CN112674078A - 一种肝细胞超声波植冰冻存装置及其冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种超声波植冰冻存装置，具体地，涉及一种肝细胞超声波植冰冻存装置及其冻存方法。本发明超声波植冰冻存装置，包括超声容器，温度检测系统，超声波诱导成核系统，冷却系统；本发明肝细胞超声波植冰冻存方法，包括如下步骤：肝细胞培养，植冰温度上阈确定，控温相变液原料选取，肝细胞超声波植冰冻存。相比于常规的肝细胞冻存方式，本发明超声波植冰冻存装置及其方法显著提高了肝细胞的冻存效果，冷冻保护剂使用量少，超声波植冰与冻存保护剂具有协同作用，肝细胞冻存后复苏存活率高于90％，与新鲜组无显著性差异，取得了预料不到的技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种超声波植冰冻存装置，具体地，涉及一种肝细胞超声波植冰冻存装置及其冻存方法。
背景技术
细胞低温保存是用于现代再生医学、器官移植和辅助生殖的一项关键技术，细胞治疗是目前公认对抗癌症等疑难杂症的有效手段，受到各方广泛的关注。细胞的冷冻保存一般是通过将细胞冷冻到较低的零下温度(通常是-196℃)，细胞在低温下，无生命活动，因此能够长期保存，但是，在冷却过程中可能会发生严重的细胞损伤。为了减轻冷冻损伤，现在普遍采用的细胞冷冻方案是细胞溶液中加入一定浓度的低温保护剂，然后采用慢速冷冻的方法或者玻璃化的方法进行冷冻。
对于慢速冷冻，降温速率会对细胞的存活率和继续发育造成巨大的影响。现有的研究理论认为在降温速率主导的两种损伤因素共同作用下，细胞低温保存必然存在一个最佳的降温速率，使得该速率下既能够减少胞内冰晶的产生，又能避免溶质损伤。
在实际降温过程中，细胞溶液会出现过冷现象，较大的过冷度会使的细胞溶液因释放潜热，温度上升，导致细胞的降温速率远高于最佳的降温速率，在较高的降温速率下，会引起细胞不可控的结晶，细胞突然结冰，脱水不充分，胞内冰大量生长，细胞大量死亡，可见，降低过冷度是关键操作。
传统的植冰降温方法主要是用于预冷探针(如金属棒或手术钳)来接触容器的侧面，从而提供局部过冷诱发成核，也可以在细胞溶液中添加冰核细菌诱发冻结。关于超声波诱导冰晶生成的研究，目前的研究和应用较少。
发明内容
本发明针对现有技术中肝细胞保存存在的问题，提供一种超声波植冰冻存装置，进一步，本发明提供一种利用该装置对肝细胞进行植冰冻存的方法。
本发明的具体技术方案如下：
本发明所述的一种超声波植冰冻存装置，包括超声容器，温度控制系统，超声波诱导成核系统，冷却系统；
进一步：所述的超声容器包括若干样本槽管(12)，若干细胞冻存管(11)和若干对照冻存管(10)、超声内盒体(3)，所述的细胞冻存管11盛放于样本槽管(12)，所述的对照冻存管10盛放于另一样本槽管(12)，样本槽管(12)、细胞冻存管(11)和若干对照冻存管(10)均位于超声内盒体(3)中，第一控温相变液(4)填充在超声内盒体(3)中，样本槽管(12)被超声内盒体(3)中的第一控温相变液(4)浸没，通过第一控温相变液(4)的温度变化调整样本槽管(12)中的温度，进而实现对细胞冻存管(11)和对照冻存管(10)的温度控制。
进一步：所述的超声波诱导成核系统，包括超声波发生器(1)和若干超声波振子(2)，超声波振子(2)的数量与样本槽管(12)的数量相匹配，每个样本槽管(12)的底部均粘结至少一个超声波振子(2)，当超声波发生器(1)启动后，超声波振子(2)开始工作，使得超声波从样本槽管(12)底部快速向上传播到细胞冻存管(11)和对照冻存管(10)中；
本发明装置中，超声波频率可以在20-130kHz范围内调整，超声波的功率可以在10-350W范围内调整；
进一步：所述的温度控制系统包括若干热电偶电极和温度数据采集模块(9)，优选的，热电偶电极包括第一热电偶电极(7)和第二热电偶电极(8)，其中第一热电偶电极(7)位于对照冻存管(10)内，用于实时监测细胞溶液的温度，第二热电偶电极(8)放置在超声内盒体(3)的相变液溶液中，用于实时监测控温相变液的温度。
本发明通过若干热电偶电极和温度数据采集模块(9)，实现对对照冻存管内、相变液溶液在内的实时温度监测控制，保证整个装置的温度控制系统，进一步的，温度数据采集模块(9)可以与外界的计算机设备连接，实现数字化、自动化的监测和控制。
进一步：所述的冷却系统包括第一控温相变液(4)和第二控温相变液(5)，第一控温相变液(4)填充在超声内盒体(3)中，第二控温相变液(5)填充在低温恒温槽(6)中；
进一步：超声容器内第一控温相变液(4)和低温恒温槽内第二控温相变液(5)设置一个闭合循环回路，超声容器(3)内的温度分布均匀，低温恒温槽(6)内的温度分布均匀，低温恒温槽(6)自带制冷循环系统。
本发明所述的一种肝细胞的超声波植冰冻存方法，包括如下步骤：
(1)、肝细胞培养：采用胎牛血清的1640培养基培养L-02肝细胞获得肝细胞培养液备用：
(2)、确定植冰温度上阈：当溶液温度高于熔融温度，溶液不会结冰，只有当溶液温度低于熔融温度时，溶液才有结冰的可能。本发明采用差式扫描量热仪(DSC)分别测量不同浓度Me2SO保护剂的结晶温度，其中经测量，0％Me2SO，3％Me2SO，5％Me2SO熔融温度分别为-3.89±0.2℃，-6.08±0.49℃，-7.43±0.81℃，进而确定超声波植冰的温度范围为：0％Me2SO溶液植冰温度上阈-4℃，3％Me2SO溶液植冰温度上阈-6℃，5％Me2SO溶液植冰温度上阈-7℃。
进一步的，保护剂结晶温度测量方法为：将DSC程序设定为：30℃等温1min，以30℃/min速率降温到-80℃，平衡1min，再以10/min速率升温到30℃。参比侧放置一个小坩埚，每组保护剂实验重复三次。采用DSC分析软件PYRIS Manager分析相变温度。
(3)、选取控温相变液原料：本发明选取20-55％浓度的乙二醇溶液为第一控温相变液(4)和第二控温相变液(5)原料，进一步地，优选38.5％浓度的乙二醇溶液，该百分比浓度的乙二醇溶液可降温至-20℃不结冰，满足本发明需求的指标参数；分别填充加载到超声内盒体(3)中和低温恒温槽(6)中。
(4)、超声波植冰冻存肝细胞：
将肝细胞培养液分装到冻存管，之后放置在超声波植冰装置的样本槽中进行植冰冷冻保存；
进一步地，植冰时，首先将搭载好的超声容器与低温恒温槽连接，将配制好的乙二醇控温相变液注入超声内盒体和低温恒温槽中，开启低温恒槽的制冷循环系统，待第二热电偶监测到超声容器内控温相变液温度达到指定需要的温度并保持恒温状态，通过第一热电偶实时监测冻存管温度，当冻存管温度达到指定植冰温度时，启动超声波发生器电源，超声波启动，植冰结束后关闭超声波，细胞冻存管在控温相变液中平衡5-10min使冰晶生长完全，平衡结束之后盖上降温盒的盖子，将降温盒转移至-50--80℃冰箱进行低温保存过夜，第二天再将冻存管转移至液氮冻存24-48h。
进一步地，本发明选取的冻存保护剂为0％～15％Me2SO，进一步优选0％～12％Me2SO，更优选0％Me2SO，3％Me2SO，5％Me2SO，10％Me2SO，12％Me2SO。
进一步地，本发明的植冰温度为-3℃～-12℃，进一步选取-4℃～-9℃，进一步选取-7℃，-8℃，-9℃；
进一步地，本发明的超声波植冰冻存参数为：10％Me2SO+超声植冰组，5％Me2SO+超声植冰组；
进一步地，本发明的超声波功率为25～200W，优选35W～150W，更优选60W，90W，120W，150W，当功率小于35-120W时，细胞均得到较好的保存，细胞存活率均在90％以上，满足样本库等细胞库的需求，组别间无著性差异，当功率大于120W时，细胞存活率显著下降。
进一步地，本发明的超声波植冰冻存参数为：保护剂为5％Me2SO，超声波功率为60W，植冰温度为-7℃，-8℃，-9℃；
进一步地，本发明的超声波植冰冻存参数为：超声波植冰功率为60W，保护剂为0％Me2SO，3％Me2SO，5％Me2SO。
本发明中，第一控温相变液(4)和第二控温相变液(5)原料具有无毒、无味、热力性好、性能稳定等优点，进一步地，本发明第一控温相变液和第二控温相变液可以选取本领域常规原料，进一步选取乙二醇；
本发明中，选取20-55％浓度乙二醇溶液为第一控温相变液(4)和第二控温相变液(5)原料，进一步地，优选38.5％浓度乙二醇溶液，该百分比浓度的乙二醇溶液可降温至-20℃不结冰，满足本发明需求的指标参数；分别填充加载到超声内盒体(3)中和低温恒温槽(6)中。
进一步地，本发明超声波植冰冻存装置及其方法显著提高了肝细胞的冻存效果，其中肝细胞冻存后复苏存活率高于90％，进一步地，高于95％，最佳地，高于97％。
另一方面，本发明还提供一种肝细胞的复苏方法，具体操作为：
低温保存后，将冻存管从液氮中取出，放入35-37℃水浴锅中摇晃振荡2-3分钟进行细胞复苏。最后，将冻存管中细胞溶液转移到15-35ml离心管中1000-2500r/min离心4-8min，去除上清液，在加入PBS缓冲液清洗一遍，在1000-2500r/min离心4-8min，加入完全培养基重悬，以进一步检查细胞存活率。
另一方面，本发明还提供一种肝细胞计数和存活率测定方法，具体操作为：
细胞离心后用培养基重悬1ml，吸取10μl的细胞重悬液到血球计数板一侧凹槽内，加盖盖玻片后在光学显微镜下进行细胞计数，计数方法如式(1)，计数要求按照：计上不计下，计左不计右的原则，细胞浓度在105-106个/ml。
β为细胞浓度(个/ml)；a为四个大方格总数；b为稀释倍数。
由于AOPI染料比台盼蓝染料精确度更高，本实验采取AOPI染料检测细胞的存活率。为评估冷冻保存后细胞的存活率，我们将离心后细胞用培养基稀释成细胞悬液，用15μl移液枪吸取15μl细胞悬液到1.5ml离心管中，避光加入15μl AOPI染液，AOPI染液的配制方法如下：取100μl试剂C用900μl的PBS缓冲液稀释，充分混匀后，加入10μl的AO染色液和20μl的PI染色液。当避光加入体积比为1∶1的AOPI染色液后，轻轻混匀在4℃避光孵育10-20分钟，孵育完成后吸取15μl的细胞染色液在载玻片的中央，盖上盖玻片在荧光显微镜下进行观察，荧光显微镜激发光源波长488nm，接受光波长为520nm。明场里找到细胞之后，在打开荧光在暗室里观察，最后利用Image Pro Plus6.0软件进行计数。细胞存活率公式如(2)所示。
γ为细胞存活率；m为活细胞数；n为死细胞数。
进一步地，本发明所述的超声波植冰冻存装置，植冰冻存方法，细胞复苏方法，细胞计数和存活率测定方法不仅适用于肝细胞，还可以应用于其他细胞的冻存、复苏、计数和存活率测定，其他细胞包括但不限于：干细胞，NK细胞，T细胞，红细胞，癌症细胞等的一种或多种。
有益效果：本发明提供了一种肝细胞超声波植冰冻存方法，该冷冻方法能显著改善传统慢速冷冻过程中细胞低温保存后存活率低的缺点，降低渗透性保护剂Me2SO的使用量，推广了超声波植冰在细胞低温保存领域中的作用，为细胞低温保存技术提供了新的思路和方法，具体而言：
(1)本发明提供了一种肝细胞超声波植冰冻存装置，通过恰当的构件连接，实现了超声波植冰过程中精确控温，快速地完成肝细胞的植冰冻存，将超声波振子的数量与样本槽管的数量相匹配，使得每一个样本均在超声波诱导成核系统的作用下快速地实现超声波植冰，温度控制系统的热电偶电极实时监测样本的温度，温度数据采集模块与外界的计算机设备连接，便于实现数字化、自动化的监测和控制。
(2)本领域中，冻存效果与保护剂如Me2SO用量密切相关，通常为了取得较佳的冻存效果，一般采用大量高浓度的Me2SO冻存保护剂，以提高肝细胞的存活率，但Me2SO冻存保护剂并非使用越多越好，由于Me2SO作为一种小分子渗透性保护剂，可以渗透到细胞内，浓度越高时，渗透越快，它们以比水慢的速度进入细胞，使细胞因渗透而失水，使胞内冰减少；
本申请中，首次采用超声波植冰结合保护剂Me2SO，通过科学合理地实验，调整优化超声波植冰参数，在不降低肝细胞冻存效果的情况下，降低渗透性保护剂Me2SO使用量，取得了化学方法与物理方法两者结合的预料不到技术效果。
(3)本发明中，选取乙二醇溶液为温相变液，调整乙二醇浓度达到调整控温相变液的温度范围，扩大了肝细胞植冰冻存过程中冷冻保护剂的浓度、种类，使得本发明的肝细胞超声波植冰冻存装置及其方法不仅适用于肝细胞的冻存，还适用于其他细胞的生物医学低温保存和复苏；
(4)相比于常规的肝细胞冻存方式，本发明超声波植冰冻存装置及其方法显著提高肝细胞的冻存效果，其中肝细胞冻存后复苏存活率高于90％，经实验验证，在保护剂含量使用很少的情况下，通过超声波植冰与少量冻存保护剂的协同作用，肝细胞冻存后复苏存活率甚至高达90.8％，91.32％，95.9％，97.4％，与新鲜组无显著性差异，取得了预料不到的技术效果。
附图说明
图1：本申请的一种超声波植冰装置示意图，图中，超声波发生器(1)；超声波振子(2)；超声内盒体(3)；第一控温相变液(4)，第二控温相变液(5)；低温恒温槽(6)；第一热电偶(7)；第二热电偶(8)；温度数据采集模块(9)；对照冻存管(10)；细胞冻存管(11)，样本槽管(12)。
图2：不同浓度Me2SO细胞溶液植冰上阈温度曲线(其中x代表Me2SO浓度，y为植冰上阈温度)。
图3：图3超声波植冰对肝细胞存活率的影响(不同字母代表有显著性差异。显著性：p＜0.05误差：SD)
图3a：不同操作方式保存细胞的显微图像(不同字母代表有显著性差异，显著性p＜0.05，误差SD)。
图3b：不同操作方式细胞存活率。
图4：不同功率超声波植冰细胞存活率(不同字母代表有显著性差异，显著性p＜0.05，误差SD)。
图5：添加5％Me2SO的细胞溶液在不同预冷温度下超声植冰对细胞存活率的影响(不同字母代表有显著性差异，显著性p＜0.05误差：SD)。
图5a：添加5％Me2SO细胞溶液超声波植冰细胞存活率柱状图。
图5b：添加5％Me2SO细胞溶液超声波植冰荧光图像。
图6：添加不同浓度Me2SO的细胞溶液在接近熔融相变温度的预冷温度下超声植冰对细胞存活率的影响(不同字母代表有显著性差异。显著性：p＜0.05误差：SD)
图6a：不同浓度Me2SO细胞溶液超声波植冰细胞存活率柱状图；
图6b：不同浓度Me2SO细胞溶液超声波植冰荧光图像。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
实施例1：实验方法
1.1材料和试剂
L-02原代肝细胞(购于上海富衡生物科技有限公司)胎牛血清(Gemini公司)，培养基RPMI-1640(Gibco公司)，胰蛋白酶(TBD公司)，二甲基亚砜Me2SO(阿拉丁公司)，PBS缓冲液(TBD公司)，乙二醇(麦克林)，T-25培养瓶(NEST耐思)，50ml离心管(NEST耐思)，15ml离心管(NEST耐思)，1.5ml离心管无菌(Axygen公司)，2ml冻存管(NEST耐思)，AO/PI双染试剂盒(BestBio)。
1.2仪器和设备
光学显微镜(日本尼康公司)，荧光显微镜(日本尼康公司)，低速台式离心机(上海安亭)，CO2细胞培养箱(上海博讯公司)，程序降温盒(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)，超低温冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)，低温恒温槽(宁波天恒仪器厂)，智能多路温度测试仪(常州安柏精密仪器有限公司)，差示扫描量热仪(德国耐驰公司)。
1.3细胞培养
在补充有10％胎牛血清的1640培养基中培养L-02肝细胞，将它们放在37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。实验时，先观察培养瓶中的数量，待细胞长满底壁时，轻轻吸弃培养瓶里的上清液，向长满底壁的L-02细胞培养瓶中加入1ml PBS缓冲液，轻柔洗涤两次后吸弃PBS，加入200μl胰蛋白酶置入培养箱中进行消化3min，待光学显微镜下观察到细胞形态已成圆状并且脱离底壁时，加入2ml完全培养基终止消化。利用1ml的移液枪吸取培养液对培养瓶底壁进行轻柔均匀的反复吹打，确保细胞脱离底壁已全部进入溶液中，将细胞从培养瓶中取出，以1000r/min的转速离心4min，然后重悬于培养基中以备后用。
1.4保护剂结晶温度测量
使用差式扫描量热仪(DSC)分别测量不同浓度的保护剂的结晶温度。将DSC程序设定为：30℃等温1min，以30℃/min速率降温到-80℃，平衡1min，再以10/min速率升温到30℃。参比侧放置一个小坩埚，每组保护剂实验重复三次。采用DSC分析软件PYRIS Manager分析相变温度。
1.5超声波植冰冻存装置，
本发明所述的一种超声波冷冻植冰装置，包括超声容器，温度控制系统，超声波诱导成核系统，冷却系统；
其中：所述的超声容器包括若干样本槽管(12)，若干细胞冻存管(11)和若干对照冻存管(10)、超声内盒体(3)，所述的细胞冻存管(11)盛放于样本槽管(12)，所述的对照冻存管10盛放于另一样本槽管(12)，样本槽管(12)、细胞冻存管(11)和若干对照冻存管(10)均位于超声内盒体(3)中，第一控温相变液(4)填充在超声内盒体(3)中，样本槽管(12)被超声内盒体(3)中的第一控温相变液(4)浸没，通过第一控温相变液(4)的温度变化调整样本槽管(12)中的温度，进而实现对细胞冻存管(11)和对照冻存管(10)的温度控制。
其中，所述的超声波诱导成核系统，包括超声波发生器(1)和若干超声波振子(2)，超声波振子(2)的数量与样本槽管(12)的数量相匹配，每个样本槽管(12)的底部均粘结至少一个超声波振子(2)，当超声波发生器(1)启动后，超声波振子(2)开始工作，使得超声波从样本槽管(12)底部快速向上传播到细胞冻存管(11)和对照冻存管(10)中；
本发明装置中，超声波频率可以在20-130kHz范围内调整，超声波的功率可以在10-350W范围内调整；
其中，所述的温度控制系统包括若干热电偶电极和温度数据采集模块(9)，优选的，热电偶电极包括第一热电偶电极(7)和第二热电偶电极(8)，其中第一热电偶电极(7)位于对照冻存管(10)内，用于实时监测细胞溶液的温度，第二热电偶电极(8)放置在超声内盒体(3)的相变液溶液中，用于实时监测控温相变液的温度。
本发明通过若干热电偶电极和温度数据采集模块(9)，实现对对照冻存管内、相变液溶液在内的实时温度监测控制，保证整个装置的温度控制系统，进一步的，温度数据采集模块(9)可以与外界的计算机设备连接，实现数字化、自动化的监测和控制。
其中，所述的冷却系统包括第一控温相变液(4)和第二控温相变液(5)，第一控温相变液(4)填充在超声内盒体(3)中，第二控温相变液(5)填充在低温恒温槽(6)中；
本发明中，第一控温相变液(4)和第二控温相变液(5)原料具有无毒、无味、热力性好、性能稳定等优点，进一步地，本发明第一控温相变液和第二控温相变液可以选取本领域常规的原料，进一步选取乙二醇；
优选的，超声容器内第一控温相变液(4)和低温恒温槽内第二控温相变液(5)设置一个闭合循环回路，超声容器(3)内的温度分布均匀，低温恒温槽(6)内的温度分布均匀，低温恒温槽(6)自带制冷循环系统。
1.6肝细胞的冷冻保存
肝细胞冻存方法包括两种，分别采用超声波植冰冻存和程序降温慢速冻存，每组设置三个平行组。
1.6.1超声波植冰冻存的方法
本发明超声波植冰冻存的方法如下：提前准备控温相变液原料，分别填充加载到超声内盒体(3)中和低温恒温槽(6)中；经实验验证，本发明选取20-55％浓度的乙二醇溶液为第一控温相变液(4)和第二控温相变液(5)原料，进一步地，优选38.5％浓度的乙二醇溶液，该百分比浓度的乙二醇溶液可降温至-20℃不结冰，满足本发明需求的指标参数；
分别将含有3％Me2SO，5％Me2SO，10％Me2SO的细胞溶液重悬后，各取500μl分装到三个1.8ml的冻存管中，每支冻存管体积是500μl，另取冻存管作为对照冻存管，对照冻存管添加等量不含肝细胞的保护剂溶液，将对照冻存管和三个细胞冻存管同时放置在超声波植冰装置的样本槽中。
植冰时，首先将搭载好的超声容器与低温恒温槽连接，将配制好的乙二醇控温相变液注入超声内盒体和低温恒温槽中，开启低温恒槽的制冷循环系统，待第二热电偶监测到超声容器内控温相变液温度达到指定需要的温度并保持恒温状态，通过第一热电偶实时监测冻存管温度，当冻存管温度达到指定植冰温度时，启动超声波发生器电源，超声波启动，植冰结束后关闭超声波，细胞冻存管在控温相变液中平衡5-10min使冰晶生长完全，平衡结束之后盖上降温盒的盖子，将降温盒转移至-50--80℃冰箱进行低温保存过夜，第二天再将冻存管转移至液氮冻存24-48h。
1.6.2程序降温慢速冻存
程序降温慢速冷冻组方法，其具体操作是将含有3％Me2SO，5％Me2SO，10％Me2SO的细胞重悬后，等份分装到三个1.8ml的冻存管中，每支500μl冻存管直接装入程序降温盒置于-50--80℃冰箱进行低温保存过夜，其降温速率约为-1℃/min，第二天再将冻存管转移至液氮冻存24-48h。
1.7肝细胞的复苏
低温保存后，将冻存管从液氮中取出，放入35-37℃水浴锅中摇晃振荡2-3分钟进行细胞复苏。最后，将冻存管中细胞溶液转移到15-35ml离心管中1000-2500r/min离心4-8min，去除上清液，在加入PBS缓冲液清洗一遍，在1000-2500r/min离心4-8min，加入完全培养基重悬，以进一步检查细胞存活率。
1.8肝细胞计数和存活率测定
细胞离心后用培养基重悬1ml，吸取10μl的细胞重悬液到血球计数板一侧凹槽内，加盖盖玻片后在光学显微镜下进行细胞计数，计数方法如式(1)，计数要求按照：计上不计下，计左不计右的原则，细胞浓度在105-106个/ml。
β为细胞浓度(个/ml)；a为四个大方格总数；b为稀释倍数。
由于AOPI染料比台盼蓝染料精确度更高，本实验采取AOPI染料检测细胞的存活率。为评估冷冻保存后细胞的存活率，我们将离心后细胞用培养基稀释成细胞悬液，用15μl移液枪吸取15μl细胞悬液到1.5ml离心管中，避光加入15μl AOPI染液，AOPI染液的配制方法如下：取100μl试剂C用900μl的PBS缓冲液稀释，充分混匀后，加入10μl的AO染色液和20μl的PI染色液。当避光加入体积比为1：1的AOPI染色液后，轻轻混匀在4℃避光孵育10-20分钟，孵育完成后吸取15μl的细胞染色液在载玻片的中央，盖上盖玻片在荧光显微镜下进行观察，荧光显微镜激发光源波长488nm，接受光波长为520nm。明场里找到细胞之后，在打开荧光在暗室里观察，最后利用Image Pro Plus6.0软件进行计数。细胞存活率公式如(2)所示。
γ为细胞存活率；m为活细胞数；n为死细胞数。
1.9统计分析
获得的荧光图片采用Image Pro Plus6.0软件进行分析。数据采用IBM SPSSStatistics 22.0软件处理。每个样本重复3次，数据以均数±标准差(SD)表示，以P＜0.05作为差异显著评判标准，有统计学意义。
实施例2：结果与讨论
2.1植冰温度上阈的确立
利用DSC分析软件Pyris Manager计算出不同浓度Me2SO溶液的熔融温度，结果如附图2所示，这里展示不同浓度Me2SO熔融温度，其中0％Me2SO，3％Me2SO，5％Me2SO，10％Me2SO熔融温度分别为-3.89±0.2℃，-6.08±0.49℃，-7.43±0.81℃，-9.73±0.39℃。当溶液温度高于熔融温度，溶液不会结冰，只有当溶液温度低于熔融温度时，溶液才有结冰的可能。根据熔融温度，且保证一定的余量，可以确定超声波植冰的温度范围为：0％Me2SO溶液植冰温度上阈约-4℃，3％Me2SO溶液植冰温度上阈约为-6℃，5％Me2SO溶液植冰温度上阈约-7℃，10％Me2SO溶液植冰温度上阈约-10℃，建立浓度和植冰上阈温度的函数关系为y＝33.808x2-62.936x-4.0311，R2＝0.9988，其中x代表Me2SO浓度，y为植冰上阈温度。
2.2超声植冰对细胞冻存的影响
分别对使用5％Me2SO和10％Me2SO的肝细胞悬液进行常规慢速程序降温冷冻和超声波植冰操作，植冰温度为-9℃，功率35w，结果见图3，图3a中清晰地显示出两个超声植冰组均取得了较好的保存效果，几乎无死细胞，但是10％Me2SO组作为实验室最常用的保存方式，效果相对较好，但也有部分细胞死亡，而5％Me2SO组保存效果较差，有较多的死细胞。
结合图3b发现，传统的保护剂方案，加入10％Me2SO的细胞溶液冻存后，细胞存活率也能够达到87.2±5.6％，但与新鲜对照有显著差异。当降低悬液中Me2SO浓度为5％时，细胞存活率仅有62.2±2.9％，这也验证经典的细胞保存方案为何使用10％Me2SO。
从显微图可以看出，植冰后的细胞死亡数目明显比程序慢速冷冻方法要少，存活率显著提升，其中，10％Me2SO+超声植冰组在低温冻存后细胞存活率能达到92.98±1.7％，5％Me2SO+超声植冰组在低温冻存后细胞存活率能达到93.4±1.1％，新鲜组为98.4±1.4％，可见，(10％Me2SO+超声植冰组)和(5％Me2SO+超声植冰组)与新鲜组在细胞存活率指标无显著性差异，但与传统仅使用保护剂的保存方案相比，细胞存活率大大提高，显然超声植冰有效改善了细胞低温保存。
2.3超声波功率对肝细胞冻存的影响
如图4所示，当使用5％Me2SO，植冰温度为-9℃时，超声功率分别为35W，60W，90W，120W，150W，对细胞进行保存，检测细胞的冷冻存活率。
当功率小于35-120W时，细胞均得到较好的保存，细胞存活率均在90％以上，满足样本库等细胞库的需求，组别间无著性差异，当功率大于120W时，细胞存活率有显著下降。这是由于，超声波植冰利用了空化效应，空化气泡中的气压增大到气泡无法承受的程度而发生破裂，气泡生长，收缩，破裂的过程可以增强伴随细胞冷冻过程中的传热和传质过程，降低界面能，触发成核，大功率的超声波对植物细胞膜产生破坏，在合适的超声强度范围，对细胞冻存都有积极影响。
2.4植冰温度对细胞存活率的响
当使用5％Me2SO，超声波功率为60W时，比较不同的植冰温度(-7℃，-8℃，-9℃)时的细胞存活率，由图5发现，当-7和-8℃时，细胞得到较好保存，几乎全部存活，存活率分别为97.4±2.9％，95.9±0.2％。当植冰温度为-9℃时，细胞存活率略下降，为90.8±1.9％，可见不同温度对保存效果存在显著性差异。这是由于植冰温度越低，细胞的过冷度越高，由于过冷度是造成细胞死亡的重要因素，应该尽量提高植冰温度，减少过冷度，但是植冰温度不能无限制提升，必须低于溶液的结晶温度。
2.5最优浓度的确立
使用超声波植冰功率为60W，对不同浓度Me2SO(0％，3％，5％)的细胞悬液进行低温保存，根据2.4的结论，在保证植冰成功的前提下，植冰温度应尽量高，即采用对应浓度的上阈温度(-4℃，-6℃，-7℃)进行植冰。其结果见图6，当Me2SO浓度为0时候，细胞依然有存活，存活率高达11.7±2.0％，而浓度为3％Me2SO浓度细胞存活率为91.32±1.3％，低于5％Me2SO(97.4±2.9％)时的保存效果，各组别之间均有显著性。
此外，本发明的超声波植冰冻存的装置，以及超声波植冰冻存方法，不仅适用于肝细胞，还适用于其他细胞的冻存，包括但不限于肝细胞、干细胞，NK细胞，T细胞，红细胞，癌症细胞中的一种或多种，也取得了高存活率，冷冻保存剂添加量少等优点。
以上通过具体的实施例对本发明进行了说明，但本发明并不限于这些具体的实施例。本领域技术人员应当理解，还可以对本发明做各种修改、等同替换、变化等等。但是，这些变换只要未偏离本发明的精神，都应在本发明的保护范围之内。另外，本申请说明书和权利要求书所使用的一些术语并不是限制性的，仅仅是为了便于描述。
Claims (10)
1.一种用于在低温冷冻前对待冷冻细胞进行超声波植冰冻存的装置，其特征在于：
包括超声容器，温度控制系统，超声波诱导成核系统，冷却系统；
其中，所述的超声容器包括若干样本槽管(12)，若干细胞冻存管(11)和若干对照冻存管(10)、超声内盒体(3)，所述的细胞冻存管11盛放于样本槽管(12)，所述的对照冻存管10盛放于另一样本槽管(12)，样本槽管(12)、若干细胞冻存管(11)和若干对照冻存管(10)均位于超声内盒体(3)中，第一控温相变液(4)填充在超声内盒体(3)中，样本槽管(12)被超声内盒体(3)中的第一控温相变液(4)浸没，通过第一控温相变液(4)的温度变化调整样本槽管(12)中的温度，进而实现对细胞冻存管(11)和对照冻存管(10)的温度控制；
所述的温度控制系统包括若干热电偶电极和温度数据采集模块(9)；
所述的冷却系统包括第一控温相变液(4)和第二控温相变液(5)，第一控温相变液(4)填充在超声内盒体(3)中，第二控温相变液(5)填充在低温恒温槽(6)中。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述的超声波诱导成核系统，包括超声波发生器(1)和若干超声波振子(2)，超声波振子(2)的数量与样本槽管(12)的数量相匹配，每个样本槽管(12)的底部均粘结至少一个超声波振子(2)，当超声波发生器(1)启动后，超声波振子(2)开始工作，超声波从样本槽管(12)底部快速向上传播到细胞冻存管(11)和对照冻存管(10)中；
所述的超声容器内第一控温相变液(4)和低温恒温槽内第二控温相变液(5)设置一个闭合循环回路，超声容器(3)内的温度分布均匀，低温恒温槽(6)内的温度分布均匀，低温恒温槽(6)自带制冷循环系统。
3.一种肝细胞超声波植冰冻存方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)、培养肝细胞：采用胎牛血清的1640培养基培养L-02肝细胞获得肝细胞培养液备用：
(2)、确定植冰温度上阈：采用差式扫描量热仪(DSC)分别测量Me2SO保护剂的结晶温度，之后确定植冰温度上阈；
(3)、选取控温相变液原料：选取20-55％浓度乙二醇溶液为第一控温相变液(4)和第二控温相变液(5)原料；
(4)、超声波植冰冻存肝细胞：将肝细胞培养液分装到冻存管，之后放置在超声波植冰装置的样本槽中进行植冰冷冻保存，经复苏、计数和存活率测定，肝细胞冻存后复苏存活率高于90％。
4.根据权利要求3所述的一种肝细胞超声波植冰冻存方法，其特征在于：所述的冷冻保护剂为0％～15％Me2SO，所述的植冰温度为-3℃～-12℃，所述的超声波功率为25～200W。
5.根据权利要求3或4所述的一种肝细胞超声波植冰冻存方法，其特征在于：超声波植冰冻存时，首先将搭载好的超声容器与低温恒温槽连接，将配制好的乙二醇控温相变液注入超声内盒体和低温恒温槽中，开启低温恒槽的制冷循环系统，待第二热电偶监测到超声容器内控温相变液温度达到指定需要的温度并保持恒温状态，通过第一热电偶实时监测冻存管温度，当冻存管温度达到指定植冰温度时，启动超声波发生器电源，超声波启动，植冰结束后关闭超声波，细胞冻存管在控温相变液中平衡5-10min使冰晶生长完全，平衡结束之后盖上降温盒的盖子，将降温盒转移至-50--80℃冰箱进行低温保存过夜，第二天再将冻存管转移至液氮冻存24-48h。
6.根据权利要求3或4所述的一种肝细胞超声波植冰冻存方法，其特征在于：所述的植冰上阈温度与Me2SO浓度有如下关系：y＝33.808x2-62.936x-4.0311，R2＝0.9988，其中x代表Me2SO浓度，y为植冰上阈温度。
7.根据权利要求3或4所述的一种肝细胞超声波植冰冻存方法，其特征在于：所述的超声波植冰冻存参数为：保护剂为5％Me2SO，超声波功率为60W，植冰温度为-7℃，-8℃，-9℃；或者，所述的超声波植冰冻存参数为：超声波植冰功率为60W，保护剂为0％Me2SO，3％Me2SO，5％Me2SO。
8.根据权利要求3或4所述的一种肝细胞超声波植冰冻存方法，其特征在于：所述保护剂的结晶温度测量方法为：将DSC程序设定为：30℃等温1min，以30℃/min速率降温到-80℃，平衡1min，再以10/min速率升温到30℃。
9.一种高存活率的冻存肝细胞，其特征在于：采用权利要求1-2任一的超声波植冰冻存的装置进行冻存或者采用权利要求2-8所述的超声波植冰冻存方法进行冻存，经复苏、计数和存活率测定，肝细胞冻存后复苏存活率高于90％。
10.一种细胞冻存方法，其特征在于：采用权利要求1-2任一的超声波植冰冻存的装置进行冻存或者采用权利要求2-8所述的超声波植冰冻存方法进行冻存，细胞选取肝细胞、干细胞，NK细胞，T细胞，红细胞，癌症细胞中的一种或多种。
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