SUMINISTRO DE UNA MASA CELULAR GRANDE EN UNA JERINGA Y MÉTODOS RELACIONADOS DE CRIOPRESERVACION DE CÉLULAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN Las modalidades de esta invención se refieren en general a un método de uso de una jeringa para suministrar una masa celular grande de células criopreservadas a un biorreactor sin la necesidad de expansión celular, y a los métodos relacionados para conservar biológicamente los materiales activos en el campo de la biotecnología. Más particularmente, las modalidades de los procesos descritos aquí se refieren, por ejemplo, a la criopreservación de materiales biológicos durante periodos prolongados de tiempo, y puede facilitar la inoculación substancialmente directa de un biorreactor con los materiales criopreservados. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El campo de la biotecnología involucra la manipulación y/o el diseño genético de organismos vivientes, tales como células de mamífero, para producir nuevas líneas celulares que ayudan en la producción de productos biológicamente activos. Estos productos pueden incluir, pero no están limitados a, hormonas, factores del crecimiento, interleucinas, citocinas, e inmunoglobulinas. El desarrollo de nuevas líneas celulares, por medio de manipulación y/o diseño genético, generalmente involucra inversiones grandes
Ref..179057 de tiempo y recursos. Por consiguiente, la conservación exitosa de células y líneas celulares desarrolladas recientemente es importante para la investigación y para el desarrollo de muchos productos biológicos. Además, el proceso de conservar las células no debe, por si mismo, dañar o destruir las células. El establecimiento de los bancos de células que almacenan las líneas celulares desarrolladas recientemente por lo tanto no es crítico para el campo de la biotecnología. El sistema de un banco de células, como un medio de conservación de líneas celulares desarrolladas recientemente, asegura que la línea celular sea conservada, su integridad sea mantenida, y un suministro suficiente de la línea celular este disponible fácilmente para su uso. Además, los bancos de células pueden ser preferidos a causa de que protegen las líneas celulares preservadas, entre otras cosas, la desviación genética debido a la inestabilidad genética, la senescencia, la transformación, la inestabilidad genotípica debido a la selección y diferenciación, la contaminación viral o microbiana, y la contaminación cruzada por otras líneas celulares. Los métodos convencionales de conservación de las células involucran una técnica conocida como criopreservación. La criopreservación puede ser definida ampliamente como la reducción de la temperatura de las estructuras vivientes y las moléculas bioquímicas hasta el punto de congelamiento y más allá, en donde ningún cambio físico o químico ocurrirá, para los propósitos de almacenamiento y la recuperación futura del material en su condición viable, pre-congelada. En la práctica común, las células son colectadas, suspendidas en una solución de almacenamiento, y luego congeladas para la conservación. Cuando las células son necesarias, las mismas son descongeladas entonces y re-cultivadas en el medio de crecimiento a 37 °c El desafío para las células durante la criopreservación no es su capacidad para resistir el almacenamiento a temperaturas bajas; sino que en lugar de esto, es la letalidad de una zona intermedia de temperatura (por ejemplo, -15 hasta -60 °C) que las células deben atravesar dos veces, una vez durante el enfriamiento y una vez durante el calentamiento. Véase Peter Mazur, Freezing of Living cells: mechanisms and implications, 247 AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY 125, 142 (1984) . Cuando las células son enfriadas aproximadamente a -5 °C, tanto las células como el medio circundante permanecen sin congelar y superenfriadas . Cuando las células son enfriadas adicionalmente, entre aproximadamente -5 °C y aproximadamente -15 °C, el hielo empieza a formarse en el medio externo. Sin embargo, los contenidos de las células permanecen sin congelar y superenfriadas . El agua superenfriada en las células tiene, por definición, un potencial químico mayor que aquel del agua en la solución extracelular parcialmente congelada. Así, el agua fluye fuera de las células osmóticamente y se congela fuera de las células. Los eventos físicos subsiguientes en las células dependen de la velocidad de enfriamiento. El enfriamiento rápido minimiza los efectos de la concentración del soluto cuando el hielo se forma uniformemente pero conduce a más hielo intracelular. En contraste, el enfriamiento lento conduce a una pérdida de agua más grande desde la célula y a menos hielo interno, pero incrementa los efectos de la solución. Una velocidad de enfriamiento homogénea, óptima, de 1 °C por minuto es preferida usualmente. Al menos algunos métodos comunes utilizados para criopreservar las células incluyen la práctica de agregar suero de animal (por ejemplo suero de bovino fetal (FCS (por sus siglas en inglés)) así como agentes criopreservadores (CPA (por sus siglas en inglés) ) al medio de congelamiento/solución de almacenamiento de la célula) tradicionalmente, el suero del animal ha sido utilizado para la preservación de las células cuando el mismo estabiliza las membranas celulares, y protege el contenido intracelular de los efectos de una concentración elevada de solutos. Sin embargo, debido a asuntos relacionados con las enfermedades de los animales circundantes tales como la encefalopatía espongiforme de bovino (es decir, la enfermedad de las vacas locas) la adición de un suero de animal, en algunos casos, puede exponer las células conservadas a una fuente de contaminación indeseable. La aplicación clínica y comercial de la criopreservación para las células puede estar limitada por la capacidad para recuperar un número significativo de células viables. Por ejemplo, los métodos comunes de criopreservación de las células producen un número suficiente de células para inocular directamente un biorreactor de 20 litros. Puesto que el número de células viables recuperadas del descongelamiento de las células criopreservadas, es insuficiente, las células deben ser sometidas a la expansión de los cultivos celulares para producir celulares adicionales hasta que existen suficientes células para inocular el biorreactor de 20 litros. El proceso común de la expansión del compuesto celular previo a la inoculación de tal reactor toma aproximadamente 2 a 4 semanas, dependiendo de la línea celular. Debido a que el proceso de expansión se considera que consume mucho tiempo, que es de trabajo intenso, y una fuente de contaminación, la formación de bancos y la preservación de la masa celular grande está llegando a ser crecientemente importante en el campo de biotecnología. Los métodos comunes de conservación de números grandes de células incluyen el uso de criobolsas para almacenar las células durante el congelamiento. Las criobolsas han sido utilizadas para almacenar volúmenes más grandes de células a densidades convencionales. Sin embargo, las criobolsas poseen muchas desventajas que limitan su versatilidad cuando son utilizadas para la criopreservación de células. Por ejemplo, las criobolsas son sometidas a experimentar potencialmente gradientes de temperatura a través de la muestra que conducen a velocidades de enfriamiento no homogéneas . Una velocidad de enfriamiento homogénea es vital para el éxito del proceso de conservación. Adicionalmente, las criobolsas deben ser congeladas en congeladores de velocidad controlada especiales para prevenir el choque térmico del material y la ruptura de la bolsa durante el enfriamiento. Los mismos también pueden llegar a ser quebradizos una vez que la temperatura es reducida abajo del punto de transición vitrea del material de la bolsa, conduciendo a la ruptura o rotura durante la manipulación y el almacenamiento. Las criobolsas son descongeladas usualmente en baños de agua, que pueden conducir a un daño celular y/o contaminación indeseables. Por consiguiente, existe la necesidad un proceso de criopreservación que estabilice las células durante el congelamiento, que proteja las células del daño, que no sea tóxico, que permita el congelamiento de las células a una densidad elevada, que permita la recuperación rápida de las células congeladas, que reduzca el potencial de contaminación externa, y que sea adecuado para una amplia gama de tipos de células en una amplia variedad de aplicaciones clínicas y de cultivo celular. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Las modalidades de la invención proporcionan aparatos y procedimientos para el congelamiento y descongelamiento de un volumen grande de células, por ejemplo, las masas celulares de entre aproximadamente 3.0 x 108 células y aproximadamente 5.0 x 109 células, que son adecuados para la expansión rápida durante el descongelamiento. La presente invención también permite la criopreservación de un volumen grande de células a densidades más elevadas (por ejemplo, aproximadamente a 3.0 x 107 células/ml y aproximadamente 5.0 x 108 células/ml) tanto con, como sin, un suero de animal. El congelamiento de tales densidades es efectuado por medio de la adición de crioprotectores de permeación al medio de congelamiento a concentraciones elevadas o mayores que las normales. Además, la presente invención permite la inoculación substancialmente directa de un biorreactor con las células congeladas . De acuerdo con un aspecto de la presente invención, un aparato para el almacenamiento y distribución de las células criopreservadas incluyen un cuerpo que tiene un primer extremo abierto y un segundo extremo abierto, una primera tapa configurada para fijarse removiblemente al primer extremo abierto, una segunda tapa configurada para fijarse removiblemente al segundo extremo abierto, una porción de émbolo contenida dentro del cuerpo y adyacente a uno de los extremos abiertos, y un vastago del émbolo configurado para ser conectado a la porción del émbolo, en donde al menos una porción del aparato está hecha de un material biocompatible. Otro aspecto de la presente invención incluye un método de congelamiento rápido de las células. El método incluye adquirir una cantidad deseada de las células para crioalmacenamiento, suspender las células adquiridas en el medio de congelamiento enfriado que contiene un crioprotector de permeación, en donde el medio de congelamiento está a una temperatura de aproximadamente 0°C hasta 4 °C, colocar las células y el medio de congelamiento en un aparato configurado para almacenar y distribuir las células criopreservadas, en donde al menos una porción del aparato está hecha de un material biocompatible, y enfriar rápidamente el aparato que contiene las células y el medio de congelamiento enfriado hasta una temperatura de -130 °C o más abajo a una velocidad de aproximadamente 8 °C/minuto. Todavía otro aspecto de la presente invención incluye un método de descongelamiento rápido de las células criopreservadas . El método incluye la recuperación de un aparato de almacenamiento que contiene el medio congelado y las células que tienen una temperatura aproximada de -130 °c o abajo de esta, y transferir el medio congelado y las células desde el aparato de almacenamiento hasta un receptáculo de descongelamiento que contiene el medio de crecimiento a una temperatura de aproximadamente 37 °C para descongelar las células . Un aspecto adicional de la presente invención incluye un método de crioalmacenamiento de las células . El método incluye adquirir una cantidad deseada de células para crioalmacenamiento, colocar las células adquiridas en un medio de congelamiento enfriado que contiene un crioprotector de permeación, almacenar las células y el medio de congelamiento en un aparato adecuado para crioalmacenamiento, en donde el aparato está configurado para almacenar y distribuir las células criopreservadas e incluye un cuerpo que tiene un primer extremo abierto y un segundo extremo abierto, una primera tapa configurada para fijarse removiblemente al primer extremo abierto, una segunda tapa configurada para fijarse removiblemente al segundo extremo abierto, una porción del émbolo contenida dentro del cuerpo y adyacente a uno de los extremos abiertos, y un vastago del émbolo configurado para ser conectado a la porción del émbolo, en donde al menos una porción del aparato está hecha de un material biocompatible. El método también incluye la etapa de enfriar el aparato hasta una temperatura aproximada de -130 °C o un valor más bajo. Otro aspecto de la presente invención incluye un método para inocular un biorreactor con las células criopreservadas . El método incluye adquirir una cantidad deseada de células para crioalmacenamiento, colocar las células adquiridas en el medio de congelamiento enfriado que contiene un crioprotector de permeación, almacenar las células y el medio de congelamiento en un aparato configurado para almacenar y distribuir las células criopreservadas, en donde el aparato incluye un cuerpo que tiene un primer extremo abierto y un segundo extremo abierto, una primera tapa configurada para fijarse removiblemente al primer extremo abierto, una segunda tapa configurada para fijarse removiblemente al segundo extremo abierto, una porción de émbolo contenida dentro del cuerpo y adyacente a uno de los extremos abiertos, y un vastago del émbolo configurado para ser conectado a la porción del émbolo. En donde al menos una porción del aparato se hace a partir de un material biocompatible. El método incluye además el enfriamiento del aparato hasta una temperatura aproximada de -130 °C o abajo de esta; subsiguientemente para enfriar el aparato hasta una temperatura aproximada de -130 °C o abajo de este valor, transfiriendo el medio congelado y las células desde el aparato hasta un recipiente de descongelamiento que contiene el medio de crecimiento a una temperatura substancialmente más caliente que 0 °C, e inocular un biorreactor con las células desde el recipiente de descongelamiento. Todavía otro aspecto de la presente invención incluye una composición para criopreservación de una masa celular grande a una densidad elevada. La composición incluye un medio de congelamiento que incluye un crioprotector de permeación, en donde la concentración del crioprotector de permeación es suficiente para permitir que las células sean almacenadas a una densidad mayor que 1.5 x 108 células/ml; y que un volumen grande de células, entre aproximadamente 3.0 x 108 células y aproximadamente 5.0 x 109 células, sea almacenado . Otro aspecto de la presente invención incluye un método de congelamiento de una masa celular grande a una densidad elevada. El método incluye suspender una masa celular grande en un medio de congelamiento que contiene un crioprotector de permeación, en donde la concentración de crioprotector de permeación es suficiente para permitir que las células sean almacenadas a una densidad mayor que 1.5 x 108 células/ml, colocando las células y el medio de congelamiento en un aparato de congelamiento, y enfriar las células y el medio de congelamiento a una temperatura en o abajo de aproximadamente -130 °C. Un aspecto adicional de la presente invención incluye un método de descongelamiento rápido de una masa celular congelada, grande. El método incluye la recuperación de un aparato de almacenamiento que contiene una masa celular congelada y el medio de congelamiento, y transferir la masa celular congelada y el medio de congelamiento desde el aparato de almacenamiento hasta un recipiente de descongelamiento que contiene el medio de crecimiento a una temperatura de aproximadamente 37 °C para descongelar las células . Otro aspecto de la presente invención incluye una composición para criopreservar una masa celular grande a una densidad elevada. La composición incluye un medio de congelamiento que incluye sulfóxido de dimetilo al 20 % (DMSO) , en donde el medio de congelamiento no incluye un suero de animal, y en donde la concentración del DMSO es suficiente para permitir que las células sean almacenadas a una densidad mayor que 3.0 x 107 células/ml, y que un volumen grande de las células sea almacenado. Todavía otro aspecto de la presente invención incluye un método de congelamiento de una masa celular grande a una densidad elevada. El método incluye la suspensión de una masa celular grande en un medio de congelamiento que contiene 20 % de DMSO, en donde el medio de congelamiento no incluye el suero de un animal y en donde la concentración del DMSO es suficiente para permitir que las células sean almacenadas a una densidad mayor que 3.0 x 107 células/ml, colocando las células y el medio de congelamiento en un aparato de congelamiento, y enfriar las células y el medio de congelamiento a una temperatura en o abajo de aproximadamente -130 °C. Los objetos y ventajas adicionales de la invención serán descritos, en parte, en la descripción que sigue, y en parte, serán obvios de la descripción, o pueden ser aprendidos por la práctica de la invención. Los objetos y ventajas de la invención serán realizados y logrados por medio de los elementos y combinaciones, puntualizados particularmente en las reivindicaciones anexas . Se va a entender que tanto la descripción general precedente como la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicatorios solamente y no se propone que sean restrictivos de la invención como se reivindica. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras que se anexan, las cuales son incorporadas en, y constituyen una parte de esta especificación, ilustran una modalidad de la invención, y junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención. La figura 1 es una vista parcialmente en despiece de una jeringa, de acuerdo con una modalidad de la presente invención.
La figura 2 es una vista parcialmente en despiece de una jeringa, de acuerdo con otra modalidad de la presente invención. La figura 3 es una vista esquemática del dispositivo de la figura 1 en una configuración parcialmente ensamblada. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ahora se hará referencia con detalle a las modalidades de la invención, un ejemplo de las cuales es ilustrado en las figuras que se anexan. En donde sea posible, los mismos números de referencia serán utilizados de principio a fin de las figuras para referirse a las mismas partes o a partes semejantes. La presente invención proporciona aparatos y procesos para el congelamiento y descongelamiento de las células en volúmenes grandes adecuados para la expansión rápida durante el descongelamiento. Un volumen grande de células congeladas y descongeladas utilizando un método de acuerdo con la presente invención, tiene una tasa de supervivencia de al menos entre 60 %-90%, la cual es significativamente más elevada que los métodos de criopreservación convencionales para masas celulares grandes . La presente invención también permite la criopreservación de un volumen grande de las células a densidades más elevadas (por ejemplo, aproximadamente 3.0 x 107 células/ml hasta 5.0 x 108 células/ml) sin un suero de animal . El congelamiento a tales densidades es efectuado por medio de la adición de crioprotectores de permeación al medio de congelamiento en concentraciones elevadas o mayores que las normales . Además, la presente invención permite la inoculación substancialmente directa de un biorreactor con las células congeladas. Específicamente, la necesidad para la expansión de un cultivo celular después de la congelación ha sido eliminada. Esto ahorra tiempo y reduce el potencial de la contaminación. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, un método y un aparato para el congelamiento de una masa celular grande a una densidad elevada es provisto. Como está contemplado aquí, las células son separadas de su medio previo y empacado densamente, por ejemplo, por centrifugación a una fuerza relativamente elevada (es decir, un proceso conocido en el arte como una "centrifugación intensa"). En la preparación para el congelamiento, las células empacadas son re-suspendidas entonces en un volumen adecuado de un medio de congelamiento biológicamente compatible. La selección y preparación de la composición del medio de congelamiento utilizado para suspender y proteger las células durante el proceso de congelamiento involucra la consideración de varios factores. El medio de congelamiento puede comprender uno o más aditivos que incluyen, pero que no están limitados a, el suero de un animal (por ejemplo el suero de ternero fetal (FCS) o suero de bovino fetal (FBS) ) y crioprotectores (es decir, agentes con una solubilidad elevada en el agua y una toxicidad baja) . Los crioprotectores introducidos al medio de congelamiento pueden mejorar la supervivencia de las células por la limitación o prevención del daño de las células durante los procesos de congelamiento y descongelamiento. Los agentes crioprotectores, las substancias químicas que reducen la lesión durante el congelamiento, son separadas usualmente en dos clases amplias con base en su habilidad para difundirse a través de las membranas celulares . Los crioprotectores de permeación son capaces de moverse a través de las membranas celulares mientras que los agentes que no son de permeación no lo pueden hacer. Los agentes de permeación usualmente poseen un peso molecular bajo y una permeabilidad de la membrana celular elevada, y se cree que trabajan para facilitar la deshidratación de la célula en las etapas iniciales de enfriamiento. Cuando procede el enfriamiento, los agentes de permeación continúan difundiéndose, hacia la célula, por lo cual reducen el punto de congelamiento intracelular por un efecto coligativo. La difusión en la célula y el reemplazo del agua intracelular protege contra la presión osmótica elevada y previene que se colapse el citoesqueleto de la célula. Adicionalmente, el agente de permeación forma una capa externa que protege a las proteínas de las células de la desnaturalización por vitrificación con cualquier cantidad de agua restante sobre la superficie de las proteínas. Los crioprotectores que no son de permeación actúan por la deshidratación de la célula a temperaturas de sub-enfriamiento elevadas, por lo cual les permite que sean enfriados rápidamente, evitando los efectos perjudiciales del enfriamiento lento. Estos compuestos son generalmente polímero que forman enlaces de hidrógeno extensos con el agua, reduciendo la actividad del agua. Durante el proceso de congelamiento, el soluto es rechazado de la fase sólida de la solución de la suspensión celular, y un cambio abrupto en la concentración de la porción del liquido de la solución es producido. En otras palabras, el congelamiento de la suspensión celular (es decir, las células suspendidas en el medio de congelamiento) conduce a la formación de hielo, que provoca un cambio dramático en la concentración del agua sobre un lado de la membrana celular con respecto al otro. Este cambio dramático en la concentración puede crear una diferencia de la presión osmótica. Una célula biológica puede responder a esta diferencia de la presión de la transmembrana por deshidratación de la misma para alcanzar un nuevo estado de equilibrio entre las soluciones intracelular y extracelular.
A velocidades de enfriamiento más bajas, las células pueden ser expuestas a temperaturas de sub-cero elevadas durante periodos prolongados de tiempo, provocando que las células lleguen a ser deshidratadas progresivamente lo cual a su vez puede conducir a una lesión celular. En otras palabras, si se deja demasiado líquido en la célula, la célula puede consumirse y morir. Adicionalmente, el mantenimiento del equilibrio a las velocidades de enfriamiento más elevadas puede ser difícil a causa de que la temperatura está siendo reducida a una velocidad mucho más grande que la velocidad a la cual el agua puede difundirse fuera de la célula. Por consiguiente, cuando la temperatura continua bajando, el líquido es incapaz de difundirse fuera de la célula lo que puede iniciar el congelamiento intracelular. La formación intracelular de hielo es capaz de provocar una lesión mecánica substancial a una célula. Por lo tanto, un crioprotector de permeación puede ser utilizado para limitar la incidencia del daño celular y mejorar la supervivencia de las células durante la criopreservación. El DMSO puede ser preferido a causa de su permeabilidad elevada a las membranas celulares. El DMSO es capaz de introducirse y salir de las células fácilmente durante el congelamiento y descongelamiento, y por lo tanto reduce la incidencia del daño por congelamiento.
La adición de un crioprotector a concentraciones más elevadas que aquellas aceptadas como normales no solo limita la "incidencia del daño celular y mejora la supervivencia de las células, sino que también permite la conservación de las masas celulares grandes en volúmenes relativamente pequeños (es decir, a densidades elevadas sin el uso de sueros de animales tales como FCS) . Habitualmente, las células son congeladas usualmente a densidades entre 1.0 x 107 células/ml y 5.0 x 107 células/ml en soluciones que contienen, por ejemplo, FCS al 20 % y DMSO al 10 %. Véase Nobutaka Ninomiya et al., Large-scale, High Density Freezing of Hibridomas and Its Application to High-Density Culture, 38 BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING 1110, 1110 (1991). Sin embargo, a causa de que el crecimiento está relacionado con substancias tales como el FCS, puede presentar una fuente indeseable de contaminación, puede ser deseable que congele masas celulares grandes a densidades más elevadas sin el uso de substancias tales como FCS. La presente invención proporciona un método de conservación de una masa celular grande (por ejemplo, un número total de células de entre aproximadamente 3.0 x 108 células y aproximadamente 5.0 x 109 células en aproximadamente 10 mililitros) a densidades de la célula más elevadas (por ejemplo, el congelamiento de masas celulares grandes a una densidad de al menos 10 veces más elevadas que aquellas logradas por los métodos comunes, con una velocidad de supervivencia de al menos 60 %, y preferentemente de aproximadamente 90 %. El método puede ser utilizado con o sin substancias tales como FCS. Para lograr el congelamiento de masas celulares grandes a densidades más elevadas tales como, por ejemplo, entre 3.0 x 107 y 5.0 x 108 células/ml, sin el uso de substancias tales como FCS, las células son congeladas en un medio de congelamiento que contiene una concentración del crioprotector más elevada que las concentraciones del crioprotector utilizadas en los métodos convencionales. Por ejemplo, los métodos convencionales solamente son capaces de congelar las células a densidades más elevadas (por ejemplo, 1.5 x 108 células/ml) cuando el medio de congelamiento es suplementado con 20 % de FCS. Véase Nobutaka Ninomiya et al., Large-scale, High Density Freezing of Hibridomas and Its Application to High-Density Culture, 38 BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING 1110, 1110 (1991) . Adicionalmente, los métodos que evitan el uso de un suero de animal solamente han sido exitosos en el congelamiento de las células a una densidad de 5.0 x 107 células/ml en DMSO al 10 %. En contraste, el presente método utiliza, por ejemplo, una concentración de DMSO de entre 15 % hasta 25 %, y preferentemente 20 %. La concentración del crioprotector utilizado en la presente invención (por ejemplo, 20 % de DMSO) permite la conservación de las células a densidades celulares más elevadas a causa de que la concentración del crioprotector crea un incremento en la diferencia de la presión osmótica entre las soluciones intracelular y extracelular. Esta diferencia de la presión sirve para deshidratar las células por la eliminación de aproximadamente 70 % hasta 90 % del contenido de agua de las células . La concentración incrementada del crioprotector también reduce el punto de congelamiento de las células y facilita la deshidratación adecuada de las células. Además, la concentración incrementada de crioprotector ayuda a la protección de las proteínas intracelular contra la desnaturalización. Por consiguiente, la incidencia del congelamiento intracelular y la formación de hielo es reducida y un número menor de células son dañadas como resultado del hielo intracelular. Aunque el DMSO en concentraciones mayores que aquellas aceptadas como normales puede presentar riesgos de toxicidad con respecto a las modalidades biológicas, las modalidades de la presente invención compensan estos riesgos potenciales por el enfriamiento y el descongelamiento de las células a velocidades mayores que aquellas aceptadas como normales . Además, incrementando la concentración del crioprotector de aquellas utilizadas en los métodos convencionales, el método de acuerdo con la presente invención también puede compensar la eliminación de cualquier suero de animal desde el medio de congelamiento. La pérdida del suero del animal puede ser compensada adicionalmente, en algunos casos, por la adición de una cantidad pequeña de un crioprotector que no es de permeación al medio de congelamiento. En algunas modalidades, tales como los procesos que involucran un congelamiento rápido de una etapa, puede ser deseable incluir adicionalmente una concentración pequeña (por ejemplo, 1 % - 5 %) de un crioprotector que no es de permeación. Los crioprotectores que no son de permeación ayudan en la deshidratación de las células a temperaturas más elevadas, y algunas veces son utilizados para proteger las membranas de las células. Los ejemplos de crioprotectores que no son de permeación incluyen, pero no están limitados a, azúcares, dextrano, etilenglicol, polivinil pirrolidona, y almidón de hidroxietilo. En algunos casos, el crioprotector puede ser tóxico para las células a las temperaturas normales, por ejemplo, la toxicidad del DMSO es una función de la temperatura, mientras más elevada sea la temperatura (por ejemplo, mayor que 4 °C) más tóxico llegará a ser. Por lo tanto, puede ser preferible agregar un medio de congelamiento pre-enfriado que contiene DMSO rápidamente a las células justo antes que las células sean congeladas, es decir, cuando las temperaturas de la célula han sido reducidas a aproximadamente 4 °C.
Una vez que las células que se tienen como objetivo para la criopreservación han sido re-suspendidas en el medio de congelamiento, la solución completa puede ser transferida por cualguier proceso conocido a un aparato adecuado para la criopreservación. por ejemplo, la solución puede ser transferida bajo una campana de laboratorio a un recipiente hecho de un material biocompatible adecuado que tiene una pureza elevada y propiedades físicas adecuadas para el congelamiento rápido y el crioalmacenamiento a largo plazo, tales como, por ejemplo, polímeros de ciclo-olefina o copolímeros de ciclo-olefina. Puesto que los polímeros de ciclo-olefina y los copolímeros de ciclo-olefina poseen una permeabilidad baja al gas y al vapor de agua, los mismos minimizan las interacciones adversas con las células. Estos materiales no tienen un punto de transición vitrea, y pueden ser preferidos a causa de que los mismos se previene que lleguen a ser quebradizos o frágiles a temperaturas bajas. Otra ventaja ejemplar del uso de materiales tales como los polímeros de ciclo-olefina y los copolímeros de ciclo-olefina es que los mismos poseen un coeficiente bajo de conducción, y son adaptables para su uso con varios procesos de congelamiento, tales como un congelamiento de una etapa, un congelamiento rápido, o el congelamiento directo hasta la fase de vapor. En una modalidad, el recipiente en el cual las células son almacenadas durante la criopreservación puede ser una jeringa. Las figuras 1-3 muestran ciertas configuraciones de una modalidad ejemplar de tal jeringa 1. Como está comprendido aquí y mostrado en las figuras 2 y 3, la jeringa 1 incluye un cuerpo cilindrico 10 hueco que tiene primero y segundo extremos abiertos, y una saliente 19 para los dedos en uno de los extremos abiertos. La jeringa 1 también incluye una primera tapa 11, una segunda tapa 12, y un émbolo 13 que va a estar localizado dentro del cuerpo 10 y adyacente a un extremo del cuerpo. Como se muestra en las figuras 1 y 2, la segunda tapa 12 puede incluir o no una abertura 20 para facilitar la conexión entre el émbolo 13 y el vastago 14 del émbolo. El émbolo 13 está configurado para ser utilizado con un vastago 14 del émbolo que tiene un primer extremo 15 y un segundo extremo 16. El émbolo 13 se puede hacer de un elaetómero, tal como un caucho sintético de halo-butilo. La porción elastomérica se puede prevenir que tenga contacto directo con los contenidos de la jeringa por una película protectora, por ejemplo, una película de tetrafluoroetileno etileno (ETFE), que cubre la porción elastomérica. La película también puede facilitar el movimiento del émbolo 13 dentro del cuerpo 10 de la jeringa (es decir, para superar la fricción) . En las modalidades en donde el aislamiento de los contenidos de la jeringa es deseable, el émbolo 13 también puede incluir rebordes 22 para mejorar el sellado entre el émbolo 13 y la jeringa 1. Los rebordes 22 pueden tener un diámetro externo aproximado de 15.3 mm hasta 15.4 mm. El primer extremo 15 del vastago 14 del émbolo puede ser configurado para fijar el émbolo 13 por cualquier medio conocido. El segundo extremo 16 del vastago 14 del émbolo puede ser configurado para facilitar el movimiento longitudinal del vastago 14 del émbolo. Por ejemplo, el primer extremo 15 del vastago 14 del émbolo puede incluir roscas de tornillo adaptadas para ser recibidas en roscas de tornillo complementarias 23 provistas en el émbolo 13. El segundo extremo 16 del vastago 14 del émbolo también puede incluir una superficie circular plana o cualquier otra forma de cualquier tamaño adecuado para accionar el vastago del émbolo . La jeringa 1 y sus componentes pueden ser fabricados de cualquier material biocompatible conocido adecuado para el congelamiento y el crioalmacenamiento a largo plazo, y puede tener cualquier forma y/o configuración de sección transversal deseada. Por ejemplo, la jeringa 1 puede tener una sección transversal substancialmente circular. La jeringa 1 también puede tener una o más formas de sección transversal, y/o configuraciones a lo largo de su longitud, y cualesquiera dimensiones deseadas adecuadas para la criopreservación y/o cualesquiera procesos subsiguientes. En una modalidad, la jeringa 1 puede tener dimensiones adaptadas para la inoculación de un biorreactor o un dispositivo semejante, por ejemplo, una longitud total de aproximadamente 84 mm, un cuerpo que tiene un diámetro externo de 19 mm, y un espesor de la pared de aproximadamente 1.5 mm. Se debe entender que la jeringa 1 puede ser utilizada por cualesquier proceso que requiera el almacenamiento, y/o la transferencia de las células desde una fuente hasta otra. Además, la jeringa 1 puede ser utilizada con cualquier tipo de células deseadas, y puede ser utilizada en un medio ambiente que está lleno relativamente con el fluido, o que está relativamente seco. A manera de ejemplo, la primera tapa 11 de la jeringa puede ser fijada al cuerpo 10 por un medio adecuado conocido, por ejemplo, con las roscas 24 o por elementos de ajuste a presión. El sellado entre la tapa 11 y el cuerpo 10 puede ser provisto por cualquier medio adecuado conocido, incluyendo pero sin estar limitado a, anillos en O, juntas, y tapones y sellos biselados. A continuación, el cuerpo 10 puede ser llenado con una solución que contiene las células que se tienen como objetivo para la criopreservación. Subsiguientemente, la segunda tapa 12 y un émbolo 13 pueden ser fijados entonces al cuerpo 10 por cualquier medio conocido adecuado. Alternativamente, el émbolo 13 ya puede estar colocado dentro del cuerpo 10, y la tapa 11 o la tapa 12 fijada al cuerpo 10. La jeringa puede ser llenada entonces con la solución que contiene las células que se tienen como objetivo para la criopreservación previo a la fijación de la tapa 11 o la tapa 12 restantes. Cualquier otro método que permita llenar substancialmente de manera estéril el cuerpo 10 también puede ser utilizado. Una vez que la solución que contiene las células que se tienen como objetivo para la criopreservación ha sido colocada en un receptáculo de almacenamiento (por ejemplo, una jeringa u otro vial) adecuado para la criopreservación, puede empezar el proceso de congelamiento. Por ejemplo, uno o más receptáculos que contienen las células en el medio de congelamiento pueden ser colocados en un recipiente de almacenamiento adecuado para el enfriamiento, tal como una caja Styrofoam o un congelador de velocidad controlada. Los receptáculos pueden ser enfriados entonces a una temperatura apropiada adecuada para la criopreservación, y/o el crioalmacenamiento. Por ejemplo, los receptáculos pueden ser enfriados primero a una velocidad de congelamiento controlada, tal como a una velocidad de aproximadamente 1 °C/minuto, hasta una temperatura de aproximadamente -80 °C. Subsiguientemente, las muestras pueden ser transferidas entonces al nitrógeno líquido en fase vapor para el almacenamiento, en donde las mismas son enfriadas adicionalmente hasta una temperatura de aproximadamente -130 °C o un valor más bajo. En otros casos, puede ser deseable alterar el método ejemplar descrito por la combinación y/o eliminación de una o más etapas del método. Por ejemplo, basado en las dimensiones (es decir, el espesor de la pared, y/o la velocidad de conducción del recipiente elegido, la etapa de enfriar primero el recipiente a una temperatura de aproximadamente -80 °C puede ser eliminada. En tal caso, el recipiente debe poseer una conductividad térmica baja y puede comprender una longitud total de aproximadamente 84 mm, un cuerpo que tiene un diámetro externo de 19 mm, y un espesor de la pared de aproximadamente 1.5 mm. En lugar de ser sometido a un proceso de congelamiento de dos etapas, el recipiente, en compañía de las muestras contenidas en el mismo, puede ser enfriado directamente a un temperatura de aproximadamente -130 °C o un valor más bajo. En tal método, la velocidad de enfriamiento es más rápida que el proceso de dos etapas, por ejemplo, aproximadamente de 8 °C/minuto. Se entiende que el enfriamiento de las muestras puede ser logrado por cualquier medio adecuado y/o conocido en el arte. Por ejemplo, las células pueden ser colocadas en un congelador o colocadas en un tanque que contiene un fluido de enfriamiento (por ejemplo, vapor de nitrógeno) . De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se describirá un método de descongelamiento rápido de las células criopreservadas . Cuando las células criopreservadas son requeridas para su uso, las muestras congeladas pueden ser descongeladas por cualquier medio adecuado y/o conocido en el arte. Por ejemplo, las muestras pueden ser removidas del congelador o del nitrógeno líquido y los receptáculos pueden ser colocados sobre hielo seco para empezar el proceso de descongelamiento. En una modalidad en la cual las células fueron almacenadas en una jeringa como se muestra en las figuras 1-3, el lado externo de la jeringa puede ser rociado con alcohol, o cualquier otra substancia adecuada para desinfectar y/o esterilizar la superficie externa del receptáculo de almacenamiento. A continuación, los contenidos congelados de la jeringa son vaciados directamente en un receptáculo de descongelamiento tal como, por ejemplo, un cultivo de una máquina centrífuga que contiene, por ejemplo, el medio de crecimiento a 37 °C, por ejemplo, removiendo la tapa 11, conectando en vastago 14 del émbolo, al émbolo 13 por medio de la abertura 20 provista en la tapa 12, y accionando el émbolo para expulsar las células congeladas desde la jeringa y hacia la máquina centrífuga. Alternativamente, para reducir el potencial de contaminación, la tapa 12 puede no ser provista con una abertura 20 (véase la figura 2). En tales casos, previo a la conexión del vastago 14 del émbolo, al émbolo 12, la tapa 12 debe ser retirada primero. Una vez que está en la máquina centrífuga, el medio de crecimiento diluye rápidamente el DMSO y anula su toxicidad porque el DMSO y las células se descongelan. Subsiguientemente, las células son separadas del medio de congelamiento, y entonces están listas para el procesamiento adicional, tal como cuando son utilizadas para la inoculación de un biorreactor. Diez mililitros de células congeladas y el medio se descongelan en aproximadamente 43 segundos, lo cual es significativamente más rápido que el tiempo de descongelamiento para otros métodos convencionales. Aunque este método de descongelamiento rápido ha sido descrito en conjunción con el uso de un recipiente de jeringa para el almacenamiento de las células, cualquier otro recipiente adecuado en el cual las células puedan ser criopreservadas y removidas subsiguientemente del recipiente en su estado congelado puede ser utilizado. Una ventaja ejemplar de utilizar un método de acuerdo con la presente invención para descongelar las células criopreservadas es la reducción en la incidencia de recristalización en las soluciones intracelulares y/o extracelulares durante el descongelamiento. El método de descongelamiento de la presente invención previene la formación y/o crecimiento de cristales de hielo potencialmente dañinos por la utilización de una velocidad de calentamiento rápida. La velocidad de calentamiento rápido, cuando se compara con los métodos comunes, hace difícil que los cristales de hielo pequeños que pueden haber sido formados durante el proceso de congelamiento, crezcan hasta cristales de hielo grandes perjudiciales (es decir, la recristalización) por la reducción del tiempo necesario para que se desplacen hasta la zona critica de aproximadamente -60 °C hasta aproximadamente -15 °C. El criopreservador (por ejemplo, DMSO) será utilizado normalmente en una solución a una concentración suficiente para asegurar la supervivencia aceptable sin que sea tóxico en el uso subsiguiente, por ejemplo cuando es transfusionado. La cantidad de criopreservador utilizado también puede depender del tipo de células que son conservadas. Además, las condiciones de tratamiento, tales como la dilución pre- o post-almacenamiento con amortiguadores o un medio de cultivo celular adecuado puede ser deseable. En la descripción detallada precedente, se ha hecho referencia a las figuras que se anexan que forman una parte de la misma, y las cuales son mostradas a manera de ilustraciones de las modalidades específicas, en las cuales la modalidad puede ser practicada. Estas modalidades han sido descritas con suficiente detalle para hacer posible que aquellos expertos en el arte practiquen la invención y se va a entender que otras modalidades pueden ser utilizadas y que se pueden hacer cambios lógicos, mecánicos, y químicos sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Para evitar detalles que no son necesarios para que aquellos expertos en el arte practiquen la invención, la descripción omite cierta información conocida por aquellos expertos en el arte. Otras modalidades de la invención serán evidentes para aquellos expertos en el arte a partir de la consideración de la especificación y la práctica de la invención descrita aquí. Está propuesto que la especificación y los ejemplos sean considerados solamente como ejemplares, con el alcance y espíritu verdadero de la invención que están indicados por las siguientes reivindicaciones . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.