CN111202051A - 一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液及其制备方法 - Google Patents

一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液及其制备方法，用海藻糖取代精子冷冻液中的蔗糖；其中包含：氯化钠95.00～105.00mmol/L、氯化钾3.45～6.55mmol/L、硫酸镁0.55～0.65mmol/L、氯化钙1.75～2.22mmol/L、磷酸二氢钠0.18～0.39mmol/L、柠檬酸钠0.58～1.78mmol/L、碳酸氢钠3.85～5.45mmol/L、HEPES和MOPS 15.00～25.00mmol/L、葡萄糖0.38～0.68mmol/L、丙酮酸钠0.28～0.42mmol/L、乳酸钠12.48～23.68mmol/L、人血白蛋白5～15mg/mL、硫酸庆大霉素7～14μg/mL、甘油25～35％(v/v)、海藻糖0.15～0.65mol/L；制备方法为：称量好各种组分并溶于注射级用水中，并经0.2μm滤膜过滤灭菌后，取样测试；使pH值：7.00～7.40；渗透压：1720～2020mOsm/Kg；细菌内毒素：＜0.25EU/ml；1细胞鼠胚培养到96h：≥80％的囊胚形成率。

Description

一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液及其制备方法
技术领域
本发明涉及辅助生殖精子冷冻技术，具体涉及一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液及其制备方法。
背景技术
冷冻精子，即男性从未来生育计划考虑，将自身精子冷冻于具有相应资质的医疗机构中，以防未来生育风险，精子冷冻技术已较成熟，精子冷冻可以作为不孕不育者的一种辅助生育手段，一些非常严重的少精症患者，可以在治疗过程中将珍贵的精子冷冻保存，用以进行卵胞浆内单精子注射治疗，以防日后发展成无精症，以致彻底丧失了做父亲的能力。
临床上将通过自慰射出的精液收集，取少量做抽样检查后，剩下的加入保护剂，超低温(-196℃)冷冻起来。需要使用的时候，将储存精子的样品管于室温下浸在水浴中(37℃左右进行)进行解冻。加入保护剂，可防止精子细胞内水分结冰后，体积增大撑破细胞膜。但在解冻过程中，有一半左右的精子细胞会死亡，原因很多，如精子细胞内冰晶融化时，胞内液体会和胞外保存液发生交换，如果进入细胞内的液体过多、过快，会破坏精子细胞。但是剩下的精子，如果活力良好，足够进行辅助生育技术。理论上，一个受精卵只需要一个精子，如果健康精子数量过少，可以选用显微注射法，将精子一个一个注入卵细胞中。
中国专利文献CN201310172542.2，公开日2014.10.15，公开了一种精子冷冻保护剂，包括体积比为5∶1∶1的无菌去离子水、新鲜卵黄与甘油，还包括枸橼酸钠、葡萄糖、果糖、咖啡因与环糊精，其质量配比关系为：新鲜卵黄0.2mg/ml、甘油0.15mg/ml、枸橼酸钠13mg/ml、葡萄糖10mg/ml、果糖5mg/ml、咖啡因1mg/ml与环糊精1mg/ml。其配置方法如下所述：首先，用容器盛装100ml无菌离子水。接着，依次先后加入1.22g枸橼酸钠、0.78g葡萄糖、0.68g果糖、20ml新鲜卵黄、20ml甘油、0.5g咖啡因与0.5g环糊精。最后一步为，将上述各原料物质混匀后放56℃水浴箱30分钟灭活，待冷却后，过滤分装成品，待用。
然而，人类精子作为一种特殊的组织细胞,由于精子较其他细胞小,仅有很少的细胞质,且胞质中水分含量较其他细胞少,相比其他细胞,精子在冷冻过程中,能发生足够的脱水和皱缩,低温条件下,不会形成过多的细胞内冰晶。因此，开发一种冷冻时,以保护精子不受损害或少受损害,以达到最佳冷冻保护效果是很有必要的。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液。
本发明的另一的目的是，提供一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液的制备方法。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：
一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液，用海藻糖取代精子冷冻液中的蔗糖。
优选的，所述海藻糖浓度为0.15～0.65mol/L。
优选的，所述精子冷冻液为将甘油溶解于含有海藻糖、抗菌素的盐溶液，最终甘油的浓度为25～35％(v/v)。
优选的，所述抗菌素为硫酸庆大霉素,浓度为7～14μg/ml。
优选的，所述盐溶液是以4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)和3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)为缓冲剂，以钠、钾、镁、钙离子为基础，并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、人血白蛋白为能量物质的化合物培养溶液；其中包含：氯化钠95.00～105.00mmol/L、氯化钾3.45～6.55mmol/L、硫酸镁0.55～0.65mmol/L、氯化钙1.75～2.22mmol/L、磷酸二氢钠0.18～0.39mmol/L、柠檬酸钠0.58～1.78mmol/L、碳酸氢钠3.85～5.45mmol/L、HEPES和MOPS15.00～25.00mmol/L、葡萄糖0.38～0.68mmol/L、丙酮酸钠0.28～0.42mmol/L、乳酸钠12.48～23.68mmol/L、人血白蛋白5～15mg/mL。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液的制备方法，包括以下步骤：
(1)称量各种无机盐组分溶于注射级用水中，配制成盐溶液，
(2)加入抗菌素葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠溶于盐溶液中；溶解过程先加固体原料，再加液体原料；
(3)检测步骤(2)所得盐溶液的渗透压和pH值，并记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持为275～310mOsm/Kg，所述pH值保持为7.0～7.4；
(4)按照预配置的容量，配制海藻糖的工作浓度为0.15～0.65mol/L；
(5)按照预配置的容量，将药用级人血白蛋白加入到盐溶液中,终浓度为5～15mg/mL；
(6)将甘油加入步骤(5)制得的盐溶液中溶解均匀，使其浓度为25～35％(v/v)；
(7)将步骤(6)所得溶液经过0.2μm滤膜过滤灭菌后，取样测试；测试参数：
A、pH值：7.00～7.40；
B、渗透压：1720～2020mOsm/Kg；
C、细菌内毒素：＜0.25EU/ml；
D、1细胞鼠胚培养到96h：≥80％的囊胚形成率；
(8)将配置好的溶液进行无菌分装和贴标签。
具体实施方式
下面将对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。
文中所述的硫酸庆大霉素、人血白蛋白均为符合药典要求的药品；海藻糖、甘油、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠等均为低细菌内毒素(细菌内毒素＜0.25EU/ml)的化学试剂。
实施例1一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液
所述盐溶液是以HEPES和MOPS为缓冲剂，以钠、钾、镁、钙离子为基础，并以海藻糖、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、人血白蛋白为能量物质的化合物培养溶液；其中包含：氯化钠95.45mmol/L、氯化钾3.85mmol/L、硫酸镁0.65mmol/L、氯化钙2.12mmol/L、磷酸二氢钠0.28mmol/L、柠檬酸钠1.65mmol/L、碳酸氢钠5.25mmol/L、HEPES和MOPS 25.00mmol/L、葡萄糖0.46mmol/L、丙酮酸钠0.32mmol/L、乳酸钠14.45mmol/L、人血白蛋白13mg/mL、海藻糖0.55mol/L、硫酸庆大霉素12ug/mL。
具体制备方法包括以下步骤：
(1)称量好各种组分，备用；
(2)配制盐溶液：称量好的组分中，先将除了抗菌素、碳酸氢钠以外的各组分溶于注射级用水中，溶解过程中遵循先固体后液体的原则；然后，依次加入称量好的抗菌素、碳酸氢钠，制得盐溶液；
(3)检测步骤(2)所得盐溶液的渗透压和pH值，并记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持为275～310mOsm/Kg，所述pH值保持为7.0～7.4；
(4)按照预配置的容量，配制海藻糖的工作浓度为0.15～0.65mol/L；
(5)按照预配置的容量，将药用级人血白蛋白加入到盐溶液中,终浓度为5～15mg/mL；
(6)将甘油加入步骤(5)制得的盐溶液中溶解均匀，使其浓度为25～35％(v/v)；
(7)将步骤(6)所得溶液经过0.2μm滤膜过滤灭菌后，取样测试；测试参数：
A、pH值：7.00～7.40；
B、渗透压：1720～2020mOsm/Kg；
C、细菌内毒素：＜0.25EU/ml；
D、1细胞鼠胚培养到96h：≥80％的囊胚形成率；
(8)将配置好的溶液进行无菌分装和贴标签。
实施例2一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液
所述盐溶液是以HEPES和MOPS为缓冲剂，以钠、钾、镁、钙离子为基础，并以海藻糖、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、人血白蛋白为能量物质的化合物培养溶液；其中包含：氯化钠97.55mmol/L、氯化钾3.55mmol/L、硫酸镁0.55mmol/L、氯化钙1.88mmol/L、磷酸二氢钠0.22mmol/L、柠檬酸钠0.88mmol/L、碳酸氢钠4.15mmol/L、HEPES和MOPS 22.50mmol/L、葡萄糖0.54mmol/L、丙酮酸钠0.38mmol/L、乳酸钠22.45mmol/L、人血白蛋白8mg/mL、海藻糖0.40mol/L、硫酸庆大霉素14ug/mL。
一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液的使用方法
精子冷冻：精液应在禁欲2～3天后收集，并室温下或37℃液化15-30分钟。取等量的精子冷冻液放至室温或37℃，待精液完全液化后用移液管转移到无菌的15mL锥形离心管中，缓慢地逐滴加入精子冷冻液直到达到精液样本与冷冻液1:1的比率，每添加一滴缓慢摇匀，防止渗透压骤升和气泡产生。随后旋紧离心管盖，缓慢上下颠倒混匀20次。将精液混合物缓慢分装到标注患者ID的冻存管/麦管，并在冻存管/麦管的闭合端口保留足够空间防止精液混合物冷冻时膨胀出管外而造成的部分标本丢失。根据制造商的建议密封冻存管/麦管。
将样本漂浮放在室温水浴中10分钟，移入2℃冰箱中平衡90分钟后，将其放置于液氮蒸汽中30分钟。此步骤可将样本放置于漂浮在液氮液面上的塑料泡沫片上，或将样本置于小型液氮运输罐的气相中。最后将冻存管/麦管迅速转移至液氮中并在-196℃保存。
精子复苏：将冻存管/麦管从-196℃液氮中取出，放入在35±2℃水浴30秒。将冻存管/麦管用干净的纸巾拭干，小心打开冻存管/麦管，将精液混合物转移到干净的试管中，并小心缓慢地逐滴加入等量的洗精液，混合均匀。最后用精子密度梯度分离液进行分离纯化精子。
本发明精子冷冻液与现有的精子冷冻液不同，其添加的冷冻剂物质海藻糖取代了传统配方中的蔗糖，海藻糖可提高冻融精液中的过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-P)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)活性；其次，磷脂是精子质膜最主要的成分之一，海藻糖可以抑制因冻融诱发的质膜磷脂氧化损伤，保护精子质膜结构。其添加的HEPES和MOPS为混合酸碱度平衡液，人体精液呈弱碱性的粘稠液体,pH值为7.2～7.8且对酸碱度十分敏感，其中，在精子冷冻操作中会长时间的接触空气中的氧气和二氧化碳，而HEPES和MOPS平衡液相比传统的磷酸盐或碳酸盐缓冲液可以很好的防止pH值的波动。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液及其制备方法，其特征在于，用海藻糖取代精子冷冻液中的蔗糖。
2.根据权利要求1所述的一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液及其制备方法，其特征在于，所述海藻糖浓度为0.15～0.65mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液及其制备方法，其特征在于，所述精子冷冻液为将甘油溶解于含有海藻糖、抗菌素的盐溶液，最终甘油的浓度为25～35％(v/v)。
4.根据权利要求3所述的一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液及其制备方法，其特征在于，所述抗菌素为硫酸庆大霉素,浓度为7～14μg/ml。
5.根据权利要求3所述的一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液及其制备方法，其特征在于，所述盐溶液是以4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)和3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)为缓冲剂，以钠、钾、镁、钙离子为基础，并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、人血白蛋白为能量物质的化合物培养溶液；其中包含：氯化钠95.00–105.00mmol/L、氯化钾3.45–6.55mmol/L、硫酸镁0.55～0.65mmol/L、氯化钙1.75～2.22mmol/L、磷酸二氢钠0.18～0.39mmol/L、柠檬酸钠0.58～1.78mmol/l、碳酸氢钠3.85～5.45mmol/L、HEPES和MOPS15.00～25.00mmol/L、葡萄糖0.38～0.68mmol/L、丙酮酸钠0.28～0.42mmol/L、乳酸钠12.48～23.68mmol/L、人血白蛋白5～15mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种用于人类辅助生殖的精子冷冻液及其制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)称量各种无机盐组分溶于注射级用水中，配制成盐溶液，
(2)加入抗菌素葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠溶于盐溶液中；溶解过程先加固体原料，再加液体原料；
(3)检测步骤(2)所得盐溶液的渗透压和pH值，并记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持为275～310mOsm/Kg，所述pH值保持为7.0～7.4；
(4)按照预配置的容量，配制海藻糖的工作浓度为0.15～0.65mol/L；
(5)按照预配置的容量，将药用级人血白蛋白加入到盐溶液中,终浓度为5～15mg/mL；
(6)将甘油加入步骤(5)制得的盐溶液中溶解均匀，使其浓度为25～35％(v/v)；
(7)将步骤(6)所得溶液经过0.2μm滤膜过滤灭菌后，取样测试；测试参数：
A、pH值：7.00～7.40；
B、渗透压：1720～2020mOsm/Kg；
C、内毒素：＜0.25EU/ml；
D、1细胞鼠胚培养到96h：≥80％的囊胚形成率；
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