CN108651440A - 一种人类精液超快速冷冻保存体系 - Google Patents

一种人类精液超快速冷冻保存体系 Download PDF

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Abstract

一种适用于人类精子的超快速冷冻保存体系，包括冷冻保护剂、冷冻方法和解冻方法，本发明提供的冷冻保存体系，适用于未处理的人类精液和经过优选后的人类精液，以及微量人类精液的冷冻，使用本发明所述的冷冻保护剂与人类精液充分混合后，采用本发明提供的冷冻方法进行冷冻保存，并且采用本发明提供的解冻方法复苏后，可以获得与普通冷冻方法更好的冷冻复苏率、精子活力和前向运动精子总数。具有适用范围广，操作简便和操作时间短的优点。

Description

一种人类精液超快速冷冻保存体系
技术领域
本发明涉及细胞的冻存领域，尤其是人类精液保存技术领域，属于生物技术领域，具体为一种人类精液超快速冷冻保存体系。
背景技术
辅助生殖技术的进步，为发生率为10％-15％的不孕症患者提供了能够拥有健康后代的希望。在辅助生殖中，人类精液的保存是最为基本的常规操作技术之一，精液冷冻技术的不断提升，意味着可以应用于临床使用的精子数量和质量的提高，有利于优生优育，人类精液的冷冻保存是男性不育症治疗的有效操作之一。另一方面，近年来，伴随着男性的生育年龄推后、环境影响等原因，男性精液质量持续下降，人类精液的冷冻保存为男性生育力的保存提供了强有力的保障。目前衡量人类精液冷冻质量的主要指标为精子冷冻复苏率，影响精子冷冻复苏率的主要因素分为精液自身因素和非自身因素，非自身因素主要包括实验室因素(包括冷冻保护剂、冷冻方法、冷冻载体、复苏方法等)和其他因素(季节因素、禁欲时间等)。精液自身因素和季节因素等属不可控因素，而本发明在可控的范围内提供了一种超快速的冷冻方法，优化了传统的人类精液冷冻保存方法，并且可以用于冻存优选处理后的精液和微量精液。
发明内容
本发明提供了一种人类精液的超快速冷冻保存体系，与传统的冷冻保存体系相比，降低了冷冻保护剂的生物毒性，克服了操作时间长和方法复杂等缺点。
一种人类精液的超快速冷冻保存体系，包括冷冻保护剂、冷冻方法和解冻方法。其特征在于，采用本发明的冷冻保护剂与人类精液充分混合后，采用本发明的冷冻方法进行冷冻保存，并且采用本发明提供的解冻方法复苏后，可以获得与传统冷冻方法更好的冷冻复苏率，精子活力和前向运动的精子总数。
为实现上述目的，本发明提供如下的方法体系：一种人类精液超快速冷冻保存体系，包括如下步骤：
A、配置冷冻保护剂，将配置好的冷冻保护剂，或者冻存的已配置好的冷冻保护剂置于37℃水浴箱中预热30分钟；
B、将精液与本发明提供的冷冻保护剂，按照1:1的比例充分混合。
C、取清洁容器，容器内加入清洁液氮。将步骤B中混匀的精液与冷冻保护剂混合物在清洁液氮上方至少5厘米处，以每滴10-100微升的体积将混合物滴入清洁液氮中。
D、收集沉入清洁液氮中的凝固液滴，将其装入普通冻存管中，液氮中保存。
E、将普通精液培养基装入15毫升离心管，以35℃-42℃的温度预热培养基，作为解冻液。
F、将步骤D中的凝固液滴从普通冻存管中取出，投入预热后的解冻液中，晃动至完全解冻。
G、将解冻液和冻存精液混合物离心去除上清后，沉淀精子可以直接用于临床。
优选地，步骤A中所述的冷冻保护剂，其特征在于：含有糖类、人血清白蛋白、甘氨酸和双蒸水。保护剂组分均匀混合后，经过0.22微米的过滤器过滤后，可冻存于-20℃保存
优选地，步骤A中所述冷冻保护剂含有的糖类可以是葡萄糖，蔗糖或者海藻糖之一。
优选地，步骤A中所述冷冻保护剂若使用葡萄糖配制，葡萄糖的含量为每1毫升冷冻保护剂含有0.045克-0.108克。
优选地，步骤A中所述冷冻保护剂若使用蔗糖配制，蔗糖的含量为每1毫升冷冻保护剂含有0.086克-0.205克。
优选地，步骤A中所述冷冻保护剂若使用海藻糖配制，海藻糖的含量为每1毫升冷冻保护剂含有0.095克-0.227克。
优选地，步骤A中所述冷冻保护剂海含有人血清白蛋白，人血清白蛋白的含量为每1毫升冷冻保护剂含有0.1％-0.5％的人血清白蛋白。
优选地，步骤A中所述冷冻保护剂含有甘氨酸，甘氨酸的含量为每1毫升冷冻保护剂含有0.006克-0.025克。
优选地，步骤B中所示的精液，可以是新鲜液化后的精液，也可以是经过分选处理后的精液，也可以是微量体积的精液。
优选地，步骤E中的解冻液体积应该是冻存精液体积的10倍以上。
优选地，步骤G中的离心机的离心力保持在300g-500g之间，离心时间为3分钟-5分钟。
与现有的技术相比，本发明的优势在于，冷冻保护剂中无渗透性试剂，降低了冷冻保护剂对人类精子的生物毒性，冻存和解冻的时间缩短，便于临床操作。冻存的精液在解冻后无需复杂的密度梯度离心或者精子上游法处理，即可使用。并且在冷冻复苏率上要高于传统的冷冻技术。
具体实施方式
下面将对本发明实施过程中的技术方案进行详细、完整的描述，值得注意的是，所描述的方案仅代表部分实施方式。本领域的科技工作者在阅读本发明内容后，基于本发明中的实施方式，技术工作者在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明的保护范围。
实施例一：
A、配置精液冷冻保护剂：取5毫升双蒸水，加入葡萄糖0.45g(或者蔗糖0.9g，或海藻糖1g)，加入5％人血清蛋白，加入甘氨酸0.06g，定容至10毫升，混匀后0.22μm过滤器过滤。分装后-20℃保存。使用时37℃预热。
B、取液化后的人类新鲜精液0.25毫升，与上述预热后的冷冻保护剂按照1：1的比例充分混合。
C、取清洁的容器，灌入清洁液氮，在清洁液氮面上方至少5cm处，缓慢按照每滴40微升的体积，将精液和冷冻保护剂混合物滴入清洁液氮中。待液滴在清洁液氮中凝固后，用眼科镊将凝固液滴放入普通冻存管中冻存。
D、用15毫升离心管装入10毫升普通精液培养基，以42℃预热30分钟。
E、将液氮中的冻存精液凝固液滴直接倒入预热的培养基中，晃动至解冻。
F、以300g的离心力离心5分钟后，去除上清，沉淀即可用于实践。
实施例二：
A、配置精液冷冻保护剂：取5毫升双蒸水，加入葡萄糖1g(或者蔗糖1.5g，或海藻糖1.5g)，加入2％人血清蛋白，加入甘氨酸0.085g，定容至10毫升，混匀后0.22μm过滤器过滤。分装后-20℃保存。使用时37℃预热。
B、取经过密度梯度离心优选后的精液0.1毫升，与上述预热后的冷冻保护剂按照1：1的比例充分混合。
C、取清洁的容器，灌入清洁液氮，在清洁液氮面上方至少5cm处，缓慢按照每滴20微升的体积，将精液和冷冻保护剂混合物滴入清洁液氮中。待液滴在清洁液氮中凝固后，用眼科镊将凝固液滴放入普通冻存管中冻存。
D、用15毫升离心管装入10毫升普通精液培养基，以42℃预热30分钟。
E、将液氮中的冻存精液凝固液滴直接倒入预热的培养基中，晃动至解冻。
F、以500g的离心力离心3分钟后，去除上清，沉淀即可用于实践。
实施例三：
A、配置精液冷冻保护剂：取5毫升双蒸水，加入葡萄糖0.5g(或者蔗糖0.9g，或海藻糖0.95g)，加入4％人血清蛋白，加入甘氨酸0.09g，定容至10毫升，混匀后0.22μm过滤器过滤。分装后-20℃保存。使用时37℃预热。
B、取睾丸穿刺或附睾穿刺获取的精子，以普通培养基调整至0.1毫升，与上述预热后的冷冻保护剂按照1：1的比例充分混合。
C、取清洁的容器，灌入清洁液氮，在清洁液氮面上方至少5cm处，缓慢按照每滴20微升的体积，将精液和冷冻保护剂混合物滴入清洁液氮中。待液滴在清洁液氮中凝固后，用眼科镊将凝固液滴放入普通冻存管中冻存。
D、用15毫升离心管装入10毫升普通精液培养基，以42℃预热30分钟。
E、将液氮中的冻存精液凝固液滴直接倒入预热的培养基中，晃动至解冻。
F、以300g的离心力离心5分钟后，去除上清，沉淀即可用于实践。
将本发明各实施例中冻存的精液，采用本发明提供的解冻方法进行解冻后，使用计算机辅助精子分析系统，对比传统保存体系中冷冻复苏后的精子的冷冻复苏率、精子活力和前向运动精子百分率进行对比，得到实验数据如下表所示：
冷冻复苏率 活力 前向运动精子百分率
传统冷冻保存 59.2％ 40.6％ 28.0％
实施例一 75.1％ 52.1％ 33.3％
实施例二 73.1％ 46.9％ 29.3％
实施例三 69.2％ 48.2％ 32.9％
解冻后精子活力÷冷冻保存前精子活力＝冷冻复苏率。
由以上数据可知，采用本发明所提供的冷冻保存体系，与传统的冷冻保存体系相比，可以获得更加理想的冷冻复苏效果，有利于实践应用。
本发明提供的人类精液冷冻保存体系能够适用于未处理过的人类精液和已经过优选处理的精液的冷冻保存，并且能够获得与传统冷冻方法相比较好的冷冻复苏效果。
根据以上所给的实施例，本领域的技术人员或者研究人员可以在不脱离本发明原理的情况下对实施例进行变化、修改、替换，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
附图说明
图1为本发明所示液滴法冷冻操作示意图。
图中，1-操作所用移液管，2-正在冷冻凝固的液滴，3-盛放清洁液氮的溶液，4-盛放凝固液滴的容器，5-已经凝固的液滴，6-液氮。

Claims (7)

1.一种人类精液超快速冷冻保存体系，包括冷冻保护剂、冷冻方法和解冻方法，其特征在于，采用本发明提供的冷冻保护剂，按照本发明所示的冷冻方法和解冻方法冻存和解冻人类精液，可以在解冻复苏后获得较好的冷冻复苏率、精子活力和前向运动精子总数。
2.依照权利要求1所述的保护剂，其特征在于保护剂的成分包括糖类、人血清白蛋白、甘氨酸和双蒸水。
3.依照权利要求2所述的糖类成分，其特征在于，该糖类成分可以是葡萄糖，蔗糖和海藻糖的其中之一。其质量配比关系为：若采用葡萄糖，则葡萄糖含量为0.045g/ml-0.108g/ml；若采用蔗糖，则蔗糖含量为0.086g/ml-0.205g/ml；若采用海藻糖，则海藻糖含量为0.095g/ml-0.227g/ml。
4.依照权利要求2所述的人血清白蛋白成分，其特征在于，人血清白蛋白的含量为每1毫升冷冻保护剂含有0.1％-0.5％的人血清白蛋白。
5.依照权利要求2所述的甘氨酸成分，其特征在于，甘氨酸的含量为每1毫升冷冻保护剂含有0.006克-0.025克。
6.依照权利要求1所述的冷冻方法，其特征在于，具体操作步骤如下：
(1)将优选后或者未处理人类精液，或经过睾丸穿刺或者附睾穿刺获得到的微量精液，与冷冻保护剂按体积比1:1的比例混合均匀；
(2)将精液和冷冻保护剂混合物精液和冷冻保护剂混合物滴落点距离清洁液氮的液面至少5厘米；
(3)以每滴10微升-100微升的体积，将混合物滴入清洁液氮中；
(4)收集处于清洁液氮内的凝固液滴，可装入普通冻存管中放置于液氮中冻存。
7.依照权利要求1所述的解冻方法，其特征在于，具体操作步骤如下：
(1)35℃-42℃预热普通的精液培养基作为解冻液，解冻液的体积应至少是冷冻精液体积的10倍；
(2)将冻存的凝固精液液滴倒入预热后的解冻液中至完全解冻；
(3)将解冻液和冻存精液混合物离心去上清，离心力保持在300g-500g之间，离心时间为3分钟-5分钟，沉淀后的精子可以直接应用于实践。
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