐酸酒精溶液分化10～20秒，此时切片由蓝变红；

（5）自来水洗返蓝25-30分钟，此时切片由红变浅蓝；

（6）95%乙醇洗1分钟；

（7）0.5%伊红染色40～60分钟秒；

（8）自来水稍洗，用滤纸吸干液体；

（9）95%乙醇脱水2次，每次5分钟，用滤纸吸干液体；

（10）100%乙醇脱水3次，每次5分钟，用滤纸吸干液体；

（11）二甲苯透明2次，每次5分钟；

（12）中性树胶封片。

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明利用经过丙酮作为冰冻包埋剂及液氮中间介质，不但可以使脑组织达到速冻的效果，还能使脑组织有效的减少冰晶的形成，同时还能减少动物灌注这一环节，这样处理的动物的其他组织可以用于生化及分子指标的检测。其次，本发明通过对影响冰冻切片制作质量的因素，例如取材、切片时的温度以及切片后的固定、储存条件等进行优化，进一步保证了最后制备得到的切片的质量。

附图说明

图1为本发明一实施例的组织快速冰冻装置结构示意图。

附图标记说明：1手柄；2孔；3内胆；4内胆底端；5外胆；6装液体区域；7连接环；

图2为经过OCT包埋后液氮速冻处理后的脑组织的HE染色结果，从该结果可以看出直接利用液氮进行速冻的脑组织，整个视野遍布冰晶，出现大量的空洞现象；

图3为利用丙酮隔开OCT包埋剂与液氮进行速冻处理后的脑组织的HE染色结果，利用丙酮隔开OCT包埋剂及液氮速冻处理后的脑组织冰晶明显减少，利用此种方法处理的片子完全可以进行免疫组化及免疫荧光实验。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：小鼠脑组织切片的制备方法

方法：

一、样本取材及冻存方法

1、制备底面直径1.5cm，高为2.5cm的圆柱形无盖锡纸盒，要求底面平整，用于装冰冻包埋剂OCT，在锡纸盒上做好标记；

2、制备地面直径3.0cm，高为3.0cm的圆柱形带盖底面组织快速冰冻装置，如图1所示，包括手柄1，所述手柄1用于方便利于手拿，手柄1连接在外胆5上，外胆5内部设有内胆3，外胆5与内胆3之间形成装液体区域6，外胆5上端与内胆3上端之间设有连接环7，连接环7将所述外胆5与内胆3之间形成的装液体区域6封闭，连接环7上设有孔2。外胆5与内胆3之间的距离设为2厘米，即所装丙酮预冷的厚度为2厘米，高度为0.5～1cm高。不浪费丙酮的前提下，能实现良好的组织冰冻效果。使用时，从孔2处向装液体区域6内加入-20℃预冷的丙酮，盖上孔盖，以防止挥发。

3、将处死后小鼠的脑组织取出，根据需要进行切面，厚度2毫米左右。

4、将脑组织切面放入步骤1中装有冰冻包埋剂OCT的锡纸盒的底面且靠近中间的位置，要求脑完全浸入OCT中即可，尽量减少气泡。

5、将步骤4中的锡纸盒放入步骤2中预先装有冷丙酮的底面组织快速冰冻装置中，立即盖上盖，用镊子夹住放入液氮表层，且液氮表面不没过组织快速冰冻装置，30～50秒钟待OCT包埋剂中心变白时取出放入-80℃冰箱保存备用切片，并可长期保存。

二、冰冻切片的制作

1、切片前将OCT包埋的冰冻组织从-80℃冰箱移到-20℃冰箱中，再逐一取出利用OCT将组织面朝上固定到冻台上进行切片，采用德国莱卡恒温式，型号为：LEICACM1950。

2、脑组织的冰冻切片机在-17～18℃的切片温度下进行切片，利用世泰粘附载玻片进行直接贴片，切片厚度根据需要4微米到10微米。

3、将2中的切片迅速利用-20℃冷丙酮固定5～10分钟，不能等切片干后再固定,后者容易造成细胞退变。

4、固定后取出可直接染色或晾干后利用-80℃冰箱保存待用。

三、冰冻切片的HE染色过程

1、将切片固定取出后水洗；

2、利于苏木素染色3～5分钟；

3、自来水稍洗，用滤纸吸干液体；

4、1%的盐酸酒精溶液（100ml95%酒精+1ml浓盐酸）分化10～20秒，此时切片由蓝变红；

5、自来水洗返蓝25-30分钟，此时切片由红变浅蓝；

6、95%乙醇1分钟（由于伊红为醇溶性的）；

7、0.5%伊红(醇溶性)染色40～60分钟秒；

8、自来水稍洗，用滤纸吸干液体；

9、95%乙醇脱水2次，每次5分钟，用滤纸吸干液体；

10、100%乙醇脱水3次，每次5分钟，用滤纸吸干液体；

11、二甲苯透明2次，每次5分钟。

12、中性树胶封片。

结果：

利用丙酮隔开OCT包埋剂与液氮进行速冻处理后的脑组织的HE染色结果，如图3所示，从图3结果可以看出利用丙酮隔开OCT包埋剂及液氮速冻处理后的脑组织冰晶明显减少，利用此种方法处理的片子完全可以进行免疫组化及免疫荧光实验。图2为经过OCT包埋后液氮速冻处理后的脑组织的HE染色结果，从该结果可以看出直接利用液氮进行速冻的脑组织，整个视野遍布冰晶，出现大量的空洞现象。

Claims (4)

1.一种脑组织快速冰冻切片的制备方法，其特征在于依次包括样本取材及冻存、冰冻切片的制作以及冰冻切片的HE染色、封片步骤，其中所述的样本取材及冻存包括以下步骤：

(1)制备圆柱形无盖锡纸盒，要求底面平整，用于装冰冻包埋剂OCT；

(2)制备底面组织快速冰冻装置，所述的底面组织快速冰冻装置包括手柄，所述手柄连接在外胆上，所述外胆内部设有内胆，所述外胆与内胆之间形成装液体区域，所述外胆上端与内胆上端之间设有连接环，连接环将所述外胆与内胆之间形成的装液体区域封闭，连接环上设有孔，在所述装液体区域内加入预冷丙酮，利用预冷丙酮隔开组织与液氮；

(3)将处死后的小鼠的脑组织取出，根据需要进行切面，厚度1.5-2.5毫米；

(4)将脑组织切面放入步骤(1)中装有冰冻包埋剂OCT的锡纸盒的底部且靠近中间的位置，要求脑组织切面完全浸入OCT中，尽量减少气泡；

(5)将步骤(4)的装有脑组织切面的锡纸盒放入步骤(2)的预先装有预冷丙酮的底面组织快速冰冻装置，然后放入液氮中，且液氮表面不没过底面组织快速冰冻装置，30～50秒钟待OCT包埋剂中心变白时取出底面组织快速冰冻装置，放入-80℃冰箱保存备用。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述外胆与内胆的距离为2厘米。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述孔上设有孔盖。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，冰冻切片的制作包括以下步骤：

(1)切片前将权利要求1步骤(5)得到的OCT包埋的冰冻组织从-80℃冰箱移到-20℃冰箱中1-2个小时，再取出冰冻组织，将组织面朝上固定到冻台上进行切片；

(2)脑组织的冰冻切片机在-17～18℃的切片温度下进行切片，利用粘附载玻片进行直接贴片，切片厚度根据需要为4微米到10微米；

(3)将载有切片的粘附载玻片迅速利用-20℃冷丙酮固定5～10分钟；

(4)固定后取出直接染色或晾干后利用-80℃冰箱保存待用。