ES2529265B1

ES2529265B1 - Monitorización mediante TAC de procesos de preservación en frío y criopreservación de material biológico

Info

Publication number: ES2529265B1
Application number: ES201300685A
Authority: ES
Inventors: Ariadna CORRAL SOUSA; Alberto OLMO FERNÁNDEZ; Marcin BALCERZYK; David REGALADO LAMPREA; Joaquín COBOS SABATÉ; Ramón RISCO DELGADO
Original assignee: Universidad de Sevilla
Current assignee: Universidad de Sevilla
Priority date: 2013-07-18
Filing date: 2013-07-18
Publication date: 2015-10-07
Anticipated expiration: 2033-07-18
Also published as: WO2015007928A1; ES2529265A1

Abstract

La invención objeto de la presente memoria se refiere al uso novedoso de la tomografía axial computarizada (TAC) para la monitorización de procesos de preservación en frío y criopreservación de material biológico. El uso del TAC permite mejorar significativamente dichos procesos debido a su capacidad de detección de la concentración de crioprotector en los procesos de criopreservación y detección de la formación de hielo en muestras biológicas.#La presente invención se enmarca dentro del sector de la investigación o análisis de materiales por determinación de sus propiedades químicas o físicas, y dentro de éste, es de interés tanto en la conservación convencional de alimentos, como en criopreservación de material biológico de todo tipo (tanto en congelación lenta, vitrificación rápida u otros).

Description

Monitorización mediante TAC de procesos de preservación en frio y criopreservaci6n de malerial biológico

Objeto de la Invención la invención objeto de la presente memoria se refiere al uso novedoso de la tomagrafla axial computarizada (TAC) para la monitorización de procesos de preservación en fria y criopreservación de material biológico. El uso del TAC permite mejorar significativamente dichos procesos debido a su capacidad de detecci6n de la concentración de crioprotector en los procesos de criopreservaci6n y detección de la formación de hielo en muestras biológicas. La presente invención se enmarca dentro del sector de la investigación o análisis de materiales por determinación de sus propiedades qufmicas o flsicas, y dentro de éste, es de interés tanto en la conservación convencional de alimentos, como en criopreservación de material biológico de todo tipo (tanto en congelación lenta, vitrificación rápida u otros).

Estado de la técnica El almacenamiento de material biológico (células, tejidos, etc.) juega un papel esencial dentro de muchas parcelas de la actividad humana: agricultura (semillas) y ganaderia (semen), trasplantes (piel, cómeas, huesos, válvulas, 6rganos), Injertos, tejidos artificiales, sangre, medicamentos, material reproductor en casos de infertilidad, alimentos, etc. Las principales técnicas empleadas para conseguir la conservación del material biológico se basan en la utilización de bajas temperaturas para ralentizar y detener las reacciones qufmicas responsables del envejecimiento y deterioro celular.

El almacenamiento a largo plazo requiere de muy bajas temperaturas. tfpicamente entre -1400C y -1800c. La aparición de hielo durante la preservación y criopreservaci6n es un problema, ya sea intracelular, causando danos irreparables en los distintos orgénulos celulares, o extra-celular, rompiendo y desestructurando el tejido u órgano en cuestión. Para evitar la fonnaci6n de hielo suelen utilizarse los agentes crioprotectores, aunque una concentración elevada de éstos supone un problema igualmente grave para la supervivencia celular.

En el caso de células aisladas, existen dos técnicas que consiguen la criopreservaci6n de forma satisfactoria: el enfriamiento lento y la vitrificación. El enfriamiento lento es hasta ahora el procedimiento más usado. Se basa en el control de la tasa de enfriamiento, y por tanto del ritmo de crecimiento de hielo extracelular con el objetivo de crear un delicado equilibrio entre los distintos factores que causan daflo celular, entre los que se encuentran la formación de hielo intracelular, fracturas y una excesiva deshidratación de la célula . La vitrificación es un proceso mediante el cual un liquido se solidifica en una fase no cristalina (fase vItrea) con un rápido descenso de la temperatura y un aumento en la viscosidad. La vitrificación elimina completamente la formación de cristales de hielo, mejorando en gran medida los resultados obtenidos por el enfriamiento lento

para determinados tipos celulares diflciles de criopreservar.

En lo que se refiere a la conservación de tejidos y órganos, los prinCipios de conservación en fria son los mismos que los aplicables al caso de células aisladas. Sin embargo, aqui el problema es mucho más complejo, debido sobre todo al mayor tamaflo de la muestra, lo que dificulta la transferencia de masa

(crioprotector) y calor (frio).

En 1957 se perfunde por primera vez un 6rgano de mamllero con glicerol, enfriado y preservado a _20°C, en un trabajo publicado por Audrey Smith (ASmijh, 1957)

[1}. En estos experimentos pioneros un corazón de hámster fue perfundido con 2M

de glicerol y expuesto a _20°C. Tras el recalentamiento y lavado del crioprotector, algunas contracciones débiles podlan apreciarse en el 6rgano, pero el

funcionamiento de éste estaba todavia bastante lejos del deseado.

En el a~o 1965, Farrant y Huggins [2]. ambos de manera Independiente, idearon

un nuevo camino hacia la criopreservación de órganos que involucraba una fuerte supresión o incluso total eliminación de la formación de hielo, sin la necesidad de un enfriamiento rápido. El método de Farrant consistfa en ir aumentando la concentración del agente crioprotector a la vez que enfriando en múltiples pasos, de manera que la muestra siempre estuviera sobre la curva del punto de fusión del diagrama de fases ternario del sistema DMSO-agua-NaCI. En sus experimentos Farrant utilizó tejido de músculo liso de útero de conejo. las muestras fueron

almacenadas a -79'C utilizando DMSO como agente crioprotector. La adici6n de

las soluciones crioprotectoras durante el enfriamiento y calentamiento fueron

temperaturas, siempre probando la toxicidad en riñones de conejo. Una de sus soluciones vitrificantes con mejores resultados es la denominada M22, donde el número hace referencia a la conveniencia de incubar los rinones con esta solución

a -22' C (Fahy et al, 2004) [6]. En un reciente trabajo (Fahy at .1. 2009) (7J. Fahy presentó los resultados de un rir'\6n de conejo vitrificado que fue posteriormente trasplantado sin presentar rechazo alguno y con evidencias de funcionalidad.

En cualquier caso, ya sea con la utilización de los crioprotectores presentados por

Fahy, con el método de Liquidus-Tracking de Pegg, o como parte de otros

protocolos de criopreservaci6n, conocer la concentración de crioprotector durante el proceso de enfriamiento es muy importante, ya que nos proporciona información

fundamental para optimizar dichos protocolos, ajustando los tiempos de peñusión

y minimizando de esta forma tanto la toxicidad causada por el crioprotector como la posibilidad de formación de hielo. De igual forma , obtener información acerca de

la eventual formación de hielo en el órgano es fundamental, al ser los da~os

producidos por éste uno de los mayores problemas a solucionar para conseguir la

correcta criopreservación (Pegg 2006) [3,4,5J.

Diferentes métodos han sido desarrollados con el fin de poder monitorizar la

concentración de crioprotector junto a la temperatura. Dr. Pegg, en su trabajo de

criopreservación de cartllago, comenzó midiendo la concentración de crioprotector

basándose en el trabajo de Elford de 1969 [8J, que muestra que cuando una pieza

de tejido es sumergida en una solución de crioprotector, los tiempos de cambio de peso sumergida pueden ser usados para monitorizar el proceso de permeaci6n de

crioprotector en el tejido.

En 2007, Dr. Pegg (Pegg 2007) [9J mejoro su medida de crioprotector mediante

volumetrra y cromatografla. Para determinar el contenido de agua usó la reacción de Kar1 Fischer (KF). Colocaba el tejido en un exceso de reactivo KF y, una vez que toda el agua habla reaccionado, el exceso era valorado con una soluci6n conocida de agua en metanol. Cada dia estandarizaba el sistema at'iadiendo una cantidad conocida de agua, sobre 10 mg, al mismo volumen de reactivo de KF. El

contenido de DMSO se medía mediante HPLC (High Pressure Liquid Cromatography). Los datos eran expresados en términos del peso de tejido y la

concentración del CPA venía dada por la siguiente fórmula:

peso.normalizado.Me]SOxl00

------: ~~~--------~--~--~~~~wlw

peso.nonnalizado.agua + peso.normalizado.MelSa

Fuller (Fuller, Busza and Proctor 1989) {10] utilizó técnicas de resonancia nuclear magnética (NMR) para la medida de concentración de crioprotector en hlgado de rata y Taylor y Busza (1992) {11] para la medida en cómea. Poco después, en 1994, Bateson {12] y su grupo usaron el NMR para medir la concentración de

DMSO al penetrar en la arteria carótida de un conejo.

Este método ha sido también utilizado con otros crioprotectores, por ejemplo por Po-Wah y Fuller en 2001 (Fuller, Takahashi and HurreIl2001) {13] para determinar

la difusión de solutos en higado de rata durante almacenamiento hipoténnico (histidina y camosina). Los protones aromáticos de la histidina y las frecuencias de resonancia del grupo histidilo de la camosina eran observados en el espectro. La integración de las resonancias permitfa establecer la cantidad de solute presente en la muestra, aunque el principal inconveniente del NMR protónico está en su relativamente baja precisión, ya que los errores son del mismo orden de magnitud

que las medidas.

Los métodos anteriormente descritos sólo dan una idea global sobre la cantidad de crioprotector que ha entrado en la muestra, pero no dan ninguna información

sobre la distribución de este crtoprotector dentro del tejido. Esta infonnaclón es

fundamental, puesto que podrfa haber regiones del tejido cargadas con un exceso de crioprotector, mientras que otras podrfan estar cargadas con una concentración insuficiente. Por tanto, ninguno de estos métodos descritos hasta ahora alcanza la precisión necesaria para un control de la concentración del crioprotector requerido para una vitrificación con éxito. El proceso de la eventual formación de hielo tampoco ha sido medido hasta ahora con precisión en el interior de órganos, reduciéndose esta medida a inspecciones visuales a posteriori y poco cuantitativas.

DOCUMENTOS RELEVANTES

{1] A.U. Smfth, Proceedings oflhe Royal Sooiely Series B 147 (1957) 533-544.

[2J J. Farranl, Nalure 205 (1965) 1284-1287. [3J DE Pegg, M.C. Wusleman, L. Wang, Cryobiology 52 (2006) 335-346. [4J D.E. Pegg el al, Cryobiology 52 (2006) 347-359. [5J D.E. Pegg, L Wang, D. Vaughan, Cryobiology 52 (2006) 360-368.

5 [6J G. M. Fahy el al, Cryobiology 48 (2004) 157.

[7] G.M. Fahy el al, Organogénesis 5:3 (2009) 167-175. [8J B.C. Elford el al, Nalure New Biology 236 (1972) 58. [9J D.E. Pegg el al, Cryobiology (2007) 55: 138-147.

10 [10J B.J. Fuller, ALBusza and E. Proclor, Cryobiology 26 (1989) 112. [llJ M.J. Taylor and AL Busza, Cryo-Leff. 13 (1992) 273. [12J EA Baleson el al, Cryobiology 31, (1994) 393. [13J P Wah and B.J. Fuller, Cryobiology 42 (2001) 307-313.

15 [14] Nalionallnslitute of Slandards and Technology:

http://physics.nisí.gov!PhysRefOatafXcomlhtmllxcom1.html

20 Descripción del contenido de las figuras

Figura 1. En esta gráfica se muestra la atenuación de masa (cm 2/g) en el eje de ordenadas para una solución 50% v/v de DMSO en PBS debido a los diferentes tipo de scattering (Fotoeléctrico, Rayleigh y Compton) y debido a la suma de 25 todos los efectos (Total), en función de la energía utilizada en KeV(eje de abscisas). En el caso de la energía caracteristica de nuestros experimentos, en torno a 20 KeV, la primera curva (de mayor coeficiente de atenuación de masa) corresponde al total de todos los efectos. muy seguido del scattering correspondiente al efecto fotoeléctrico, siendo éste el efecto con más relevancia

30 en el caso de las energías utilizadas en nuestro TAC.

Figura 2. Representación en escala logarítmica (Figura 2 a) y en escala lineal

(Figura 2 b) de la atenuación de masa (cm'/g) respecto a la energia (KeV) para

distintas soluciones: 5% v/v y 70% v/v de OMSO en PBS, 5% v/v y 70% v/v de

35 Glicerol en PBS, 5% v/v y 70% vlv de Etilenglicol en PBS, yagua pura (H,O). En el

rango de energías correspondiente a nuestros experimentos, en torno a 20 KeV,

se observa una mayor atenuación de masas para el caso de la solución 70% v/v de DMSO, seguida de la solución 5% vlv de DMSO. Para el resto de las soluciones la atenuación es del mismo orden que la atenuación de masa debido al H20 . Ambas gráficas muestran la influencia del átomo de azufre del DMSO en la atenuación de los rayos X. Las curvas para el glicerol 5% y el etilenglicol 5% se solapan. También las curvas para el glicerol 70% y el etilenglicol 70% se solapan. Por ello resultan difíciles de distinguir en la figura.

Figura 3. Valores de TAe en unidades Hounsefields (HU) obtenidos para las siguientes soluciones, de izquierda a derecha: PBS, 2, 4, 6 Y 8 M de DMSO en PBS. El eje x representa la distancia en mm del corte a lo largo del eje z de la camilla del TAe donde están dispuestas las muestras. La gráfica muestra unos valores de TAC crecientes para mayores concentraciones de DMSO.

Figura 4. Valores de TAC (HU) obtenidos para soluciones, de derecha a izquierda, de PBS, 1, 3, 5 Y 7 M de DMSO en PBS. El eje x muestra la distancia en mm del corte a lo largo del eje z de la camilla del TAC donde están colocadas las muestras. La gráfica vuelve a mostrar valores de TAC más elevados para mayores concentraciones de crioprotector (DMSO).

Figura 5. Representación del nO de pixeles (esferas de 2 cm de diámetro) que tienen el mismo valor de TAC (eje de ordenadas) para cada una de las concentraciones PBS, 10% v/v, 20%v/v .. hasta 80%v/v de DMSO en PBS. El eje de abscisas muestra el valor de TAC para las distintas soluciones desde la curva de PBS (menor valor de TAC) hasta la de 80%v/v DMSO (mayor valor de TAC). Esta gráfica muestra además la dispersión de los datos, siendo mayor en las soluciones de mayor concentración de crioprotector (curva de más anchura).

Figura 6. Representación del número de pixeles (esferas de 2 cm de diámetro) que tienen el mismo valor de TAC para tres soluciones distintas de PBS. La gráfica muestra como para la misma solución las curvas tienen la misma forma y se mantienen entre los mismos valores de TAC, reflejando la reproducibilidad del TAC como método de medida.

Figura 7. Representación de la curva de calibración que relaciona la concentración de DMSO (M) frente al valor de TAC calculada a partir de los resultados de los experimentos previos (figura 3 y figura 4). La gráfica muestra una

linealidad entre la concentración del crioprotector y las señales obtenidas en el lAG con un coeficiente de correlación de r;;; 0,990. Esta curva permite calcular la concentración de crioproteclor para cualquier muestra de concentración desconocida a partir de una medida de lAG sobre la muestra con los correspondientes valores de lAG obtenidos en la medida.

Descripción de la invención Se ha desarrollado un sistema basado en la tomografia axial computarizada (lAC) para la detección de hielo dentro del material biológico, as; como para la medida de la concentración de crioprotector perfundido en los procesos de criopreservación en tiempo real.

Convencionalmente la tomografia axial compute rizada es una técnica de imagen médica que utiliza radiación X para obtener proyecciones o secciones de objetos anatómicos con fines diagnósticos. Los rayos X son la radiación del espectro electromagnético comprendido en el rango aproximado de 3x1016 Hz a 3x1019 Hz

(i.e. , energías de entre 120 eV y 120 keV). A partir de 12 keV la capacidad de penetración de esta radiación los hacen adecuados para el estudio de tejidos vivos. El TAC está basado en la medida de la pérdida de intensidad de rayos X a través de distintas direcciones en el objeto, lo que permite reconstruir el factor de atenuación tridimensionalmente en todo el volumen a partir de técnicas de reconstrucción. Dicho factor de atenuación permite discernir qué tipo de material existe en cada punto. Las señales del TAC reflejan la atenuación de las sustancias y se expresan en unidades Hounsefields (HU). Se toma como referencia la densidad del agua o valor de TAC, obteniendo cada pixel un valor determinado (HU) que se corresponde con un color en la escala de grises (de blanco a negro),.

El uso novedoso del lAC para la caracterización de la concentración de crioprotector y detección de hielo dentro de material biológico se describe a continuación. Cuando un haz de rayos X incide en un objeto, a una distancia d, la intensidad del haz se ha reducido de la manera:

1= 1, exp(-~ d) = 1, exp(-(~/p) p d),

donde lo es la intensidad del haz a la entrada, IJ es una característica del material denominada atenuación, y p es la densidad (másica) del material. La constante IJ/p se denomina atenuación de masa del material. Esta atenuación puede deberse

a distintos procesos físicos, siendo los principales la atenuación coherente

(Rayleigh), la atenuación incoherente (Compton), el efecto fotoeléctrico, la

producción de pares y el efecto fotonuclear. La importancia relativa de cada uno

de estos procesos viene dada por la sección eficaz y depende de la energía de

S: trabajo. La producción por pares sólo se produce a partir de energías de 1.022

MeV, y el efecto fotonuclear sólo se da a energías mayores de 5 MeV. A energías

en torno a los 65 keV, el efecto predominante es el fotoeléctrico, como puede

apreciarse en la figura 1.

Aunque las densidades de los distintos crioprolectores son similares entre si y a la

10: del agua (la sección eficaz del efecto Compton depende básicamente de la

densidad), la sección eficaz del efecto fotoeléctrico tiene una dependencia de ZO,

con Z el número atómico y a un número entre 4 y 4,8. De esta manera, la

presencia del átomo de azufre (Z=16) en el caso del DMSO (uno de los

crioprotectores más importantes y más extensamente usados) aumenta la

15: atenuación de masa sensiblemente, como se puede observar en la figura 2,

calculada a partir de los datos de XCOM [14J. Esto consigue que las diferencias de

concentraciones del crioprotector pueden ser distinguidas con un aparato TAC, lo

cual es de gran interés pues garantiza la correcta perfusión de crioprotector,

protegiendo el sistema tanto de la indeseable formación de hielo, como del exceso

20: de crioprotector y su daño por toxicidad.

De igual forma, es posible utilizar el aparato de TAC para conocer la posible

existencia de hielo y su exacta localización dentro del material biológico, para de

esta forma diseñar protocolos de criopreservación que consigan evitar

correctamente esta formación de cristales de hielo, o, en su caso, la posibilidad de

25: controlar el daño provocado por el hielo en otro tipo de aplicaciones.

la posibilidad de detectar la presencia de hielo radica en la posibilidad de

distinguir con TAC el hielo (agua pura) en un órgano cargado a una cierta

concentración de crioprotector. En la figura 2 se observa igualmente la diferencia

30: obtenida entre el agua pura y las distintas concentraciones de crioprotectores. Ya

que el hielo es agua pura, la cual vemos que tiene una señal mucho menor que

cualquier concentración de DMSO. los cristales de hielos con tamaños mayores

que la mínima resolución del TAC utilizado pueden ser detectados con esta

técnica.

35

En los siguientes ejemplos se muestran distintos experimentos concretos realizados con un micro-TAC, un crioprotector especifico (DMSO) y muestras biológicas concretas (riñones de conejo) para caracterizar la concentración de crioprotector y detectar la presencia de hielo.

Modo de realización de la invención Ejemplo 1. Caracterización de la concentración de crioprotector DMSO

Este ejemplo muestra la aplicación práctica del método para la caracterización de 10 distintas concentraciones de un determinado tipo de crioprotector, DMSO, y de la medida de concentración de éste en el inlerior de riñones de conejo.

Medida de la concentración de DMSO en soluciones acuosas Para los primeros experimentos se prepararon diez tubos Eppendorf (V;2mL)

15 cuyos contenidos eran: 1 Eppendorf con agua destilada, 1 Eppendorf con PBS, 8 Eppendorfs con DMSO en PBS en concentraciones desde 1 M, 2M... hasta aM.

Los parámetros de adquisición de datos utilizados en el TAe fueron los siguientes:

1.: Fuente de rayos X: 65 kV

2.: 180 proyecciones alrededor de 3600

3.: Resolución espacial: 200 micras

25 4. Tiempo de exposición: 1500 ms

En la figura 3 se representan los valores de densidad TAC (HU) para las siguientes soluciones, de izquierda a derecha: PBS, 2M, 4M, 6M, 8M. Puede verse como la atenuación va aumentando a medida que aumenta la concentración del crioprotector. Las mismas medidas fueron realizadas esta vez para las soluciones

30 de PBS y 1 M, 3M, 5M Y 7M de DMSO, obteniéndose la imagen que se muestra en la figura 4.

Una vez obtenidas las señales para cada concentración el siguiente paso consistió en obtener una curva de calibración que relacione estas señales con la concentración a la que corresponden. En la figura 5 se ha representado, para cada 35 una de las soluciones (PBS, 10%v/v, 20%v/v ... 80%v/v DMSO), la señal en

unidades de TAC (HU) frente al número de pixeles que tienen un determinado valor TAC. Cada pixel tiene un tamaño de 0.2xO.2xO.2 mm' . La figura 5 nos muestra, una vez más, de que las diferencias en las concentraciones pueden ser apreciadas con precisión adecuada.

La misma representación del número de píxeles con el mismo valor TAC se hace en la siguiente gráfica (figura 6) pero esta vez para tres medidas distintas de la misma solución (PBS). Esto demuestra la reproducibilidad de las medidas y la fiabilidad del método, ya que para las tres medidas las curvas obtienen unos valores similares.

En la figura 7 se obtiene la curva de calibración que representa la concentración molar de DMSO (M) frente al valor TAC obtenido por el micro-TAC (HU). Como se ve en la gráfica, la señal de lAG obtenida es proporcional a la concentración, como muestra su coeficiente de regresión (R2). Con esta gráfica podemos conocer la concentración de crioprotector en cada momento conociendo la señal de la medida TAC.

Medida de la concentración de DMSO en riñón.

Los pasos que se llevan a cabo para realizar este experimento son los siguientes

Se procede al llenado de un 20% v/v de DMSO del sistema de perfusión, es decir los tubos y el contenedor que contendrá el riñón (reactor). Se realiza la extracción del riñón del conejo. Se extrae toda la sangre del sistema vascular del riñón mediante perfusión con PBS a 4°C. Se introduce el riñón en un contenedor con PBS y se transporta en una nevera con hielo hasta el lugar del micro-TAC. Se introduce el riñón en el reactor. Se procede a la perfusión del riñón. Para ello se programa una perfusión lineal de 2 horas desde 20 %v/v DMSO hasta 70% v/v DMSO siempre a temperatura ambiente. Se realizan 3 medidas en el micro-TACo La primera al inicio de la perfusión, la segunda transcurrida una hora de perfusión, y la última al

final de la perfusión.

Los parámetros de adquisición de datos utilizados en el TAC fueron los siguientes:

1.: Fuente de rayos X: 65 kV

2.: 360 proyecciones alrededor de 3600

5 3. Resolución espacial: 200 micras

4. Tiempo de exposición: 1500 ms

Las imágenes obtenidas muestran claramente la medida de la concentración de crioprotector en el interior del riñón.

10 Ejemplo 2. Detección de hielo

Para los experimentos se introdujo una pieza de hielo, de dimensiones 2x2x2,5 cm 3, en un reactor con solución al 50% v/v de DMSO.

Los parámetros de adquisición de datos utilizados en el TAC fueron:

1.: Fuente de rayos X: 65 kV

2.: 360 proyecciones alrededor de 360°

3.: Resolución espacial: 200 micras

20 4. Tiempo de exposición: 1500 ms

El hielo aparece en un color amarillo verdoso mientras la solución aparece en un color rojizo, diferenciándose de forma clara. Esto nos permite detectar la formación de hielo durante el proceso de enfriamiento, y así crear un perfil adecuado de

25 temperatura en un tiempo que permita equilibrar nuestro órgano con la concentración adecuada para cada 1emperatura.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Monitorización de procesos de preservación en frío y criopreservación de

5

material biológico, caracterizado porque la presencia de hielo y la

concentración de dimetil sulfóxido como crioprotector son detectadas con

un micro-TACo

10

2. Monitorización de procesos de preservación en frío y criopreservación

según la reivindicación 1, basado en la medida de la pérdida de inlensidad

de rayos X a través de distintas direcciones en el objeto, por lo que el

factor de atenuación permite determinar la concentración de crioprotector

en el material biológico.

15
3.

Procedimiento de monitorización de procesos de preservación en frío y

criopreservaci6n según reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la

fuente de rayos X tiene un voltaje de aceleración bajo, desde 45 hasta 75

20

kV, usando preferentemente 65 o 75 kV, en el que se realizan 360

proyecciones de rayos X alrededor de 360°, con un tiempo de exposición

de entre 500 y 1500 ms y una resolución espacial de 200 micras, pudiendo

aumentarse la resolución hasta 100 Y 50 micras.

25
4.

Monitorización de procesos de preservación en frío y criopreservación de

material biológico, según las reivindicaciones 1, 2 Y 3, caracterizado por el

uso de dimetil sulfóxido como agente crioprotector.

30